Cistanozid A posreduje na putu P38/MAPK za inhibiciju aktivnosti osteoklasta

Abstract

POZADINA:Cistanozid Aimaefekata protiv upale, antioksidacija,smanjenje oštećenja bubrega i anti-osteoporoza, ali njegov uticaj nadiferencijacija osteoklasta, funkcija i osnovni molekularni mehanizmi ostaju nejasni. CILJ: Istražiti učinakCistanozid Aonosteoklastdiferencijaciju iresorpcija kostijuinduciran aktivatorom receptora nuklearnog faktora kapa-B liganda (RANKL) in vitro i njegovim mehanizmom.

METODE: Makrofagi koštane srži su dobijeni iz femura i tibije 4-6-nedjeljnih C57BL/6 miševa. Citotoksični efekat Cistanozida A (5, 10, 20, 40, 80 i 160 μmol/L) na vitalnost makrofaga koštane srži ispitan je korištenjem kompleta za brojanje ćelija-8 kompleta za analizu. Bojenje kiselom fosfatazom otpornom na tartrat je izvršeno kako bi se uočio učinak različitih koncentracijaCistanozid Ana diferencijaciju osteoblasta i utvrđena je njegova efektivna interventna koncentracija. Postojala je pozitivna kontrolna grupa, grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama cistanozida A (40, 80 i 160 μmol/L). Nakon vezivanja ćelije, dodato je 50 ng/mL RANKL da bi se izazvala diferencijacija osteoblasta, a odgovarajuća doza Cistanozida A je dodana grupama niske, srednje i visoke doze Cistanozida A. F-aktinski prsten i 2-(4-amidinofenil)-6-indolkarbamidin dihidroklorid bojenje su obavljeni da bi se otkrioefekti cistanozida Anaformiranje osteoklasta. Bojenje abrazijskih rezova kostiju toluidin plavo korišteno je da se promatraju efekti cistanozida A na funkciju resorpcije kostiju osteoklasta. Ekspresija uzvodnih i nizvodnih proteina JNK/MAPK puta otkrivena je Western blotom. Ekspresija gena vezanih za diferencijaciju osteoklasta i funkciju resorpcije kostiju, kao što je kisela fosfataza otporna na tartrat, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk i c-Fos, otkrivena je pomoću RTqPCR. REZULTATI I ZAKLJUČAK: Bojenje kiselom fosfatazom otporno na tartrat, bojenje F-aktinskim prstenom i test resorpcionih jamica su pokazali da je Cistanozid A značajnoinhibirao RANKL-indukovanu diferencijaciju osteoklastairesorpcija kostijuna način ovisan o dozi u poređenju sa pozitivnom kontrolnom grupom. Rezultati RT-qPCR pokazali su da u poređenju sa pozitivnom kontrolnom grupom, i grupe sa visokim i niskim dozama cistanozida A mogu značajno smanjiti ekspresiju mRNA kisele fosfataze otporne na tartrat, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk i c-Fos na način ovisan o dozi. Rezultati western blot testa su pokazali da je grupa sa visokom dozom Cistanoside A značajno inhibirala ekspresiju p-JNK proteina na 10, 20, 30 i 60 minuta intervencije; u poređenju sa pozitivnom kontrolnom grupom, Cistanozid A je značajno inhibirao ekspresiju Nfatc1 i c-Fos proteina na način ovisan o dozi. Da zaključimo, Cistanozid A bi mogao inhibirati formiranje i resorpciju kostiju osteoklasta smanjenjem nivoa p-JNK proteina, inhibirajući aktivaciju MAPK puta i ekspresiju ključnih gena u osteoklastima.

Ključne riječi: Cistanozid A; osteoklast; MAPK; JNK; RANKL; RANK;osteoporoza; feniletanoidni glikozidi

CISTANCHE DA RADI NA INHIBIRANJU AKTIVNOSTI OSTEOKLASTA

0 Uvod Uvod

Epidemiološke studije su pokazale da kako globalna populacija raste i stari, učestalost osteolitičkih bolesti kao što su osteoporoza i osteoartritis će se dalje povećavati [1]. Sadašnja istraživanja pokazuju da će u patogenezi osteolitičkih bolesti neravnoteža resorpcije kostiju i rekonstrukcije kosti uzrokovana prekomjernom aktivacijom funkcije osteoklasta dovesti do značajnog smanjenja koštanog volumena, gustine kostiju i mikrostrukture kosti. Štetno propadanje, dovodi do povećane krhkosti kostiju i povećanog rizika od prijeloma [2-3]. Stoga su osteoklasti glavna ćelijska meta za identifikaciju i razvoj efikasnih sredstava za liječenje osteoporoze. Međutim, trenutno često korišteni lijekovi koji inhibiraju osteoklaste kao što su denosumab (anti-RANKL antitijelo), bisfosfonati, itd., imaju nuspojave kao što su nefrotoksičnost, osteonekroza, rizik od karcinoma endometrija i osteonekroza vilice [4-5]. Stoga je od velikog kliničkog značaja pronaći nove lijekove koji mogu inhibirati aktivnost osteoklasta.

Funkciju diferencijacije i resorpcije kostiju osteoklasta uglavnom regulišu dva signalna molekula, faktor koji stimuliše kolonije makrofaga i receptorski aktivator liganda nuklearnog faktora κB (RANKL) [6]. Receptor faktora 1 koji stimulira kolonije (c-fms) na ćelijskoj membrani prekursora osteoklasta vezuje se za faktor stimulacije kolonije makrofaga i potiče ekspresiju aktivatora receptora nuklearnog faktora kapa B (RANK). Vezivanje RANKL i RANK na površini ćelije aktivira faktore transkripcije kao što su nuklearni faktor κB, JNK, p38 i JNK, koji zauzvrat aktivira faktor transkripcije c-Fos, nuklearni faktor aktiviranih T ćelija c1 (Nfatc1), itd. u nukleus, aktivirajući uništavanje stanica prekursora kostiju, formiraju višejezgrene ćelije i na kraju se diferenciraju u osteoklaste [7-9].

Cistanche deserticolajedan je od najčešće korištenih kineskih medicinskih materijala u kliničkoj praksi. To je osušena mesnata stabljika s ljuskavim listovima Cistanche deserticola ili Cistanche tuberosum biljke Orobanchiaceae [10]. Tradicionalna medicina smatra da je cistanche deserticola tople prirode, slatkog i slanog ukusa, te da se vraća u meridijane bubrega i debelog crijeva. Ima efekte hranjenja janga bubrega, obnavljanja esencije i krvi, hidratacije crijeva i laksativa, a koristi se za liječenje impotencije, neplodnosti, mišića i kostiju uzrokovanih nedostatkom janga bubrega i esencije i krvi. Bolesti poput slabosti u skladu su s toničkim metodama liječenja jetre i bubrega koje se koriste u tradicionalnoj medicini za liječenje osteolitičkih bolesti. Farmakološke studije su pokazale da su glavni aktivni sastojak Cistanche deserticola feniletanoidni glikozidi, koji imaju dobru sigurnost i opsežne medicinske funkcije [11]. Cistanozid A (molekularna formula: C36H48O20) je prirodni feniletanol glikozidni spoj izolovan i pročišćen iz tradicionalne kineske medicine Cistanche deserticola. Ima protuupalno, antioksidativno i antitumorsko djelovanje [12-14]. Studije su pokazale da Cistanche deserticola A može smanjiti nivoe c-Fos u primarnim ćelijama miševa sa akutnim oštećenjem jetre izazvanim etanolom [15]. Druge studije su pokazale da Cistanche A može poboljšati strukturne parametre trabekularne kosti kod osteoporotičnih miševa sa ovariektomijom putem puta faktora 6 (TRAF6) povezanog sa RANKL/TNF receptorom [16]. Međutim, nedostaju daljnja istraživanja o učinku Cistancheside A na diferencijaciju osteoklasta i potencijalne molekularne mehanizme. Ova studija ima za cilj istražiti učinak cistanhezida A na diferencijaciju osteoklasta i funkciju resorpcije kosti in vitro i potencijalne molekularne mehanizme, kako bi se otkrili novi potencijalni lijekovi za inhibiciju osteoklastične diferencijacije.

1 Materijali i metode Materijali i metode

1.1 Dizajn

Za in vitro ćelijske eksperimente, t-test i jednosmjerna ANOVA provedeni su.

1.2 Vrijeme i mjesto

Završeno od decembra 2022. do decembra 2023. u Laboratoriji za popravku povreda kostiju i mekih tkiva Druge bolnice Medicinskog univerziteta Shanxi.

1.3 Materijali

1.3.1 Pokusne životinje

SPF stepen 4-sedmično stari C57BL/6 miševi, mužjaci ili ženke, kupljeni su od Centra za eksperimentalne životinje Medicinskog univerziteta Shanxi, broj licence za proizvodnju: SCXK (Jin) 2019-0004. Eksperimentalni miševi su držani u standardnom okruženju: sobna temperatura 26 stepeni, vlažnost oko 55%, izloženost svjetlu 12 sati dnevno, slobodno kretanje i samostalno jelo. Eksperimentalni protokol je odobren od strane Eksperimentalnog odbora za dobrobit životinja i etiku Druge bolnice Medicinskog univerziteta Shanxi (br. odobrenja: DW2023031).

1.3.2 Reagensi i lijekovi

Cistancheside A (čistoća 98%, CAS 93236-42-1) je kupljen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; fetalni goveđi serum i visokoglukozni MEM medijum za kulturu kupljeni su od kompanije HyClone iz Sjedinjenih Država; tripsin-EDTA rastvor za varenje 0.25%, rastvor za lizu crvenih krvnih zrnaca, 1×PBS, mešavina penicilina i streptomicina (×100), rastvor za bojenje toluidin plavo (1/100, boratna metoda), faloidin obeležen rodaminom prsten

Peptid (kat. br. CA1610) i DAPI boja (spremna za upotrebu) kupljeni su od Beijing Solebao Technology Co., Ltd., a mišji rekombinantni faktor stimulacije kolonije makrofaga i mišji rekombinantni faktor nekroze tumora ligand superfamilije RANKL su kupljeni od Peking Ze Xiyuan Biotechnology Co., Ltd.; CCK-8 komplet je kupljen od kompanije MCE iz Sjedinjenih Država, komplet za bojenje kiselom fosfatazom otpornom na tartart (TRAP) je kupljen od kompanije Sigma-Aldrich iz Sjedinjenih Država, RNAiso Plus, reagensi za reverznu transkripciju tipa Premix, TB Green® Brzi qPCR miks,

Prime Script TM RT Master Mix i Trizol su kupljeni od kompanije Takara u Sjedinjenim Državama; transmembranski protein specifičan za dendritične ćelije (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 specifični PCR prajmeri su kupljeni od Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; -aktinsko antitelo, c-Fos antitelo, Nfatc1 antitelo, JNK antitelo i p-JNK antitelo, m-IgG Fc BP-HRP kupljeni su od Santa Cruza, SAD.

Biotechnology Corporation.

1.4.6 Eksperiment resorpcije kosti za testiranje kapaciteta resorpcije kosti osteoklasta

Makrofagi koštane srži su posađeni u 96-ploču sa sterilizovanim kriškama goveđe kosti unapred postavljenim pri gustini od 7×103/bunariću. 100 μL podloge za kulturu dodano je u svaku jažicu i podijeljeno u pozitivnu kontrolnu grupu i Cistanche A niske doze. grupa (40 μmol/L) i grupa sa visokim dozama Cistancheside A (160 μmol/L), svaka grupa je opremljena sa 5 višestrukih rupa, od kojih su 3 višestruke rupe postavljene na kriške goveđe kosti, a druge 2 višestruke rupe su korištene za posmatranje ekspresije makrofaga koštane srži. Formiranje adheziva i osteoklasta. Nakon što su ćelije prianjale, pozitivna kontrolna grupa i cistanci

RANKL od 50 ng/mL je dodan svim grupama kako bi se inducirala diferencijacija osteoklasta. Grupama sa niskim i visokim dozama cistanhezida A dodavano je 40 μmol/L ili 160 μmol/L Cistancheside A za intervenciju, a podloga je menjana svakih 48 h. Nakon kultivacije u trajanju od 14 dana, izvadite kriške goveđe kosti, operite ih dva puta sa PBS-om, dodajte 70% izopropil alkohol i ultrazvučno čišćenje velike snage 15 minuta da se isperu preostale ćelije, dodajte toluidin plavo (1%, otopljeno). u vodi) otopinu boje i obojite na sobnoj temperaturi 2 sekunde. Nakon 1 minute, isperite fragmente kosti dvostruko destilovanom vodom da biste uklonili ostatke boje. Obojene koštane kriške su promatrane i fotografirane pomoću stereomikroskopa, a površina koštanih resorpcijskih lakuna je izbrojana pomoću softvera Image J.

1.4.7 RT-PCR

Da bi se otkrila funkcija intracelularne resorpcije kosti i ekspresija gena povezanih s osteoklastima, makrofagi koštane srži su zasijani u ploču 6-jažica pri 1,5×105/jažici, a u svaku jažicu je dodato 100 μL medija za kulturu, i podijeljeni u pozitivnu kontrolnu grupu, grupu s niskim dozama Cistanche A (40 μmol/L) i grupu s visokim dozama Cistancheside A (160 μmol/L). I pozitivna kontrolna grupa i grupa Cistancheside A su dodane sa 50 ng/mL RANKL induktora.

Da bi se inducirala diferencijacija osteoklasta, 40 μmol/L ili 160 μmol/L Cistancheside A je dodano u niske i visoke doze Cistancheside A grupa za intervenciju. Podloga se mijenjala svakih 48 sati. Posmatranje je obavljeno pod invertnim mikroskopom tri ili četiri dana nakon indukcije. Pod mikroskopom je uočeno da su se makrofagi koštane srži upravo spojili. Dodajte TRIzol ćelijama za lizu, dodajte hloroform, stavite na led 10 minuta i aspirirajte smjesu

U 1,5 mL EP epruvete, dodajte 200 μL hloroforma u svaku epruvetu, mućkajte 15 s, zatim ostavite da stoji na ledu 15 min, centrifugirajte na 4 stepena, 12 000 r/min 10 min, uzmite supernatant, dodajte jednaku količinu izopropil alkohola i stavite na led. Ostavite da odstoji 10 minuta, bacite supernatant, centrifugirajte na 4 stepena pri 120,000 o/min, isperite 75% rastvorom etanola sa zapreminskim udjelom sterilne vode bez enzima i osušite na zraku da se dobije totalna RNA. Koristite Prime ScriptTMRT Master mix komplet za reverznu transkripciju da konfigurišete sistem od 20 μL za reverznu transkripciju za sintezu cDNK. Zatim konfigurišite PCR radni sistem prema uputstvima kompleta i izvršite detekciju u fluorescentnom kvantitativnom PCR instrumentu. Uslovi PCR reakcije su bili: preddenaturacija na 95 stepeni u trajanju od 5 minuta; denaturacija na 95 stepeni 10 s, žarenje i ekstenzija na 60 stepeni 30 s, ukupno 40 ciklusa. Sekvenca prajmera je prikazana u tabeli 1.

Nakon dodavanja jednostavnog -MEN medijuma i gladovanja tokom 3 h, grupi Cistancheside A je takođe dodato 160 μmol/L Cistancheside A za intervenciju. Nakon završetka gladovanja, svakoj grupi je dodato 100 ng/mL RANKL radi stimulacije. Vremena stimulacije su bila 0, 10, 20, 30 i 60 min. Nakon što je vrijeme stimulacije završeno, medij kulture je odbačen i ispran tri puta sa prethodno ohlađenim 1×PBS. Ekstrahovani proteini su korišteni za detekciju ekspresije p-JNK, JNK i -aktina proteina.

Nakon što je ekstrakcija proteina završena, koristite gel elektroforezu da biste odvojili protein i prebacili ga na PVDF membranu. Dodajte 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) za blokiranje na 4 stepena u trajanju od 1 sata. Odbacite rastvor za blokiranje, isperite membranu 3 puta TBST puferom i dodajte primarno antitelo. (Nfatc1 antitelo 1: 1000, c-Fos antitelo 1: 1000, p-JNK antitelo 1: 1000, JNK antitelo 1: 1000, -aktinsko antitelo 1: 1000), inkubirajte na 4 stepena 14-16 h, operite membranu 3 puta sa TBST puferom, dodati sekundarno antitelo (m-IgG Fc BP-HRP, omjer razblaženja 1:5000), inkubirati na sobnoj temperaturi 2 sata, dodati fluorescentni rastvor nakon pranja i razviti pod gel sistemom za snimanje, Slika Laboratorija Softver analizira sivu vrijednost dobijenih traka i koristi -aktin kao internu referencu za izračunavanje relativne ekspresije ciljnog proteina.

1.5 Glavni indikatori posmatranja

① Rezultati diferencijacije osteoklasta izazvane RANKL nakon intervencije Cistancheside A; ② Formiranje aktinskih prstenova na površini osteoklasta i promjene u funkciji resorpcije kostiju osteoklasta nakon intervencije Cistancheside A; ③ Ključ za osteoklaste nakon intervencije Cistancheside A Ekspresija gena; ④ Ekspresija nizvodnih proteina JNK/mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) i p-JNK proteina nakon intervencije Cistancheside A.

1.6 Statistička analiza

Za statističku analizu i crtanje korišten je softver GraphPad Prism 9. Svi podaci su izraženi kao x-±s. Za poređenje između grupa odabrani su t test i jednosmjerna analiza varijanse. P < 0.05 je definirana kao značajna razlika. Statističke metode ovog članka razvio je Odsjek za statistiku Medicinskog univerziteta Shanxi.

Home recenzija.