Analiza sastava i imunološke aktivnosti oligosaharida izolovanih iz Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Abstract.Oligosaharid (CDOS) je dobijen izCistanche deserticolaalkalnom (pH{{0}}) ekstrakcijom, taloženjem etanola i frakcionisanjem u dvije prečišćene frakcije (tj. CDOS-1 i CDOS-2) pomoću Sephadexa G-100 i filtraciona hromatografija na koloni Sephadex G-25. Sastav monosaharida CDOS-a je ispitan tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC). Utvrđeno je da se CDOS-1 sastoji samo od saharoze, a CDOS-2 se uglavnom sastoji od saharoze, ramnoze i manitola, sa molskim omjerom od 1:0,73:3,61. Imunološki testovi su pokazali da je CDOS pokazao značajan učinak na indeks slezene miša, povećavajući aktivnost fagocitoze makrofaga i stimulirajući proliferaciju stanica koje proizvode antitijela. Nadamo se da će se CDOS razviti u funkcionalnu hranu ili lijek.

Ključne riječi:Cistanchedeserticola, oligosaharid, prečišćavanje, sastav, imunološke aktivnosti.

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

1. Uvod

Cistanchedeserticola YCMa. (Porodica Orobanchaceae) je niska parazitska biljka porijeklom iz sjeverozapadne Kine. Cijela osušena biljka (bez cvjetova) poznata je kao tonik i naziva se "Rou Congrong". U orijentalnoj medicini svrstava se u slatke i slane okusa, tople prirode, a pripisuje se kanalima bubrega i debelog crijeva, sa funkcijaokrepljujućethebubregi dopunska esencija, vlaženje crijeva i opuštanje crijeva [1]-[3]. Moderna farmakološka studija pokazala je da može potaknuti sintezu DNK i odgoditi proces senilnosti, povećati antioksidativno djelovanje [4] , spriječiti i liječiti kardiovaskularne bolesti [3]. Osim toga, može uzrokovati i analgetik ianti-inflamatornoefekti [5], poboljšavaju učenje i pamćenje indukujući faktore rasta nerava [6]. Neka istraživanja su pokazala da ekstrakti C. deserticola mogu aktivirati fagocitnu funkciju intraabdominalnog makrofaga kod miševa [7]-[9] ipoboljšatitijelo's imunitet[10]. Prema prethodnim studijama, ova biljka sadrži više aktivnih sastojaka koji uključuju feniletanoidne glikozide, iridoide, lignane, saharide, alkaloid, itd. [11] Kao što je C.deserticolafeniletanoidglikozidia polisaharidi su prepoznati kao glavne aktivne komponente, brojne studije su se fokusirale na njihove strukture i bioaktivnosti tokom proteklih decenija [12]-[17]. Što se tiče vrijednih oligosaharida uC. deserticola, izvještaji su prilično ograničeni. Oligosaharidi, saharid kratkog lanca koji sadrži homo- ili hetero-šećere, dobro su poznati po svojim blagotvornim učincima na ljudski život i dugo se intenzivno koriste [18]. Funkcionalni oligosaharidi, koji imaju fiziološku funkciju kao što su niska kariogenost i faktor rasta bifidobakterija [19], poboljšavaju zdravlje ljudi i životinja. Korišćene su kao sastojak hrane. Nedavno su objavljene nove funkcije oligosaharida, koji imaju sposobnost modulacije imunološkog sistema kod ljudi, životinja i riba [20]. U ovom radu izvještavamo o prvom dijelu rezultata istraživačkog programa, frakcioniranju ukupnih oligosaharida dobijenih iz alkalnog ekstrakta C. deserticola kombinacijom ultrafiltracije i gel permeacijske hromatografije, i analizom njihovog sastava tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC). Pored toga, predstavljamo i imunološku aktivnost oligosaharida C. deserticola. Prema našim saznanjima, postoji nekoliko objavljenih izvještaja o studijama imunostimulacijske aktivnostiC. deserticolaoligosaharidi.

2. Eksperimentalno

2.1. Materijali

C. deserticola je uzgajana i sakupljena iz Alxa lige (Unutrašnja Mongolija, Kina). Kunming miševi (GradeII, stari šest sedmica) kupljeni su od Farmakološkog eksperimentalnog centra Univerziteta Unutrašnje Mongolije. Sephadex G-100,Sephadex G-25, trifluorosirćetna kiselina (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolon (PMP), D-glukoza, D- galaktoza, D-fruktoza, D-ksiloza, D-manoza, D-galakturonska kiselina, D-glukuronska kiselina, saharoza, ramnoza, manitol, fukoza, ramnoza, kupljeni su od Sigme (St. Louis, MO, SAD). Srednji RPMI-1640 je kupljen od Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, SAD). Sve ostale hemikalije su bile analitičke kvalitete.

2.2. Ekstrakcija oligosaharida

Osušena tijela C. deserticola su isječena na manje komade i dalje mljevena u prah u mlinu, ekstrahirana bezvodnim etanolom (3×5000 ml) na 70 stepeni 3 h pod atmosferskim pritiskom. Refluksni kondenzator je fiksiran za uklanjanje lipida. Ostatak je zatim ekstrahovan alkalijom (pH=10) na 60 stepeni 3 puta (svaki put po 2h). Nakon centrifugiranja (2000 g tokom 15 min, na 20 stepeni), supernatant je koncentrisan do jedne desetine zapremine u rotacionom isparivaču pod sniženim pritiskom na 50 stepeni i filtriran. Zatim je filtrat deproteiniziran pomoću Sevag reagensa [21] i debojiran aktivnim ugljenom.

2.3. Izolacija i prečišćavanje oligosaharida

Liofilizirani sirovi oligosaharidi su otopljeni u destilovanoj vodi, centrifugirani, a zatim je supernatant pročišćen pomoću Sephadex G-100 kolone (1×50 cm), ekvilibrisan sa ultra čistom vodom. Nakon punjenja uzorka, kolona je eluirana ultra čistom vodom pri brzini protoka od 5 ml/min. Uz pomoć epruveta sakupljene su različite frakcije. Ukupni sadržaj ugljikohidrata u svakoj epruveti mjeren je na 490 nm metodom fenol-H2SO4 [22]. Vodom eluiran rastvor je razdvojen na dvije frakcije CDOS-1 i CDOs-2. Dve frakcije su dalje prečišćene na Sephadex G-25 koloni (2,7×85 cm) korišćenjem ultra čiste vode (brzinom protoka od 1 ml/min). Nakon sakupljanja prečišćene frakcije, ona je liofilizirana.

2.4. Analiza sastava monosaharida

Sastav monosaharida CDO je postignut HPLC analizom. CDO (2 mg) su prvo hidrolizovani sa bezvodnim metanolom koji sadrži 2 M HCl na 80 stepeni tokom 16 sati u atmosferi azota, a zatim sa 2 M TFA na 120 stepeni tokom 1 h. Nakon što je TFA uklonjen isparavanjem, hidrolizati su potom derivatizovani sa PMP prema opisanoj metodi [23] i analizirani pomoću HPLC. HPLC separacija je izvršena na EF-2002 HPLC sistemu (kompanija KNAUER, Njemačka). Derivati ​​PMP-a su hromatografisani korišćenjem zapremine Sugar-PAK (6,5×300 mm, čaše vode kompanije, Amerika), a apsorbanca je izmerena na 245 nm. Zapremina ubrizgavanja bila je 20 µL, a mobilna faza, sastavljena od PBS (rastvarač A) i acetonitrila (rastvarač B), korištena je za izokratsko eluiranje u volumnom odnosu od 82 posto (A) prema 18 posto (B). Ukupno vreme rada HPLC-a bilo je 40 minuta, a brzina protoka je bila 0,5 mL/min.

2.5. Imunobiološke aktivnosti

2.5.1. Fagocitna funkcija monocita-makrofaga

Šezdeset Kunming miševa (GradeII, šest sedmica) kupljeno je od Farmakološkog eksperimentalnog centra Univerziteta Inner Mongolia i aklimatizirano je 1 sedmicu prije upotrebe. Svi miševi su nasumično podijeljeni u četiri grupe, koje se sastoje od kontrolne grupe fiziološkog rastvora, grupe sa visokim dozama CDO, grupe sa umerenom dozom i grupe sa niskim dozama CDO. Miševima je intraperitonealno ubrizgan 0.5mL rastvora oligosaharida jednom dnevno tokom 5 dana. Grupa sa visokim, umjerenim ili niskim dozama CDOs primila je 10{{10}}, 50, odnosno 25 mg/kg/BW CDO, respektivno; a kontrolnoj grupi je ubrizgano 0,5 ml fiziološkog rastvora. Sedmog dana proveden je eksperiment čišćenja ugljičnih čestica, prema Hou [24], i mjereni su indeks slezene i indeks timusa. Ukratko, 0,05 mL/10 g/tw indijske mastilo je ubrizgano svakom mišu kroz venu caudalis, a zatim je 20 μL krvi dobijeno iz vene orbitalis posterior 3 i 7 minuta nakon injekcije. Uzorci krvi su stavljeni u epruvete sa 2 mL 0,1 posto Na2CO3, a OD vrijednosti su izmjerene na 600 nm. Indeks klirensa (K), fagocitni indeks ( ) i indeks imunoloških organa izračunati su na sljedeći način (1), t2 i t1 znači 7 minuta, odnosno 3 minute.

2.5.2. Proliferacija ćelija koje proizvode antitijela

Grupe Kunming miševa (pet po grupi) su imunizirane intraperitonealnom injekcijom 2 x 107 SRBC u 1,0 ml PBS dodanog sa 50 ug test materijala (nijednog u kontroli). Nedelju dana kasnije, splenociti (106 ćelija po 2 ml po jažici) Kunming miševa su kultivisani sa ili bez test materijala tokom 72 h u 10% RPMI 1640 medijumu ispod 5% CO2 u vazduhu, u tri primerka za svaku kulturu. Određen je broj PFC u odnosu na SRBC na 106 splenocita [25], [26].

2.6. Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ±SD. Razlika između testiranih grupa i kontrolne grupe analizirana je Studentovim t-testom. P < 0.05="" se="" smatra="">

3. Rezultati i diskusija

3.1. Izolacija i prečišćavanje oligosaharida

CDO su izolovani iz alkalnog ekstrakta osušenih tijela C. deserticola sa prinosom od 3.07 posto. Dvije frakcije CDOS-1 i CDOS-2 izolovane su iz eluacije destilovane vode pomoću kolone Sephadex G-100 (Sl.1). Prečišćene frakcije CDOS-1 i CDOS-2 pokazale su jedan pik na koloni Sephadex G-25, što ukazuje da u uzorku nisu bili prisutni drugi oligosaharidi. Rezultati sastava monosaharida pokazali su da se CDOS-1 sastoji samo od saharoze (slika 2), a CDOS-2 uglavnom od saharoze, ramnoze i manitola (slika 3), sa molskim omjerom od 1:0,73:3,61.

3.2. Imunobiološke aktivnosti CDO

Mnogi in vivo i in vitro dokazi su pokazali da prirodni oligosaharidi pokazuju imunomodulacijsku funkciju stimulirajući i stanične i humoralneimun odgovore[27], [28]. U ovom radu, CDO od 100 mg/kg/BW povećava indeks slezene miša, ali nije bilo značajnih razlika u indeksu timusa između tretiranih grupa i kontrolnih grupa (Tabela 1). Makrofagi su važna komponenta odbrane domaćina od virusne infekcije tako što inhibiraju intracelularnu replikaciju virusa i ubijaju ćelije inficirane virusom [29]. Kada se aktiviraju, različiti kisik ili dušikovi intermedijeri i citokini se oslobađaju iz makrofaga i učestvuju u različitim važnim biološkim funkcijama, kao što su protuupalna i antitumorska aktivnost [30]-[32]. Stoga je fagocitna aktivnost makrofaga važan pokazatelj imunoloških funkcija organizma. U ovoj studiji, umjerene i visoke doze CDO povećavaju aktivnost fagocitoze makrofaga (Tabela 1). Proliferacija ćelija koje proizvode antitijela inducirana CDO proučavana je ispitivanjem povećanja hemolitičkog PFC u slezeni Kunming miševa koji su imunizirani SRBC plus test uzorkom. Rezultati su pokazali da umjerene i visoke doze CDO značajno povećavaju proliferaciju stanica koje proizvode antitijela (Tabela 2). Visoke doze CDO uzrokovale su visoko značajno povećanje broja PFC (P <>

Reference

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Prepoznavanje mješovitog biološkog signala na osnovu Wavelet analize. U: Y. Jiang, et al (ur.). Proc. radionice sportskog inženjerstva Ujedinjeno Kraljevstvo-Kina. Liverpool: Svjetska akademska unija. 2007, str. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Učinci rijetkih zemnih elemenata na rast stanica Cistanche deserticola i proizvodnju feniletanoidnih glikozida. JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian, et al. Novi prirodni proizvod iz Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioksidativno djelovanje glikozida Cistanchea u tkivu miševa. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRA Antinociceptivna i protuupalna aktivnost uzrokovana Cistanche deserticola kod glodara. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Moon, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MS Cistanches Herba poboljšava učenje i pamćenje izazivanjem faktora rasta nerava. Bihevioralno istraživanje mozga. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Poređenje između Cistanche deserticola YC Ma i C, tubulosa (Shenk) Wight o nekim farmakološkim djelovanjem. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ, et al. Studija o povećanju seksualne potencije C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL, et al. Poređenje težine Cistanche deserticola YC Ma i C.tubulosa na neke farmakološke akcije. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Imunomodulatorni efekti polisaharida Cistanche deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Napredak u istraživanju hemijskih sastojaka i medicinske aktivnosti Cistanchea. Kineski resursi divljih biljaka, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Izolacija i identifikacija feniletanoidnih glikozida iz Cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Određivanje feniletanoidnih glikozida u Cistanche deserticola makro retikularnom resinspektrofotometrijom. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Inhibicija dušikovog oksida feniletanoidima u aktiviranim makrofagima.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan, et al. Strukturna analiza polisaharida rastvorljivog u vodi SPA izolovanog iz stabljike Cistanche Deserticola Ma. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Studija o imunološkoj farmakologiji i karakteru apsorpcije polisaharida Cistanche deserticola. 2011, br.S1, Medicina i zdravstvene nauke, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektivna aktivnost feniletanoida iz Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Priručnik o amilazama i srodnim enzimima (urednik Japanskog istraživačkog društva amilaze), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (ur.) Proceedings of the 5th Conference on Dental Caries and Coupling Sugar (na japanskom), National Institute of Health, Tokyo (1980)

[20] Kodo Otaka. Funkcionalni oligosaharid i njegov novi aspekt kao imunološka modulacija. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polisaharidi iz ekstrakata vruće vode prženih zrna Coffea arabica: Izolacija i karakterizacija. Ugljikohidrati. Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrijska metoda za određivanje šećera i srodnih supstanci. Anal. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analiza monosaharidnih komponenti u polisaharidima Angelica pomoću tečne hromatografije visokih performansi. Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan, et al. Ekstrakcija i pročišćavanje lektina iz crvenog graha i preliminarne studije imunološke funkcije lektina i četiri kineska biljna polisaharida. Časopis za biomedicinu i biotehnologiju, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ, i A. Szenberg. Dalja poboljšanja tehnike plaka za otkrivanje pojedinačnih ćelija koje stvaraju antitijela. Imunology.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura, et al. Imunobiološke aktivnosti frakcije porina izolovane iz Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infekcije i imunitet. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Imunomodulacijska aktivnost CVT-E002: zaštićeni ekstrakt iz sjevernoameričkog ginsenga (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Strukture i odnosi strukture i aktivnosti tri mitogena i fiksiranje komplementa pektički arabinogalaktani iz malijskih biljaka protiv čira Cochlospermum tinctorium A. Rich i Vernonia kotschyana Sch Bip. ex Walp. Biomacromolecules. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim i J.-K. Hwang, Imunomodulacijska aktivnost arabinogalaktana i fukoidana in vitro. Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Procjena i poređenje imunoregulatorne aktivnosti četiri hidrosolubilne frakcije Angelica Sinensis in vitro na peritonealnim makrofagima kod ICR miševa. International Immunopharmacology. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Proinflamatorna ekspresija gena citokina i regulacija dušikovog oksida vodeno ekstrahiranog Astragali radiksa u RAW 264.7 ćelijama makrofaga. Časopis za etnofarmakologiju. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee i YJ Jeon. Polisaharid izolovan iz Poria cocos sclerotium indukuje aktivaciju NF-κB/Rel i ekspresiju iNOS u mišjim makrofagima. International Immunopharmacology. 2003, 3(10-11):1353–1362.