Identifikacija vrsta i analiza hemijskog sastava divljih biljaka Cistanche iz Kenije
May 14, 2025
sažetak:Ova studija je koristila biljnu morfologiju, histologiju i tehnike DNK barkodiranja za identifikaciju divljih vrsta Cistanche u Keniji. Sadržaj glavnih aktivnih komponenti, uključujući feniletanoidne glikozide, šećerne alkohole i betain, u divljem Cistancheu iz Kenije određen je HPLC metodom. U međuvremenu je izvršena analiza otiska prsta. Rezultati su pokazali da je divlja biljka Cistanche sakupljena iz Kenije identificirana kao Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Sadržaj aktivnih sastojaka kao nprechinacoside,cistanozid A, acteoside, izoakteozid, i 2′-acetilakteozid u C. senegalensis iz Kenije bili su niži od onih kod domaće C. tubulosa, ali viši od onih u domaće C. deserticola. Sadržaj betaina bio je sličan onom u domaćoj C. deserticola, ali ne sadrži glukozu. Karakteristike otiska prsta su sličnije onima kod domaće C. tubulosa. Ova studija pruža osnovu za zaštitu resursa, dubinsko istraživanje i razvoj resursa Cistanche u Keniji.
Ključne riječi: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenija; identifikacija vrste; DNK barkodiranje; određivanje sadržaja
Cistanche deserticolaYC Ma
Cistanche, cijenjena biljka u tradicionalnoj kineskoj medicini, odnosi se na osušene, ljuskave, sočne stabljike pustinjskih biljaka kao što suCistanche deserticolaYC MaiCistanche tubulosa(Schenk) Wight, oba člana porodice Orobanchaceae. Poznat po svojoj sposobnosti da tonizira yang bubrega, hrani esenciju i krv, te vlaže crijeva kako bi ublažio zatvor, Cistanche se vekovima slavi u kineskim biljnim tekstovima. Njegov najraniji medicinski zapis pojavljuje se u antičkom klasikuShennongov klasik Materia Medica, gdje je Cistanche klasifikovana kao biljka "vrhunskog kvaliteta". Tokom istorije, brojni tradicionalni medicinski tekstovi su dokumentovali moćne prednosti Cistanchea, zbog čega je dobio cenjeni nadimak "Ginseng of the Desert".
Različiti farmakološki efekti Cistanchea pripisuju se njegovom nizu bioaktivnih spojeva. Među njima, feniletanoidni glikozidi su primarni aktivni sastojci odgovorni za Cistanche efekte toniziranja bubrega i hranjenja srži. Ova jedinjenja – kao što su ehinakozid i akteozid – pokazuju neuroprotektivne, anti-demencijske, protiv starenja i hepatoprotektivne aktivnosti. Značajno je da su ehinakozid i akteozid dva referentna jedinjenja koja se koriste za kontrolu kvaliteta Cistanchea kao što je navedeno u izdanju Kineske farmakopeje iz 2020. Osim toga, laksativni učinak Cistanchea uglavnom je posljedica njegovih oligosaharidnih alkoholnih komponenti, uključujući betain, manitol, fruktozu, glukozu i saharozu. Ovih pet komponenti su široko prepoznate kao pokazatelji sposobnosti Cistanchea da vlaže crijeva i podstiče rad crijeva.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight
U Kini, glavne vrste Cistanche uključujuCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G. iCistanche sinensisG. Beck. Ove vrste su porijeklom iz regija kao što su Unutrašnja Mongolija, Ningxia, Gansu i Xinjiang. Osim sjeverozapadne Kine, vrste Cistanche su također rasprostranjene u sušnim i pustinjskim regijama Evroazije i sjeverne i istočne Afrike, uključujući zemlje poput Irana, Afganistana, Kenije, Pakistana i Mongolije.
Kenija, koja se nalazi u istočnoj Africi i prostire se na ekvatoru, uglavnom se sastoji od visoravni sa prosječnom nadmorskom visinom od 1.500 metara, ali njena sjeverna područja su pustinja ili polupustinja. Autohtoni narodi Kenije imaju dugu istoriju upotrebe lekovitih biljaka za lečenje. Region se može pohvaliti bogatom ljekovitom florom - na primjer, ekstrakti iz kore i korijena drveta četkice za zube (Salvadora persicaL.) poznati su po svojim protuupalnim i antibakterijskim svojstvima i često se koriste za liječenje zubobolje i infekcija. Kora sandalovine (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) se koristi za liječenje dijareje, dok se dekocije masai koprive (Urtica massaicaBlagi br.) listovi se koriste za bolove u stomaku. Ova bogata tradicija je njegovala živu kulturu ljekovitog bilja, ali zbog izazova ekonomskog razvoja, upotreba ovih ljekovitih biljaka nije u potpunosti dokumentirana niti sistematski proučavana.
Zanimljivo je da se vrste Cistanche često smatraju korovom u Africi i nisu dobile mnogo pažnje ili istraživanja. U stvari, gotovo da nema objavljenih studija o afričkom cistancheu. Odgovarajući na poziv Odjela za regionalni razvoj za sušne i polusušne zemlje istočnoafričke zajednice, naš istraživački tim je proveo terensku studiju u Keniji kako bi istražio lokalne resurse Cistanchea. Prikupili smo divlje uzorke Cistanchea, izvršili botaničku identifikaciju i analizirali njihove primarne bioaktivne spojeve. Cilj je bio razumjeti raznolikost vrsta i razvojni potencijal Cistanchea u Keniji, te osigurati naučnu osnovu za dalja istraživanja i korištenje ovih vrijednih pustinjskih biljaka.
Cistanche tubulosa sušeni cijeli korijen Prodaja u Kini
Materijali i metode
Biljni materijali
Uzorke divljeg cistanchea iz Kenije prikupili su u avgustu 2023. profesori Pengfei Tu i Yong Jiang sa Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta u Pekingu u Kajiadu, Kenija (01 stepen 50'01"S; 36 stepen 47'00"E). Sakupljene su dvije divlje biljke Cistanche i označene K1 i K2, zajedno s korijenjem njihove biljke domaćina (vidi sliku 1). Biljku domaćina je identifikovao Kennedy Matheka, istraživač-asistent u Istočnoafričkom herbarijumu, Nacionalni muzeji Kenije, kaoSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, koji pripada porodici Amaranthaceae. Uzorci odCistanche deserticolaiCistanche tubulosaprikupljeni su iz grada Turpan i okruga Yutian u autonomnoj regiji Xinjiang Uygur, respektivno, a autentičnost ih je potvrdio profesor Pengfei Tu kao svježe sočne stabljikeCistanche deserticolaYC Ma andCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Svi uzorci vaučera čuvaju se u našoj laboratoriji.
Instrumenti
Waters Arc HPLC sistem
Quintix125D-1CN elektronska vaga (Sartorius, Peking)
Olympus BX-50 optički mikroskop (Olympus, Japan)
NanoZoomer-SQ panoramski skener slajdova (Hamamatsu Photonics, Japan)
KQ500DE digitalni ultrazvučni čistač (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kina)
Mlinica za ekstrakciju DNK MM400 (Retsch, Njemačka)
PCR termalni ciklus (Analytik Jena, Njemačka)
DYY-8C aparat i rezervoar za elektroforezu (Fabrika instrumenata Liuyi, Peking)
MINI Space 1000 gel sistem za snimanje (Tanon, Šangaj)
Inkubator sa konstantnom temperaturom (Yiheng, Šangaj)
Reagensi
Ehinakozid (lot: DST191008-038), akteozid (DSTDL006101), izoakteozid (DST210601-060), D-manitol (DSTDG006201) kupljeni su od Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulozid A (MUST-15040115), 2'-acetilakteozid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), bezvodna D-glukoza (MUST-23030214), fruktoza (MUST-23031403) i saharoza (MUST-23082505) dobijeni su od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. (HPLC grade, OCEANPAK), mravlja kiselina (HPLC grade, VOKA reagensi) su sve bile hromatografske čistoće. Komplet za ekstrakciju genomske DNK biljaka (DP305, Tiangen Biotech, Kina) i ultra čista voda korišteni su za molekularnu analizu.
Priprema, bojenje i promatranje dijelova stabljike sukulenta
Prateći metodu u referenci [10], svježe sukulentne stabljike Cistanchea su izrezane na odgovarajuće veličine i konzervirane u FAA fiksativu (70% etanol: glacijalna sirćetna kiselina: formaldehid=90:5:5). Nakon ispiranja tekućom vodom da bi se uklonio zaostali fiksator, tkiva su omekšana fluorovodoničnom kiselinom, obojena safraninom, dehidrirana, stavljena u parafin i presečena. Nakon montaže, dijapozitivi su ispečeni, parafin otopljen i preseci obojeni 95% rastvorom etanola Fast Green, a zatim zapečaćeni neutralnom smolom. Morfologija tkiva posmatrana je pod mikroskopom, a dobro oblikovani preseci su skenirani pomoću panoramskog skenera kako bi se dobile slike visoke rezolucije.
Ekstrakcija DNK, PCR amplifikacija i sekvenciranje
Ukupna DNK iz Cistanche uzoraka i korijena biljke domaćina ekstrahirana je korištenjem kompleta za ekstrakciju genomske DNK biljke (Tiangen), slijedeći protokol proizvođača. Koncentracije DNK i omjeri OD260/OD280 izmjereni su mikrovolumenskim UV spektrofotometrom kako bi se procijenio kvalitet prije nastavka.
PCR amplifikacija je ciljala interni transkribovani spacer 2 (ITS2) region ribosomalne DNK i hloroplastni psbA-trnH gen za molekularnu identifikaciju [11]. Prajmer sekvence su bile sledeće:
ITS2 naprijed: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'
ITS2 revers: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACACAT-3'
psbA-trnH naprijed: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'
psbA-trnH revers: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'
PCR reakcije (25 μL) uključivale su 12,5 μL 2× Taq Master Mixa, po 1 μL prednjeg i reverznog prajmera (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNK šablona i 8,5 μL ddH₂O. ITS2 pojačanje: 94 stepena 5 min; zatim 35–40 ciklusa od 94 stepena 30 s, 56 stepena 30 s, 72 stepena 45 s; konačno proširenje na 72 stepena 10 min. psbA-trnH amplifikacija: 95 stepeni 4 min; 35 ciklusa od 94 stepena 30 s, 55 stepena 1 min, 72 stepena 1 min; konačno proširenje na 72 stepena 10 min. PCR proizvodi su analizirani gel elektroforezom, a ciljne trake su podvrgnute Sanger-ovom dvosmjernom sekvenciranju. Kromatogrami sekvenci su analizirani korištenjem CodonCode Aligner-a (v3.7.1, CodonCode Co., SAD) kako bi se dobile ciljne DNK sekvence, koje su identificirane korištenjem kineskog Materia Medica DNK barkod sistema i BLAST analize u bazi podataka GenBank. Filogenetska stabla su konstruisana sa MEGA X softverom za identifikaciju vrsta.
Kvantitativno određivanje pet feniletanoidnih glikozida
Sadržaj pet feniletanoidnih glikozida određen je prema ranije utvrđenim metodama [13]. Priprema referentnih rastvora: precizno odmeriti ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izoakteozid i 2'-acetilakteozid i rastvoriti u 50% metanolu da bi se pripremila mešana standardna rastvora unapred određene koncentracije. Uslovi hromatografije: kolona Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza A: acetonitril–metanol (6:1, v:v); mobilna faza B: 0,1% pufer mravlje kiseline; gradijent eluiranja: 0–5 min, 10%–18% A; 5–15 min, 18%–24% A; 15–20 min, 24%–26% A; 20–28 min, 26%–30% A; 28–35 min, 30%–35% A. Brzina protoka: 1,0 mL·min⁻¹; temperatura kolone: 30 stepeni; talasna dužina detekcije: 330 nm. Metoda: ubrizgati po 10 μL standardnog i uzorka rastvora u HPLC za analizu.
Kvantitativno određivanje betaina, manitola, fruktoze, glukoze i saharoze
Ove komponente su kvantificirane prema prethodnim metodama [14]. Referentni rastvori: precizno odmeriti betain, manitol, fruktozu, glukozu i saharozu, rastvoriti u vodi da bi se pripremio mešani standardni rastvor. Rastvori uzoraka: rastvor Cistanche uzorka (pripremljen kao gore) sa 50% metanola do 1/5 originalne koncentracije, dobro promešati i filtrirati kroz mikroporoznu membranu od 0,22 μm. Kromatografski uslovi: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E kolona (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza: acetonitril–voda (77:23); brzina protoka: 0,7 mL·min⁻¹; temperatura kolone: 25 stepeni; detekcija sa detektorom evaporativnog raspršivanja svetlosti (ELSD): temperatura drift cevi 100 stepeni, protok nosećeg gasa 3 L·min⁻¹. Kvantifikacija je izvršena ubrizgavanjem 5 μL i 10 μL standardnih rastvora i 5 μL rastvora uzorka i izračunavanjem sadržaja primenom eksterne standardne logaritamske jednačine u dve tačke.
Procjena sličnosti otiska prsta
Rastvori uzoraka su pripremljeni kako je gore opisano, a HPLC uslovi i metode su bili isti kao za kvantifikaciju feniletanoidnih glikozida. Kromatografski podaci su uvezeni u "Sistem za procjenu sličnosti hromatografskih otisaka prstiju tradicionalne kineske medicine (izdanje 2012.)". Kao referentni korišćen je hromatogram uzorka K1, sa pet pikova feniletanoidnog glikozida označenih za korekciju u više tačaka, generisanje preklopnih i referentnih hromatograma i izračunavanje sličnosti otiska prsta.
Rezultati i analiza
1. Morfološka identifikacija Cistanchea
Divlji primjerci Cistanchea prikupljeni u Keniji pokazuju karakteristične morfološke karakteristike. Cvat je klas, sa jednim listom dugo-jajoličastog oblika i dvije male brakteole, čije su obje strane gole. Čaška je cjevasta, sa pet tupih režnjeva na vrhu. Vjenčić je cjevasto-kampanulast, dužine 3-4 cm, oko 2,5 puta dužine čaške, sa pet režnjeva na vrhu i zakrivljenim rubovima. Vjenčić je žute boje (slika 1A, B), a kada se osuši postaje smeđi. Filamenti su dugi oko 3 cm, sa nekoliko finih dlačica u osnovi. Stil je nešto duži od prašnika, a stigma je skoro sferična, glatka i gola. Ima četiri prašnika, sa dugim jajolikim prašnicima koji su gusto prekriveni dugim vunastim dlačicama; osnova prašnika je naglo zašiljena. Ova karakteristika je u skladu sa opisimaCistanche deserticolaiCistanche salsau "Flori Kine"; nasuprot tome, baza prašnikaCistanche tubulosaje tup i zaobljen, što ga jasno razlikuje od ostalih vrsta u istom rodu [7].
Pored toga, biljka domaćin,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, je jako razgranat grm. Njegove mlade grane gusto su prekrivene blijedožutim ili bijelim vunastim dlačicama. Listovi su široko lopatasto-ubojajasti sa uskom bazom (Slika 1D, E). Cvatovi su gusto skupljeni duž peteljke, koja je zajedno sa osom cvata prekrivena sivkasto-bijelim ili blijedosivim ili bijelim vunastim dlačicama.
Sočna stabljika divlje Cistanche je spljoštena-cilindrična, sa blijedožutom ili smeđkastom površinom gusto prekrivenom igličastim, mesnatim ljuskama raspoređenim u redove. Tekstura je čvrsta, ali malo fleksibilna (slika 2A). Poprečni presjek stabljike sukulenta je blijedožut ili smećkast, sa razbacanim blijedosmeđim vaskularnim snopovima vidljivim golim okom (Slika 2B). Pod mikroskopom, vaskularni snopovi izgledaju jajoliki ili vretenasti, sastavljeni od ksilema i floema, često prisutni kao pojedinačni rasuti snopovi ili grupirani u parove ili trije, sa floemom orijentiranim u različitim smjerovima (Slika 2C, D). Prema izdanju Kineske farmakopeje iz 2025., presjekCistanche deserticolaje smeđkast, sa blijedosmeđim tačkastim vaskularnim snopovima raspoređenim u valoviti prsten, koji često tvore unutra presavijeni prstenasti snop; nasuprot tome,Cistanche tubulosaprikazuje rasute vaskularne snopove u obliku tačaka, ključnu razlikovnu karakteristiku za identifikaciju ova dva tipa rezova Cistanche [1]. Divlji Cistanche iz Kenije također pokazuje rasute vaskularne snopove u obliku tačaka na poprečnom presjeku, u skladu s karakteristikamaCistanche tubulosa.
Slika 2. Karakteristike izgleda i presjeka divlje biljke Cistanche (K2) u Keniji. O: Izgled stabljike; B: Poprečni presjek mesnate stabljike; C: Parafinski dio mesnate stabljike (safranin brzo zeleno bojenje); D: Uvećani prikaz vaskularnog snopa u parafinskom dijelu
