Konstrukcija nove termostabilne himerične vakcine kandidata za genotip VII virus Newcastle bolesti

Abstract: Genotip VII Virus Newcastle bolesti (NDV) izazvao je pandemiju u mnogim zemljama i obično uzrokuje fatalne posljedice kod zaraženih pilića. Iako trenutne komercijalne atenuirane NDV vakcine mogu pružiti idealnu zaštitu od genotipa VII NDV, one ne mogu u potpunosti spriječiti infekciju i širenje virusa, a genotip nekih sojeva vakcine ne može odgovarati preovlađujućem soju. U ovoj studiji, kako bismo konstruirali termostabilnu živu atenuiranu vakcinu usklađenu sa genotipom VII, koristili smo termostabilni virulentni soj HR09 genotipa VIII kao okosnicu i zamijenili njegov F gen genotipom VII DT-2014 soja. U međuvremenu, mjesto cijepanja F gena DT-2014 je mutirano u ono kod proteina klase IF i avirulentnog proteina klase II F, respektivno. Rezultati su pokazali da dva himerna virusa, označena kao rcHR09-CI i rcHR09-CII, dijele sličnu kinetiku rasta i termostabilnost sa svojim roditeljskim sojem HR09. Testovi srednjeg vremena smrti (MDT) i indeksa intracerebralne patogenosti (ICPI) pokazali su da su dva himerna virusa bila visoko oslabljena. Iako bi i himerni NDV i soj vakcine La Sota mogli pružiti potpunu zaštitu imuniziranim kokošima od izazova virulentnog genotipa VII ZJ1 soja, dva himerna NDV-a mogu izazvati viši nivo odgovora antitijela na soj ZJ1 i mogu značajno smanjiti izlučivanje virusa u usporedbi s La Sota vakcinalni soj. U zaključku, naša studija je konstruisala dva himerična termostabilna genotip VII-podudarna NDV vakcina kandidata, koji su pružili potpunu zaštitu od izazova virulentnog genotipa VII NDV.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Ključne riječi: virus Newcastle bolesti; termostabilnost; himerni virus koji se podudara sa genotipom VII; F protein; efikasnost zaštite; izlivanje virusa

1. Uvod

Virus njukaslske bolesti (NDV), uzročnik njukaslske bolesti (ND), pripada rodu Orthoavulavirus u potfamiliji Avulavirinae iz porodice Paramyxoviridae [1]. NDV ima negativan smisao, jednolančani RNA genom, koji kodira nukleoprotein (N), fosfoprotein (P), matriksni protein (M), fuzioni protein (F), protein hemaglutinin-neuraminidaze (HN) i veliki protein (L ) [2]. Na osnovu evolucije NDV sojeva, NDV se može podijeliti u dvije klase: jedna su virusi klase I, sa veličinom genoma od 15.198 nukleotida; drugi su virusi klase II, sa veličinom genoma od 15.186 ili 15.192 [3]. Na osnovu svoje patogenosti, NDV je klasifikovan u tri patotipa: lentogeni, mezogeni i velogeni [4]. NDV se može klasifikovati u dve klase, jedna je klasa I NDV koja je uglavnom izolovana od divljih ptica i uvek je avirulentna za kokoške. Drugi je NDV klase II, koji je pronađen kod domaćih i divljih ptica, uključujući i virulentne i avirulentne sojeve [1,5,6]. F protein NDV se prvo sintetizira kao neaktivni prekursor, F0, koji se dalje cijepa na dvije aktivne F1 i F2 podjedinice putem ćelijske proteaze domaćina [7]. Aktivni F protein može posredovati u fuziji virusnih i ćelijskih membrana [8]. Istraživači su otkrili da je motiv mjesta cijepanja F proteina također pokazatelj virulencije NDV. Prijavljeno je da je soj virulencije za piliće pokazao motiv mjesta cijepanja od 112R/KR-QK/RR↓F 117, dok NDV niske virulencije imaju motiv 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 u istoj regiji. [9,10]. Stoga je promjena motiva mjesta cijepanja F proteina efikasan način da se ublaži virulentni NDV [11,12]. Uprkos svojoj važnoj ulozi u virulenciji NDV, F protein je takođe glavni doprinos zaštitnom imunitetu vakcina koje se podudaraju sa genotipom [13]. Termostabilna virusna vakcina može olakšati njeno skladištenje i transport, posebno za neke udaljene oblasti u kojima nije dostupan hladni lanac transporta. Ranije je prirodni termostabilni NDV soj, označen HR09, izolovan u našoj laboratoriji i mogao je ostati infektivan više od jednog sata pod tretmanom na 56 ◦C [14]. Nakon toga, korištenjem reverznog genetskog sistema, otkriveno je da su ostaci 315 i 369 u HN proteinu odgovorni za njegovu sposobnost otpornosti na toplinu [15]. Kako je HR09 virulentni soj, mutirali smo njegovo mjesto cijepanja F proteina sa 112RRQKR↓F 117 na avirulentni motiv 112GRQGR↓L 117 koristeći obrnuti genetski sistem i otkrili da rekombinantni virus rHR09 može pružiti potpunu zaštitu od izazova genotipa VII. NDV virulentni soj [16]. Štaviše, atenuirani HR09 je dalje korišćen kao vektor vakcine za ekspresiju HA gena podtipa virusa ptičjeg gripa H9N2 (AIV), koji je takođe pružio idealnu zaštitu od izazova H9N2 AIV [17]. U ovoj studiji, da bismo konstruirali termostabilnu NDV atenuiranu vakcinu sa genotipom VII, koristili smo termostabilni genotip VIII NDV virulentni HR09 soj kao okosnicu i zamijenili njegov F gen onim genotipa VII DT-2014 soja. U međuvremenu, mjesto cijepanja F gena DT-2014 je mutirano u mjesto cijepanja NDV F proteina klase I i avirulentnog NDV F proteina klase II, respektivno. Rezultati su pokazali da dva himerna virusa dijele sličnu kinetiku rasta i termostabilnost sa HR09. Osim toga, testovi srednjeg vremena smrti (MDT) i indeksa intracerebralne patogenosti (ICPI) pokazali su da dva himerna virusa pripadaju avirulentnom soju. Oba bi mogla izazvati visok nivo odgovora antitijela protiv sebe i genotipa VII ZJ1 soja kod imuniziranih pilića, mogla bi značajno smanjiti izlučivanje virusa i pružiti potpunu zaštitu od izazvanog sojem ZJ1. U zaključku, naša studija pruža dva himerična termostabilna kandidata za vakcinu za genotip VII NDV.

Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materijali i metode

2.1. Ćelije i virusi

BSR-T7/5 ćelije, selektivna ćelijska linija iz BHK ćelija koje mogu da eksprimiraju T7 RNA polimerazu, uzgajaju se sa Dulbeccovim modifikovanim Eagle medijumom (DMEM, Gibco) sa dodatkom 15% fetalnog goveđeg seruma (Pan Biotech, Nemačka) i 1% penicilin-streptomicin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, SAD) na 37 ◦C u inkubatoru sa 5% CO2. Kokošja jaja bez specifičnih patogena (SPF), koja se mogu koristiti za razmnožavanje NDV, kupljena su od Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. Termostabilni genotip VIII NDV HR09 soj (MF285077.1) i genotip ZJ1 nalaze se u našoj laboratoriji.

2.2. Plasmid Construction

Plazmid, označen kao pNDV/rHR09, konstruisan je kloniranjem sekvence genoma pune dužine genotipa VIII HR09 sa mutacijom u F proteinu u TVT7R (0.0) vektor [16]. F gen soja genotipa VII DT-2014, koji je imao veliku sličnost sa preovlađujućim sojevima genotipa VII NDV, je amplificiran, a mutacije njegovih mjesta cijepanja generirane su mutagenezom usmjerenom na mjesto. Zatim je F gen u pNDV/rHR09 zamijenjen mutiranim DT-2014 F genom. Sve sekvence prajmera korišćene u studiji dostupne su na zahtev.

2.3. Spašavanje rekombinantnog virusa

U ovoj studiji, dva himerična kandidata za NDV vakcinu su spašena kao što je prethodno opisano [18]. Glavne procedure su opisane u nastavku: prvo, NDV plazmidi pune dužine koji su sadržavali mjesta cijepanja mutiranog F gena NDV DT-2014, označenih kao pNDV/rcHR09-CI i pNDV/rcHR{{4} }CII, transficirani su sa tri pomoćna plazmida pCI-NP, pCI-P i pCI-L upotrebom Lipofectamine 3000 reagensa (Thermo Fisher Scientific, SAD) prema uputstvu proizvođača. Drugo, alantoične tekućine iz SPF-embrioniranih kokošjih jaja dodane su 12 h i 36 h nakon transfekcije, respektivno. Treće, cijeli ćelijski lizati su sakupljeni 72 h nakon transfekcije i stavljeni u tri puta zamrzavanje/odmrzavanje. Konačno, ćelijski lizati su ubrizgani u 10-dnevna SPF embrionirana kokošja jaja tokom 3-5 dana, a alantoične tekućine su sakupljene i podvrgnute HA testu za postojanje spašenih himernih NDV.

2.4. RT-PCR i QRT-PCR

RNK je ekstrahirana upotrebom TRIzol reagensa (Merck, Darmstadt, Njemačka) iz alantoične tekućine sakupljene iz inficiranih embrioniranih kokošjih jaja, a zatim reverzno transkribirana u cDNK korištenjem PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Peking, Peking). Puna dužina spašene sekvence NDV genoma je amplificirana korištenjem 10-parnih prajmera (dostupno na zahtjev). Nivoi izlučivanja virusa kvantificirani su apsolutnom kvantitativnom RT-PCR u realnom vremenu korištenjem instrumenta Life Technology. Ukratko, uzorci kloakalnog i trahealnog brisa su sakupljeni u 3- i 5- dana nakon izazivanja (dpc), zatim je RNA ekstrahirana, reverzno transkribirana na cDNK i podvrgnuta kvantitativnom PCR-u u realnom vremenu (QRT-PCR) za kvantifikaciju izlučivanja virusa. Količina izlučivanja virusa izračunata je kao srednja vrijednost ± SD nivoa mRNA svih sakupljenih briseva. Sekvence prajmera i sonde koje se koriste u otkrivanju izlučivanja virusa dostupne su na zahtev.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

2.5. Krivulja virusnog rasta

Kinetika rasta različitih NDV izmjerena je u 10-danima starim embrioniranim kokošjim jajima. Ukratko, NDV su razrijeđeni i ubrizgani u 10-dnevna embrionirana kokošja jaja alantoičnom inokulacijom. Alantoična tečnost je sakupljena u 24-, 48-, 72- i 96-h nakon infekcije. EID50 svakog uzorka izračunat je korištenjem Reed i Muench metode [19].

2.6. Test termostabilnosti

Termostabilnost svakog virusa je mjerena kao što je prethodno opisano [18]. Ukratko, svaki virus sa 108 EID50 titrom od 0,1 mL po bočici je podvrgnut vodenom kupatilu sa 56 ◦C, a zatim su uzorci sakupljeni na 10-, 20-, {{ 8}}, 40-,50- i 60-min nakon inkubacije. Konačno, titar virusa je mjeren metodom EID50.

2.7. Određivanje virulencije i stabilnosti

Virulencija svakog virusa je procijenjena primjenom testa srednjeg vremena smrti (MDT) u 10-dan SPF embrioniranim kokošjim jajima kao što je prethodno opisano [20,21]. Ukratko, sakupljena alantoična tečnost svakog himernog NDV soja je razrijeđena od 10−6 do 10−9 u 10-strukim serijama i ubrizgana u 10- dana stara SPF embrionirana kokošja jaja sa 5 po grupi inkubirana sa 100 L svakog razblaženja. Zatim su zaražena embrionisana kokošja jaja inkubirana na 37 ◦C i svećena ukupno 7 dana. Smrt svake grupe je zabilježena i izračunata je MDT vrijednost. Osim toga, ICPI test kod 1-dnevnih SPF pilića također je mjeren kako bi se provjerila virulencija himernog virusa. Ukratko, himerni virus je razrijeđen u 10-seriji puta koristeći PBS i ubrizgan u 1-dnevna SPF embrionirana kokošja jaja. Inkubirana jaja su svećena ukupno 8 dana i izračunata je ICPI vrednost. Da bi se procijenila stabilnost dva himerna NDV-a, oni su razmnoženi u 10-dnevnim SPF embrioniranim kokošjim jajima putem alantoične inokulacije za ukupno 20 pasaža, zatim su izmjerene MDT i ICPI vrijednosti odabranih pasaža.

2.8. Imunizacija pilića i izazov

Ukupno 48 8-dnevnih SPF pilića nasumično je podijeljeno u četiri grupe, a tri grupe su inokulirane sa 106 EID50 soja rcHR09-CI, rcHR09-CII i La Sota u 100 µL DMEM preko okulonazalnog puta, respektivno. Pilićima u kontrolnoj grupi ubrizgano je 100 µL DMEM. Serum imuniziranih pilića je sakupljen u 7-, 14- i 21 dan nakon imunizacije (dpi) za određivanje titra antitijela. Pri 21 dpi, pilići su izazvani sa 105 EID50 NDV genotipa VII ZJ1 soja okulonazalnim putem. Bris kloakalnog i orofaringealnog briseva prikupljeni su na 3- i 5-dnevnom post-challenge-u (dpc) radi daljeg otkrivanja širenja virusa. Klinički znaci i smrt su evidentirani svaki dan do 14 dpc.

2.9. Određivanje titra antitijela u serumu

Titar antitela protiv NDV meren je metodom inhibicije hemaglutinacije (HI) kao što je prethodno opisano [22].

2.10. Etička izjava

Imunizaciju i izazivanje pilića odobrio je Institucionalni komitet za njegu i korištenje životinja Univerziteta Yangzhou (br. YZUDWLL-201904-002; datum: 4. februar 2019.).

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

2.11. Statistička analiza

Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± standardne devijacije (SD), a dobiveni su iz tri ponavljanja. Statistička značajnost između različitih grupa analizirana je Studentovom metodom t-testa korišćenjem softvera GraphPad Prism 7.0 (La Jolla, CA, USA). (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001).

3. Rezultati

3.1. Šema za konstrukciju dva himerna NDV

Genotip VII NDV je rasprostranjen širom svijeta i često uzrokuje fatalne posljedice po kokoške i druge osjetljive ptice [23]. Prethodno smo izolovali termostabilni genotip VIII NDV HR09 soj, koji može održati infektivnost duže od 60 minuta kada se inkubira na 56 ◦C [14]. U ovoj studiji, da bismo stvorili termostabilnu atenuiranu vakcinu kandidata protiv NDV genotipa VII, koristili smo HR09 kao okosnicu i zamijenili F gen genom VII DT-2014 soja; u međuvremenu, mjesta cijepanja su mutirana od 112RRQRR↓F 117 do mjesta cijepanja proteina klase I NDV F 112ERQER↓L 117 i avirulentnog soja klase II NDV F proteinskih mjesta cijepanja 112GRQGR↓L plazmida pune dužine 117. HR09 genom sa mutiranim F proteinom označeni su kao prcHR09-CI i prcHR09-CII, respektivno (Slika 1).

Slika 1. Šematska strategija za konstrukciju dva himerna NDV. F gen termostabilnog soja HR09 genotipa VIII zamijenjen je mutiranim F genom genotipa VII DT-2014 soja.

3.2. Konstrukcija himernog NDV rcHR09-CΙ i rcHR09-CⅡ

Da bi se konstruirali himerni virusi, plazmidi prcHR09-CI ili prcHR09-CII su kotransficirani sa tri pomoćna plazmida, pCI-NP, pCI-P i pCI-L u BSR-T7/5 ćelije , koji može izraziti T7 RNA polimerazu. 72 h kasnije, cijeli ćelijski lizat je sakupljen i ubrizgan u 10-dnevna SPF embrionalna jajašca, a alantoične tekućine su sakupljene 4 dana nakon inkubacije. Da bi se provjerila mjesta cijepanja dva spašena himerna virusa, izveden je PCR eksperiment gena F i proizvodi su podvrgnuti sekvenciranju; rezultati su pokazali da su mjesta cijepanja uspješno mutirana u 112ERQER↓L 117 u rcHR09-CI (slika 2A) i 112GRQGR↓L 117 u rcHR09-CII (slika 2B), odvojeno. Konačno, genom pune dužine dva termostabilna himerna NDV je amplificiran korištenjem 10 parova prajmera, a rezultati su pokazali da rcHR09-CI (slika 2C) i rcHR09-CII (slika 2D) sadrže genom NDV pune dužine. Zajedno, ovi podaci su pokazali da su dva termostabilna himerna virusa uspješno konstruirana.

Slika 2. Konstrukcija i validacija himernih NDV rcHR09-CI i rcHR09-CII. Ukupna RNK spašenih virusa je ekstrahirana i reverzno transkribirana u cDNK, F gen rcHR09-CI (A) i rcHR09-CII (B) je amplificiran i postavljen na sekvenciranje. Puna dužina himernog NDV rcHR09-CI (C) i rcHR09-CII (D) je amplificirana korištenjem 10 parova prajmera, a S1–S10 su njihov prikaz.

3.3. Biološke karakteristike himernog NDV rcHR09-CI i rcHR09-CII

Da bi se provjerilo da li zamjena F gena utječe na replikaciju NDV-a, izvedena je kinetika rasta u 10-danima starim embrioniranim kokošjim jajima mjerenjem njihovog EID50. NDV su razrijeđene i inkubirane u 10-dnevnim embrioniranim kokošjim jajima, a alantoična tekućina je sakupljena u 24-, 48-, 72- i 96- h post-inkubacija. Rezultati EID50 su pokazali da i spašeni himerni rcHR09-CI i rcHR09-CII imaju sličnu kinetiku rasta sa svojim roditeljskim sojem HR09 (slika 3A), što je pokazalo da zamjena F gena nije imala efekta o replikaciji HR09.

Slika 3. Biološke karakteristike himernih NDV rcHR09-CI i rcHR09-CII. (A) Dva himerna NDV rcHR09-CI i rcHR09-CII imaju sličnu kinetiku rasta sa svojim majčinim sojem HR09. Krivulja rasta dva himerna virusa i njihovog soja HR09 izmjereni su metodom EID50 u 10-dnevnim SPF embrioniranim kokošjim jajima. (B) Dva himerna NDV rcHR09-CI i rcHR{{11}CII dijele termostabilnost sa HR09. Ukupno 108 EID50 sojeva NDV rcHR09-CI, rcHR09-CII, HR09 i La Sota inkubirano je na 56 ◦C za 10-, 20-, {{21 }}, 40-, 50- i 60-min, redom. Zatim su titri četiri NDV mjereni metodom EID50.

Kako je soj HR09 bio termostabilan NDV soj, takođe je istraženo da li je zamjena F proteina utjecala na njegovu termostabilnost. Svaki himerni virus i HR09 sa istim titrom virusa (108 EID5{{50}) tretirani su sa 10-, 20- , 30-, 40-, 50- i 60-min ispod 56 ◦C. Zatim je mjeren titar virusa izvođenjem EID50 testa. Rezultati su pokazali da su dva himerna virusa i njihov roditeljski soj HR09 mogli ostati infektivni duže od 60 minuta, dok je netermostabilni soj La Sota ostao infektivan ne više od 20 minuta (slika 3B). Ovi podaci pokazuju da su himerni virusi rcHR09-CI i rcHR{18}} CII još uvijek termostabilni. U ovoj studiji, F gen VIII HR09 zamijenjen je mutiranim F genom VII DT- 2014 da bi se dobila dva atenuirana himerna NDV. Da bi se procijenila virulencija himernih rcHR09-CI i rcHR09-CII, otkrivene su vrijednosti MDT i ICPI. Rezultati su pokazali da je MDT vrijednost za sva dva himerna NDV bila veća od 120 h. Kao kontrola, vrijednost MDT njihovog roditeljskog soja HR09 bila je 57,6 h. ICPI vrijednosti rcHR09-CI i rcHR09-CII bile su nula, kao kontrola, ICPI za HR09 je bio 1,8 (Tabela 1). Virulencija NDV na osnovu MDT vrednosti je klasifikovana u tri grupe: velogena (ispod 60 h), mezogena (60–90 h) i lentogena (više od 90 h). U međuvremenu, ICPI vrijednost je također uobičajeni kriterij za određivanje virulencije NDV: velogena (ispod 60 h), mezogena (60-90 h) i lentogena (više od 90 h): velogena (1,5-2,0), mezogena (0,7). –1,5) i lentogeni (0,0–0,7) [24]. Zajedno, ovi podaci pokazuju da su i spašeni himerni rcHR09-CI i rcHR09-CII bili visoko oslabljeni promjenom mjesta cijepanja F proteina.

Tabela 1. Procjena patogenosti i stabilnosti dva himerna NDV (ukupno 20 pasusa).

Osim toga, stabilnost dva himerična NDV je otkrivena inkubacijom za 20 pasaža u 10-dnevnim embrioniranim kokošjim jajima, a pasusi 10 i 20 su odabrani za mjerenje MDT i ICPI vrijednosti. Rezultati su pokazali da su MDT vrijednosti pasusa 10 i prolaza 20 bile veće od 120 h, a ICPI vrijednosti prolaza 10 i prolaza 20 bile su nule (tabela 1). Ovi podaci su pokazali da nakon 20 pasaža u 10-dnevnim embrioniranim kokošjim jajima, vrijednosti MDT i ICPI za dva himerna NDV nisu imale značajnu razliku, što je pokazalo da su dva spašena himerna NDV bila relativno stabilna.

3.4. Visok titar HI antitela je izazvan nakon imunizacije himernih NDV

Da bi se provjerilo može li imunizacija spašenih himernih NDV-a izazvati odgovor antitijela kod pilića, 48 8-dnevni SPF pilići podijeljeni su u četiri grupe. Različite grupe su inokulirane sa 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII, La Sota soja, odnosno 100 µL DMEM okulonazalnim putem. Serum imuniziranih pilića je sakupljen u 7-, 14- i 21 dan nakon imunizacije (dpi) za određivanje titra antitijela na HI. HI antitijelo prikupljenog seruma protiv imuniziranog NDV soja pokazalo je da nema značajne razlike između seruma rcHR09-CI, rcHR09-CII i La Sota u 7 dpi. Štaviše, s vremenom je titar antitijela HI rastao u serumu od 14 i 21 dpi, i nije bilo značajne razlike između tri grupe (Slika 4A)

Slika 4. Himerni virusi izazvali su visok nivo odgovora antitijela. SPF pilići su imunizirani sa 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII i komercijalnom vakcinom La Sota sojem kroz okulonazalnu rutu, respektivno. Serum je sakupljen u 1-, 2- i 3 sedmice nakon imunizacije, titar antitijela je mjeren korištenjem HI metode protiv njih samih (A) i unakrsnog titra HI antitijela protiv ZJ1 (B). (ns: nema značajne razlike; * p < 0,05; ** p < 0,01).

Pored toga, detektovan je unakrsno reaktivni titar HI antitela protiv soja ZJ1 kako bi se povisili efekti imunizacije himernih NDV protiv genotipa VII NDV. Rezultati su pokazali da nema značajne razlike između tri NDV imunizirane grupe u 7 dpi, a titar HI antitijela je rastao s vremenom. Za razliku od titra HI antitijela protiv imuniziranog soja, titri HI antitijela protiv ZJ1 soja rcHR09-CI- i rcHR09-CII imuniziranih grupa bili su značajno veći od grupe imunizirane La Sota vakcinom, i rcHR 09-CI grupa je izazvala najveći titar HI antitela među ove tri grupe (Slika 4B).

3.5. Izbacivanje virusa je smanjeno kada su imunizirani pilići bili izazvani virulentnim genotipom VII ZJ1 sojem

U ovoj studiji, imunizirani SPF pilići su izazvani genotipom VII ZJ1 sojem kako bi se procijenio zaštitni učinak himernih virusa protiv genotipa VII NDV. Pri 21 dpi, imunizirani pilići su izazvani sa 105 EID50 ZJ1 soja, a brisevi kloakalnog i orofaringealnog briseva od svih inficiranih pilića iz svake grupe su sakupljeni tokom 3- i 5- dana nakon izazivanja (dpc ) za otkrivanje širenja virusa. Rezultati su pokazali da bi imunizacija rcHR09-CI, rcHR09-CII i La Sota grupa mogla smanjiti izlučivanje virusa u brisevima kloake (Slika 5A, C) i orofaringealnim brisevima na {{11} } i 5-dpc (Slika 5B, D) u poređenju sa kontrolnom grupom. U poređenju sa La Sota grupom, izlučivanje virusa u dva himerna NDV-a bilo je značajno niže nego u La Sota imuniziranim grupama, što je pokazalo da su dva himerna NDV-a imala bolju zaštitnu efikasnost od La Sota soja protiv izazova genotipa VII NDV.

Slika 5. QRT-PCR kvantitacija izlučivanja NDV ZJ1 kod zaraženih pilića. Pilići su bili izazvani sa 1{{10}}6 EID50 NDV genotipa VII ZJ1 soja 21 dan nakon imunizacije. Uzorci kloakalnog brisa (A,C) i uzorci orofaringealnog brisa (B,D) su sakupljeni tokom 3- i 5- dana nakon izazova, a nivoi izlučivanja NDV ZJ virusa su kvantitativni putem QRT-a. PCR. Vrijednosti su prikazane kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (srednja vrijednost ± SD) u svakoj grupi. (ns: nema značajne razlike; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

3.6. Dva himerična NDV-a pružila su potpunu zaštitu od izazova genotipa VII ZJ1 soja

S obzirom da izazivanje genotipa VII ZJ1 soja može dovesti do smrtonosnih posljedica, osim otkrivanja izlučivanja virusa, uginuće zaraženih pilića je također evidentirano svaki dan do 14 dana. Rezultati su pokazali da su svi pilići u kontrolnoj grupi pokazali kliničke znakove duhovne depresije, respiratornog poremećaja, dijareje i uginuli su u 5- do 6-dpc, a nije bilo kliničkih znakova niti uginuća pilića u rcHR{ {4}}CI, rcHR09-CII i La Sota grupe do 14 dpc (Slika 6), što je pokazalo da svi himerni NDV i La Sota vakcinalni soj mogu pružiti potpunu zaštitu od izazova genotipa VII NDV.

Slika 6. Himerični NDV rcHR09-CI i rcHR09-CII pružaju potpunu zaštitu od izazova ZJ1. 3 sedmice nakon imunizacije, pilići su bili izazvani sa 106 EID50 ZJ1 sojeva. Status preživljavanja praćen je ukupno 14 dana.

4. Diskusija

Uprkos više vrsta vakcina protiv NDV koje se koriste u svijetu, ND se još uvijek javlja na mnogim mjestima u svijetu. Jedan od problema može biti da genotip vakcinalnog soja ne odgovara preovlađujućem soju. Ove vakcine neusklađene sa genotipom mogu pružiti određenu zaštitu od izazova virulentnih NDV; međutim, oni ne mogu zaštititi piliće od infekcije i ne mogu efikasno smanjiti izlučivanje virusa [25,26]. Genotip II klase VII NDV je glavni genotip rasprostranjen u regijama Bliskog istoka, Afrike i Azije; međutim, vakcine koje se koriste na ovim mjestima su obično genotip II La Sota i B1 sojevi, koji nisu isti genotip sa preovlađujućim sojevima [27–29]. U ovoj studiji, da bi se stvorio kandidat za vakcinu usklađenu sa termostabilnim genotipom VII, termostabilni soj genotipa VIII HR09 korišćen je kao okosnica, a konstruisana su dva himerna kandidata za vakcinu koja se podudara sa genotipom VII kako bi se ispunila potreba za vakcinom za genotip VII. Do sada je razvijeno više termostabilnih kandidata za NDV vakcinu. Prvi termostabilni NDV V4 izolovan je iz proventrikulusa pilića 1966. godine [30]. V4 je bio prirodni lentogeni soj, a rezultati filogenetske analize su pokazali da pripada genotipu II NDV. Za razliku od V4, termostabilni soj HR09 korišten u našem istraživanju pripadao je virulentnom soju [14]. Ako ga želimo staviti u kliničku upotrebu, prvo što treba učiniti je odrediti kako ga napraviti kao avirulentni soj. Zahvaljujući razvoju reverznog genetskog sistema, konstruisanje kandidata za NDV vakcinu usklađenih sa avirulentnim genotipom postiglo je značajan napredak. Kako je pokazano da je mjesto cijepanja F proteina glavna determinanta virulencije NDV [31], jednostavan način za generiranje atenuiranog NDV je zamjena mjesta cijepanja F proteina u virulentnom soju sa onim avirulentnog soja. U međuvremenu, objavljeno je da je F protein važan imunogenetski protein koji može inducirati neutralizacijsko antitijelo da zaštiti imunizirane kokoši od izazova virulentnog NDV [32–34]. Osim toga, objavljeno je da mjesto cijepanja NDV može utjecati na imuni odgovor kod imuniziranih pilića [11]. U ovoj studiji zamenili smo F gen termostabilnog HR09 sa F genom virulentnog DT-2014 soja NDV genotipa VII; u međuvremenu, mjesta cijepanja DT-2014 su također mutirana u ona avirulentnih NDV sojeva klase I i klase II, respektivno (Slika 1).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kao što se i očekivalo, rezultati određivanja virulencije su pokazali da su oba himerna termostabilna NDV visoko oslabljena (Tabela 1). U međuvremenu, također je pronađeno da su oba himerna NDV pokazala sličnu kinetiku rasta kao njihov roditeljski HR09 soj (slika 3A). Kako je HN protein bio glavni protein koji je bio odgovoran za termostabilnost HR09, dva himerna NDV su i dalje zadržala termostabilnost baš kao i njihov roditeljski soj HR09 (slika 3B). Više studija je objavilo da vakcina protiv genotipa NDV može izazvati viši nivo humoralnog imunog odgovora i da je efikasnija u smanjenju izbacivanja virusa od heterologne vakcine, uprkos tome što i vakcine koje se podudaraju sa genotipom i heterologne vakcine mogu zaštititi zaražene piliće od očiglednih kliničkih znakova i smrt [35–37]. U ovoj studiji, HI titar antitijela je mjeren na 7-, 14- i 21-dpi, rezultati titra antitijela protiv imuniziranog vlaka pokazali su da nema značajne razlike među rcHR{ {13}}CI, rcHR09-CII i La Sota sojevi (slika 4A), dok je HI antitijelo protiv genotipa VII ZJ1 soja pokazalo da su dva termostabilna himerna NDV inducirala značajno veći nivo od soja La Sota, i među sva tri imunizirana NDV, rcHR09-CI je inducirao najviši nivo HI antitijela (slika 4B). Ovaj rezultat je u skladu s prethodnim izvještajima da bi mjesto cijepanja F proteina moglo utjecati na imunološki odgovor kandidata za vakcinu kod pilića. Eksperiment sa izazovom genotipa VII ZJ1 pokazao je da su sve tri imunizirane grupe pokazale značajno smanjenje izlučivanja virusa u poređenju sa kontrolnom grupom, a dva himerna termostabilna NDV-a mogu smanjiti izlučivanje virusa efikasnije od La Sota soja (Slika 5). Kriva preživljavanja je pokazala da svi sojevi rcHR09-CI, rcHR09-CII i La Sota mogu pružiti potpunu zaštitu od izazova soja ZJ1 (slika 6). Kombinovani, ovi podaci su pokazali da dva himerna NDV-a koja se podudaraju sa genotipom VII, konstruisana u ovoj studiji, mogu da obezbede efikasnu zaštitu od izazova genotipa VII ZJ1 soja i mogu efikasnije da smanje izbacivanje virusa od La Sota soja. Ukratko, ova studija je konstruisala dva termostabilna himerna kandidata za NDV vakcinu, koji koriste termostabilni genotip VIII NDV virulentni HR09 soj kao okosnicu i zamenili su svoj F gen sa genotipom VII DT-2014 soja. U međuvremenu, mjesto cijepanja F proteina DT-2014 je mutirano sa 112RRQRR↓F 117 na 112ERQER↓L 117 i 112GRQGR↓L 117, respektivno. Dva himerna NDV-a čuvaju termostabilnost HR09, a testovi virulencije od strane MDT-a i ICPI-a pokazuju da su oni uspješno atenuirani. Oba himerna NDV-a mogu izazvati visok nivo odgovora antitijela, značajno smanjiti izlučivanje virusa i pružiti potpunu zaštitu od izazova virulentnog genotipa VII ZJ1 soja.

Reference

1. Dimitrov, KM; Abolnik, C.; Afonso, CL; Albina, E.; Bahl, J.; Berg, M.; Briand, FX; Brown, IH; Choi, KS; Chvala, I.; et al. Ažuriran jedinstveni sistem filogenetske klasifikacije i revidirana nomenklatura za virus Newcastle bolesti. Zaraziti. Genet. Evol. 2019, 74, 103917. [CrossRef] [PubMed]

2. de Leeuw, O.; Peeters, B. Kompletna nukleotidna sekvenca virusa Newcastle bolesti: Dokaz za postojanje novog roda unutar podfamilije Paramyxovirinae. J. Gen. Virol. 1999, 80 Pt 1, 131–136. [CrossRef]

3. Czeglédi, A.; Ujvári, D.; Somogyi, E.; Wehmann, E.; Werner, O.; Lomniczi, B. Treća kategorija veličine genoma ptičjeg paramiksovirusa serotip 1 (virus Newcastle bolesti) i evolucijske implikacije. Virus Res. 2006, 120, 36–48. [CrossRef]

4. Ganar, K.; Das, M.; Sinha, S.; Kumar, S. Virus Newcastle bolesti: Trenutni status i naše razumijevanje. Virus Res. 2014, 184, 71–81. [CrossRef]

5. Kabilov, MR; Alikina, TY; Yurchenko, KS; Glushchenko, AV; Gunbin, KV; Šestopalov, AM; Gubanova, NV Kompletne sekvence genoma dva soja virusa Newcastle bolesti izolovanih iz divlje patke i goluba u Rusiji. Genome Announc. 2016, 4, e{3}}. [CrossRef]

6. Ren, S.; Xie, X.; Wang, Y.; Tong, L.; Gao, X.; Jia, Y.; Wang, H.; Fan, M.; Zhang, S.; Xiao, S.; et al. Molekularna karakterizacija soja virusa Newcastle bolesti klase I izoliranog od goluba u Kini. Avian Pathol. 2016, 45, 408–417. [CrossRef]

7. Morrison, TG. Struktura i funkcija paramiksovirusnog fuzijskog proteina. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1614, 73–84. [CrossRef]

8. Bossart, KN; Fusco, DL; Broder, CC Paramyxovirus unos. Adv. Exp. Med. Biol. 2013, 790, 95–127. [CrossRef]

9. Collins, MS; Bashiruddin, JB; Alexander, DJ Zaključio je sekvence aminokiselina na mjestu cijepanja fuzionog proteina virusa Newcastle bolesti pokazujući varijacije u antigenosti i patogenosti. Arch. Virol. 1993, 128, 363–370. [CrossRef]

10. Panda, A.; Huang, Z.; Elankumaran, S.; Rockemann, DD; Samal, SK Uloga mjesta cijepanja fuzionog proteina u virulenciji virusa Newcastle bolesti. Microb. Patog. 2004, 36, 1–10. [CrossRef]

11. Kim, SH; Chen, Z.; Yoshida, A.; Paldurai, A.; Xiao, S.; Samal, SK Evaluacija sekvenci mjesta cijepanja fuzionog proteina virusa Newcastle bolesti u vakcinama koje odgovaraju genotipu. PLoS ONE 2017, 12, e0173965. [CrossRef] [PubMed]

12. Manoharan, VK; Varghese, BP; Paldurai, A.; Samal, SK Utjecaj sekvence mjesta cijepanja fuzionog proteina na generiranje vakcine protiv virusa njukaslske bolesti genotipa VII. PLOS ONE 2018, 13, e0197253. [CrossRef] [PubMed]

13. Kumar, S.; Nayak, B.; Collins, PL; Samal, SK Procjena F i HN proteina virusa Newcastle bolesti u zaštitnom imunitetu korištenjem rekombinantnog vektora ptičjeg paramiksovirusa tipa 3 kod pilića. J. Virol. 2011, 85, 6521–6534. [CrossRef] [PubMed]

14. Cao, Y.; Liu, Q.; Zhang, X.; Hu, H.; Wu, Y. Kompletna sekvenca genoma soja virusa Newcastle Disease otpornog na toplinu HR09. Genome Announc. 2017, 5, e{5}}. [CrossRef] [PubMed]

15. Ruan, B.; Zhang, X.; Zhang, C.; Du, P.; Meng, C.; Guo, M.; Wu, Y.; Cao, Y. Ostaci 315 i 369 u HN proteinu doprinose termostabilnosti virusa Newcastle bolesti. Front. Microbiol. 2020, 11, 560482. [CrossRef] [PubMed]

16. Ruan, B.; Liu, Q.; Chen, Y.; Niu, X.; Wang, X.; Zhang, C.; Guo, M.; Zhang, X.; Cao, Y.; Wu, Y. Generisanje i evaluacija kandidata za vakcinu atenuiranog i otpornog na toplotu genotipa VIII virusa Newcastle bolesti. Poult. Sci. 2020, 99, 3437–3444. [CrossRef]

17. Zhang, X.; Bo, Z.; Meng, C.; Chen, Y.; Zhang, C.; Cao, Y.; Wu, Y. Generacija i evaluacija rekombinantnog termostabilnog virusa Newcastle bolesti koji izražava HA virusa H9N2 ptičje gripe. Virusi 2021, 13, 1606. [CrossRef]

18. Wen, G.; Chen, C.; Guo, J.; Zhang, Z.; Shang, Y.; Shao, H.; Luo, Q.; Yang, J.; Wang, H.; Wang, H.; et al. Razvoj novog termostabilnog vektora vakcine protiv virusa Newcastle bolesti za ekspresiju heterolognog gena. J. Gen. Virol. 2015, 96, 1219–1228. [CrossRef]

19. LaBarre, DD; Lowy, RJ Poboljšanja u metodama za izračunavanje procjena titra virusa iz TCID50 i testova plaka. J. Virol. Metode 2001, 96, 107–126. [CrossRef]

20. Alexander, DJ Newcastle bolest i drugi paramiksovirusi ptica. Rev. Sci. Tech. Int. Isključeno. Epizoot. 2000, 19, 443–462. [CrossRef]

21. Yu, XH; Cheng, JL; Xue, J.; Jin, JH; Song, Y.; Zhao, J.; Zhang, GZ Uloge proteinskih gena povezanih s polimerazom u virulenciji virusa Newcastle bolesti. Front. Microbiol. 2017, 8, 161. [CrossRef] [PubMed]

22. Maamary, J.; Array, F.; Gao, Q.; García-Sastre, A.; Steinman, RM; Palese, P.; Nchinda, G. Virus Newcastle bolesti koji eksprimira HIV gag protein usmjeren na dendritske ćelije inducira snažan imuni odgovor specifičan za gag kod miševa. J. Virol. 2011, 85, 2235–2246. [CrossRef] [PubMed]

23. Bajram, AAM; Hussein, A.; Hasanin, O.; Elbakrey, RM; Daines, R.; Sadeyen, J.-R.; Abdien, HMF; Chzastek, K.; Iqbal, M. Prevalencija genotipa VII Newcastle bolesti u peradi i divljim pticama u Egiptu. Virusi 2022, 14, 2244. [CrossRef] [PubMed]

24. Hejazi, Z.; Tabatabaeizadeh, SE; Toroghi, R.; Farzin, H.; Saffarian, P. Prvo otkrivanje i karakterizacija podgenotipa XIII.2.1 Virus Newcastle bolesti izolovan iz pilića u dvorištu u Iranu. Vet. Med. Sci. 2022, 8, 2521–2531. [CrossRef] [PubMed]

25. Tsai, HJ; Chang, KH; Tseng, CH; mraz, KM; Manvell, RJ; Alexander, DJ Antigenska i genotipska karakterizacija virusa Newcastle bolesti izolovanih na Tajvanu između 1969. i 1996. Vet. Microbiol. 2004, 104, 19–30. [CrossRef]

26. Kapczynski, DR; King, DJ Zaštita pilića od očigledne kliničke bolesti i određivanje izlučivanja virusa nakon vakcinacije komercijalno dostupnim vakcinama protiv virusa Newcastle bolesti nakon izazivanja visoko virulentnog virusa iz kalifornijske egzotične epidemije Newcastle bolesti 2002. Vaccine 2005, 23, 3424–3433. [CrossRef] [PubMed]

27. Cho, SH; Kim, SJ; Kwon, HJ Genomska sekvenca antigenske varijante virusa Newcastle bolesti izolirane u Koreji. Virus Genes 2007, 35, 293–302. [CrossRef]

28. Khan, TA; Rue, CA; Rehmani, SF; Ahmed, A.; Vasilenko, JL; Miller, PJ; Afonso, CL Filogenetska i biološka karakterizacija izolata virusa Newcastle bolesti iz Pakistana. J. Clin. Microbiol. 2010, 48, 1892–1894. [CrossRef]

29. Liu, Y.; Sun, C.; Chi, M.; Wen, H.; Zhao, L.; Song, Y.; Liu, N.; Wang, Z. Genetička karakterizacija i filogenetska analiza virusa Newcastle bolesti iz Kine. Zaraziti. Genet. Evol. 2019, 75, 103958. [CrossRef]

30. Simmons, GC Izolacija virusa Newcastle bolesti u Queenslandu. Aust. Vet. J. 1967, 43, 29–30. [CrossRef]

31. Toyoda, T.; Sakaguchi, T.; Imai, K.; Inocencio, NM; Gotoh, B.; Hamaguchi, M.; Nagai, Y. Strukturno poređenje mjesta aktivacije cijepanja fuzijskog glikoproteina između virulentnih i avirulentnih sojeva virusa Newcastle bolesti. Virology 1987, 158, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

32. Ding, L.; Chen, P.; Bao, X.; Li, A.; Jiang, Y.; Hu, Y.; Ge, J.; Zhao, Y.; Wang, B.; Liu, J.; et al. Rekombinantni virusi pačjeg enteritisa koji eksprimiraju gen F virusa Newcastle bolesti (NDV) štite piliće od smrtonosnog izazivanja NDV. Vet. Microbiol. 2019, 232, 146–150. [CrossRef] [PubMed]

33. Jia, W.; Zhang, X.; Wang, H.; Teng, Q.; Xue, J.; Zhang, G. Konstrukcija i imunološka efikasnost rekombinantnog soja vakcine protiv herpesvirusa purana koji eksprimira fuzijski protein genotipa VII virusa Newcastle bolesti. Vet. Microbiol. 2022, 268, 109429. [CrossRef] [PubMed]

34. Shao, Y.; Sun, J.; Han, Z.; Liu, S. Rekombinantni virus infektivnog laringotraheitisa koji eksprimira protein F virusa Newcastle bolesti štiti piliće od virusa infektivnog laringotraheitisa i virusa Newcastle bolesti. Vakcina 2018, 36, 7975–7986. [CrossRef]

35. Miller, PJ; King, DJ; Afonso, CL; Suarez, DL Antigene razlike između sojeva virusa Newcastle bolesti različitih genotipova koji se koriste u formulaciji cjepiva utječu na izlučivanje virusa nakon virulentnog izazova. Vaccine 2007, 25, 7238–7246. [CrossRef]

36. Mohamed, MH; Abdelaziz, AM; Kumar, S.; Al-Habib, MA; Megahed, MM Utjecaj filogenetske raznolikosti izazova virusom velogene Newcastle bolesti na izlučivanje virusa nakon vakcinacije homologne i heterologne DNK kod pilića. Avian Pathol. 2016, 45, 228–234. [CrossRef]

37. Wajid, A.; Basharat, A.; Bibi, T.; Rehmani, SF Poređenje zaštite i izlučivanja virusa nakon vakcinacije sojevima virusa Newcastle bolesti različitih genotipova korištenih u formulaciji cjepiva. Trop. Anim. Health Prod. 2018, 50, 1645–1651. [CrossRef]