Poređenje između QPCR i RNA-seq otkriva izazove kvantifikacije HLA ekspresije 1. dio

Abstract

Lokusi humanog leukocitnog antigena (HLA) klase I i II bitni su elementi urođenog i stečenog imuniteta. Njihove funkcije uključuju prezentaciju antigena T stanicama koje dovode do ćelijskih i humoralnih imunih odgovora i modulaciju NK stanica. Njihov izuzetan utjecaj na ishode bolesti sada je jasno stavljen na uvid u studijama asocijacija na cijelom genomu. Egzoni koji kodiraju žljeb za vezivanje peptida bili su glavni fokus za određivanje HLA efekata na podložnost bolesti/patogenezu. Međutim, nivoi ekspresije HLA su takođe uključeni u ishode bolesti, dodajući još jednu dimenziju ekstremnoj raznolikosti HLA koja utiče na varijabilnost u imunološkim odgovorima među pojedincima.

Postoji bliska veza između antigena leukocita i imuniteta. Leukocitni antigen odnosi se na molekulu na površini ljudskih bijelih krvnih stanica, koja može identificirati i razlikovati različite tipove stanica i patogene. Važan je dio ljudskog imunološkog sistema i važan regulator imunološkog odgovora.

Razlike u antigenima leukocita mogu rezultirati različitim imunološkim odgovorima i podložnosti bolesti. Na primjer, određeni antigeni leukocita povezani su s autoimunim bolestima, zaraznim bolestima i tumorima. Ekspresija određenih leukocitnih antigena takođe je povezana sa funkcijom i količinom imunih ćelija.

Stoga je razumijevanje molekularnih karakteristika površine leukocita pojedinca od velikog značaja za procjenu imunološkog statusa pojedinca i rizika i prognoze bolesti. Istovremeno, pogoduje i formulisanju personalizovanog tretmana i preventivnih mera. Sa ove tačke gledišta, moramo poboljšati imunitet. Cistanche ima značajan uticaj na poboljšanje imuniteta. Cistanche je bogat raznim antioksidativnim supstancama, kao što su vitamin C i karotenoidi. Ovi sastojci mogu ukloniti slobodne radikale, smanjiti oksidativni stres i poboljšati otpornost imunološkog sistema.

Click cistanche tubulosa ekstrakt u prahu

Za procjenu ekspresije HLA, imunogenetičke studije se tradicionalno oslanjaju na kvantitativni PCR (qPCR). Usvajanje alternativnih tehnologija visoke propusnosti, kao što je RNA-seq, otežano je tehničkim problemima zbog ekstremnog polimorfizma HLA gena. Međutim, nedavno je razvijeno više bioinformatičkih metoda za preciznu procjenu ekspresije HLA iz RNA-seq podataka. Ovo otvara uzbudljivu priliku za kvantificiranje ekspresije HLA u velikim skupovima podataka, ali također dovodi do pitanja da li su rezultati RNA-seq uporedivi s onima pomoću qPCR-a. U ovoj studiji analiziramo tri klase podataka o ekspresiji za gene HLA klase I za odgovarajući skup pojedinaca: (a) RNA-sek, (b) qPCR i (c) ekspresija HLA-C na površini ćelije. Uočili smo umjerenu korelaciju između procjena ekspresije iz qPCR i RNA-seq za HLA-A, -B i -C ({{10}}.2 Manje ili jednako rho Manje ili jednako 0,53 ). Razgovaramo o tehničkim i biološkim faktorima koje treba uzeti u obzir kada se porede kvantifikacije za različite molekularne fenotipove ili koriste različite tehnike.

Ključne riječi

HLA · Ekspresija · PCR · RNA-sekv.

Uvod

Ekspresija gena pruža molekularni fenotip koji leži na srednjoj poziciji između genetske varijacije i kompleksnih fenotipova, kao što je status bolesti. Razumijevanje genetske osnove ekspresije gena može biti strateško za stvaranje veza između genetske varijacije i složenih fenotipova (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), uključujući osjetljivost na autoimune i zarazne bolesti. Iako je studija genetskih varijacija na lokusima humanog leukocitnog antigena (HLA), i općenito unutar regije glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), korištena za seciranje genetske osnove nekoliko složenih bolesti (Trowsdale i Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), uključivanje molekularnih fenotipova, posebno onih povezanih s ekspresijom gena, je relativno nedavno (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Ljudski MHC region na hromozomu 6p21 pokazuje visoku gustinu gena, sa jedinstvenim obrascima neravnoteže veze (LD) i ekstremnim polimorfizmom (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). MHC regija sadrži lokuse HLA klase I i II koji kodiraju molekule uključene u pokretanje i modulaciju imunološkog odgovora. Molekule HLA klase I eksprimiraju se u većini ćelija sa jezgrom i generalno predstavljaju intracelularne peptide u CD8 plus T ćelijama. Nasuprot tome, molekule HLA klase II prvenstveno eksprimiraju profesionalne ćelije koje predstavljaju antigen, a CD4 plus T ćelijama predstavljaju egzogene antigene koji su internalizirani endocitozom. Molekule klase I prepoznaju i receptori na prirodnim ćelijama ubojicama (NK), receptorima sličnim imunoglobulinu ćelije ubice (KIRs), što utiče i na obrazovanje i na aktivaciju NK ćelija (Colonna i Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Uparivanje različitih alotipova HLA klase I i specifičnih KIR molekula utiče na aktivnost NK ćelija (i podskupa CD8 plus T ćelija), što rezultira različitim rizicima od raka, zaraznih bolesti i autoimunosti (pregledano u Kulkarni et al. 2008).

Asocijacije na HLA bolesti prvenstveno su pripisane alel-specifičnim razlikama u prezentaciji antigena, zahvaljujući ekstenzivnim polimorfizama u žljebu za vezivanje peptida. Međutim, nivoi HLA ekspresije doprinose nekim uočenim vezama između HLA polimorfizama i ishoda bolesti. Nivo ekspresije HLA je važan modifikator autoimunosti i snage imunog odgovora na rak i infekcije posredovanog HLA (pregledano u René et al. 2016).

Postoji više primjera povezanosti između nivoa ekspresije HLA i ishoda virusne infekcije. Dobro je dokumentovano, na primjer, da su viši nivoi ekspresije HLA-C, i na nivou mRNA i na nivou proteina na površini ćelije, povezani sa boljom kontrolom HIV-a-1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. 2011; Apps i saradnici 2013; Parolini i saradnici 2018; Bachtel i saradnici 2018), dok je povišena ekspresija HLA-A povezana sa poremećenom kontrolom HIV-a (Ramsuran et al. 2018). SARS-CoV-2 infekcija smanjuje ekspresiju HLA-C gena (Loi et al. 2022) i ekspresiju HLA klase I na površini ćelije (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), kao i HLA klasu II ekspresija gena, uključujući HLA-DPA1, -DPB1, -DRA i -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Pored toga, postoje veze između nivoa ekspresije HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) i HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) sa klirensom HBV; Ekspresija HLA-DRA sa osjetljivošću na infekciju virusima gripe A slepih miševa u ljudskim ćelijskim linijama (Karakus et al. 2019); i ekstenzivne veze između regulatornih varijanti i nivoa ekspresije kod gena HLA klase II, uključujući HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 i -DRB5 sa odgovorom antitijela na višestruko preovlađujuće viruse (Kachuri et al. 2020).

Nivoi ekspresije HLA lokusa su takođe povezani sa autoimunitetom (vidi Johansson et al. 2022 za pregled). Nivoi ekspresije HLA-C na površini ćelije (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), kao i nivoi HLA-G na površini ćelije i u plazmi (da Costa Ferreira et al. 2021), su povezani sa rizikom od upalnih bolesti crijeva. Povećana ekspresija HLA-B27 na površini ćelije primećena je kod pacijenata sa ankilozirajućim spondilitisom (Cauli et al. 2002), kao i ukupna ekspresija HLA klase I među pacijentima sa Gravesovom bolešću (Weider et al. 2021). Nivoi ekspresije HLA klase II takođe utiču na rizik od autoimunih stanja.

Ekspresija gena HLA-DQA1 i -DRB1 i ekspresija DQ i DR molekula na površini ćelije povećana je u monocitima periferne krvi pacijenata s vitiligom (Cavalli et al. 2016); regulatorne varijante povezane sa višom ekspresijom gena HLA-DQA1, -DQB1 i -DRB1 i ekspresijom DQ i DR na površini ćelije povezane su sa rizikom od sistemskog eritematoznog lupusa (Raj et al. 2016); Ekspresija gena HLA-DRB5 je veća kod pacijenata sa sklerodermom sa intersticijskom bolešću pluća (Odani et al. 2012); specifični HLA-DRB1 aleli su visoko izraženi kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom (Houtman et al. 2021); i veća ekspresija DRB1*15:01 povezuje se sa rizikom od multiple skleroze (Alcina et al. 2012). Stoga će razumijevanje varijacije HLA ekspresije među pojedincima i mehanizama koji reguliraju nivoe ekspresije HLA biti ključno za otkrivanje genetske osnove fenotipova bolesti.

Tradicionalno, ekspresija HLA se procjenjuje tehnikama zasnovanim na antitijelima za nivoe ekspresije na površini ćelije (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) ili kvantitativnim PCR (qPCR ili RT-PCR) za nivoe transkripcije mRNA (Bettens et al. drugi 2014; Ramsuran i drugi 2015, 2017). Izazov je upoređivati ​​rezultate u različitim studijama ili čak upoređivati ​​različite HLA lokuse unutar iste studije jer se različite eksperimentalne procedure koriste za svaku analizu i za svaki HLA lokus, što može rezultirati različitim efikasnosti amplifikacije u qPCR-u ili afinitetima antitijela u protočnoj citometriji.

Tehnologije visoke propusnosti kao što je RNA-seq daju procjene ekspresije za sve gene u genomu, uključujući HLA gene, omogućavajući na taj način procjenu ekspresije HLA u kontekstu cijelog genoma. Međutim, ove tehnologije donose mnoge izazove kada se koriste za procjenu nivoa ekspresije HLA gena. Pored dobro dokumentovanih predrasuda povezanih sa RNA-seq testovima (npr. efekti serije, priprema biblioteke, GC sadržaj ('t Hoen et al. 2013), poteškoće u procjeni nivoa ekspresije za HLA gene rezultat su činjenice da je kvantifikacija uključuje usklađivanje kratkih čitanja sa referentnim genomom, koji ne pruža potpunu reprezentaciju HLA alelne raznolikosti.

Stoga, neka očitavanja možda neće biti usklađena zbog velikog broja razlika u vezi sa referentnim genomom (Brandt et al. 2015). Pored toga, HLA geni su dio porodice gena formirane nakon uzastopnih krugova duplikacija i često sadrže segmente koji su vrlo slični između paraloga, što rezultira unakrsnim poravnanjima između gena i pristrasnom kvantificiranjem nivoa ekspresije. Ove poteškoće motivirale su razvoj računskih cevovoda (vidjeti Johansson et al. 2022 za pregled) koji uzimaju u obzir poznatu HLA raznolikost u koraku poravnanja i za koje se pokazalo da pružaju precizne nivoe ekspresije za HLA gene (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus i dr. 2020; Darby et al. 2020).

Dok i RNA-seq i qPCR pristup procjenjuju ekspresiju HLA kvantificiranjem obilja transkripata, metode uključuju različite eksperimentalne i bioinformatičke procedure obrade. Koliko je nama poznato, kvantitativno poređenje rezultata RNA-seq sa onima dobijenim iz qPCR za HLA gene nije izvršeno. U ovoj studiji pokušali smo da uporedimo različite tehnike i molekularne fenotipove za kvantifikaciju ekspresije HLA klase I, imajući na umu da se nijedna tehnika ne može smatrati zlatnim standardom. Da bismo smanjili učinak tehničkih i bioloških varijacija u poređenju različitih studija, izvršili smo RNA-seq test na setu od 96 osoba za koje su bile dostupne procjene ekspresije qPCR (za HLA-A, -B, -C) i za podskup od kojih je ekspresija na površini ćelije zasnovana na HLA-C antitelima takođe bila dostupna. Kvantifikacija RNA-seq izvršena je pomoću HLA-krojenog cevovoda koji omogućava preciznu procjenu ekspresije, minimizirajući pristrasnost standardnih pristupa koji se oslanjaju na jedan referentni genom.

materijali i metode

Uzorci

Uzorci krvi su uzeti od 96 zdravih davalaca krvi uključenih u program dobrovoljnih davalaca u Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR). Od svih subjekata dobijen je pismeni informirani pristanak, a uzorci su anonimizirani prema procedurama Nacionalnog instituta za rak koje je odobrio IRB. RNK je ekstrahirana iz svježe izoliranih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) korištenjem RNeasy Universal kita (Qiagen). RNK je tretirana sa DNA-zom bez RNK-aze za uklanjanje genomske DNK. Ukupna RNK ekstrahirana iz PBMC-a je kvantificirana korištenjem HT RNA Lab Chip-a (Caliper, Life Sciences). Svi uzorci koji su pokazali kvalitet RNK veći od 8 korišteni su u analizama ekspresije gena.

HLA kucanje

HLA aleli su određeni Sangerovim sekvenciranjem. Osim toga, pokrenuli smo HLApers (Aguiar et al. 2019) i Kourami (Lee i Kingsford 2018) kako bismo zaključili alele HLA direktno iz RNAseq-a i provjerili da li se slažu sa pozivima zasnovanim na Sangerovom sekvenciranju. Ako uzmemo u obzir konzistentne pozive između HLApera i Kouramija, uočili smo samo 10 neslaganja sa Sangerovim pozivima od 288 poređenja (3 lokusa × 96 individua). Većina njih (n=5) je pokazala podršku od RNA-seq za alel koji je vrlo blizak onom određenom Sangerovim sekvenciranjem, tako da smo odlučili da zadržimo pozive zasnovane na RNA-seq. Za 3 genotipa opažamo homozigotne pozive iz RNA-sekvencije vjerovatno zato što jedan alel nije eksprimiran, a zadržali smo pozive iz Sangerovog sekvenciranja. Ovo ne utječe na procjenu ekspresije, budući da nema čitanja u skladu s alelom koji nije otkriven putem RNA-seq. Za jedan genotip, uočili smo dobru podršku za heterozigotni poziv, dok je Sangerova sekvenca nazvana homozigot. U tom slučaju zadržali smo poziv zasnovan na RNA-seq jer je bolje objasnio uočena očitavanja. Za jedan poziv alela, uzeli smo u obzir grešku poziva zasnovanih na RNA-seq zbog nedovoljne pokrivenosti čitanja.

Kvantitativni PCR (qPCR)

Nivoi transkripcije HLA mRNA za HLA-A, -B i -C mjereni su qPCR-om u testu koji osigurava nepristrasno pojačanje zajedničkih alela na svakom lokusu, dok se izbjegava amplifikacija svih ostalih lokusa. Korišteni prajmeri su: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Reverzna transkripcija je izvedena korištenjem kompleta RNA-to-cDNA visokog kapaciteta (Applied Biosystems). Amplifikacija HLA i cDNK mikroglobulina 2 mikroglobulina (B2M) gena za domaćinstvo izvedena je korištenjem Power SYBR zelene master mješavine (Applied Biosystems), na ABI 7900HT mašini. Prajmer sekvence za B2M su opisane u tabeli S4 Kulkarni et al. (2013). Prosječni nivo ekspresije svakog HLA gena je normaliziran na nivo B2M i izračunat korištenjem 2-∆∆Ct metode (gdje je Ct ciklus praga).

Prosječni alel-specifični nivoi ekspresije uobičajenih HLA alela procijenjeni su linearnim modelom kako je opisano u Ramsuran et al. (2015). Konkretno, modelirali smo ekspresiju kao linearnu funkciju dva alela koje nosi svaki pojedinac i izdvojili efekte svakog alela na ekspresiju gena. Ovaj korak smo izvršili u R (pogledajte odjeljak Dostupnost koda).

Površinski izraz

Ekspresija na površini HLA-C ćelija je merena na CD3 plus ćelijama iz sveže izolovanih PBMC protočnom citometrijom korišćenjem HLA-C-specifičnog monoklonskog antitela DT9 (Apps et al. 2013). Za HLA-A analizu u podskupini osoba koje nose A*03 i A*11, obojene smo ćelije antitelom 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-sekv

Priprema RNK

RNA-seq je izveden na RNK pohranjenoj na -80 stepeni. Ukupna RNK je kvantifikovana pomoću Qubit RNA HS testa (Thermo Fisher). Kvalitet RNK je procijenjen korištenjem 2100 Bioanalyzer instrumenta i Agilent 6000 RNA Pico kompleta (Agilent Technologies). Za svaki uzorak, 500 ng ukupne RNK korišćeno je kao ulaz za pripremu biblioteka sa osiromašenim rRNK transkriptoma. Biblioteka povezana sa adapterom pripremljena je sa KAPA HyperPrep kompletom (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) koristeći Bioo Scientific NEXTfex™ DNK Barcoded adaptere (BioScientifc, Austin, TX, SAD) prema protokolu koji je obezbedio KAPA.

Deplecija rRNA pomoću RiboErase

Ribosomalna RNK je iscrpljena inkubacijom ukupne RNK sa sondama komplementarnim sekvencama rRNA. Nakon hibridizacije, RNaza H je korištena za enzimsku razgradnju rRNA. Čišćenje i digestija DNase izvedeni su korištenjem Kapa Pure Beads i DNase prema Kapa protokolu.

Fragmentacija, sinteza cDNK i konstrukcija biblioteke

Uzorci osiromašeni rRNA su fragmentirani na 85 stepeni tokom 4,5 min u prisustvu magnezijuma pre sinteze 1. i 2. lanca i A-Tailing reakcija. NEXTfex DNK bar kodirani adapteri (1,5 uM) su vezani za cDNK sa A-repom sa jedinstvenim bar kodom za svaki uzorak. Proizvodi su pročišćeni Kapa Pure Beads i izvedeno je 8 ciklusa bibliotečke amplifikacije. Nakon amplifikacije, izvršeno je konačno čišćenje biblioteke, a kvantifikacija biblioteke i QC procijenjeni su korištenjem Qubit DNK HS testa (Thermo Fisher) i Agilent DNA HS kita na 2100 Bioanalyzer instrumentu.

Sekvenciranje

Rezultirajuće multipleksirane biblioteke sekvenciranja korišćene su u formiranju klastera na Illumina cBOT (Illumina, San Diego, Kalifornija, SAD), a sekvenciranje je izvedeno korišćenjem Illumina HiSeq 2500 prema protokolima koje je obezbedila Illumina za sekvenciranje parom od 2×126 bp. Svaki transkriptom je sekvencioniran do ciljane dubine od 40-50 miliona čitanja.

RNA-seq na svježim uzorcima od 11 osoba

Da bismo istražili mogućnost degradacije uzorka materijala pohranjenog na -80 stepeni prije sekvenciranja RNK, potencijalnog izvora neslaganja sa qPCR procjenama, ponovo smo izvukli krv od 11 donora i izvršili RNA-seq na novim uzorcima. Eksperiment je izveden sa istom pripremom biblioteke i metodama kao i ranije, ali sekvencioniran korišćenjem Illumina NextSeq sa 2×150 pb čitanja.

Kvantifikacija ekspresije za RNA-sekv

Referentni transkriptom

Koristili smo Salmona (Patro et al. 2017) za procjenu nivoa ekspresije za sve transkripte označene u bazi podataka Gencode v37. Koristili smo sve opcije za korekciju pristranosti na Salmonu (GC pristranost, poziciona pristranost i pristranost specifična za sekvencu).

Personalizovano

Isto kao i "Ref transkriptom", ali sa personalizovanim HLA transkriptima prema HLA-A, -B i -C genotipovima koje nosi svaki pojedinac. Personalizacija je izvršena poravnavanjem sekvence za HLA alel referentnog genoma sa genomom kako bi se dobile koordinate. Zatim, korištenjem višesekvencnog poravnanja alela prisutnog na referentnom genomu sa svim ostalim alelima (dostupno od IPD-IMGT/HLA izdanja 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), pripisali smo genomski pozicije za sve HLA alele. Konačno, konstruisali smo personalizovani transkript zasnovan na kombinaciji informacija o koordinatama transkripta i sekvenci HLA alela. Ova procedura je provedena u R (R Core Team 2020), koristeći paket Biostrings (Pagès et al. 2020) i tidyverse meta paket (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com