Mrežna farmakologija i eksperimentalna validacija otkrivaju mehaničku ulogu Cistanche feniletanoidnih glikozida u liječenju NAFLD-a putem TNF/PI3K/Akt puta
Oct 29, 2025
3. Rezultati
3.1 Mrežna farmakologija
3.1.1 Aktivni spojevi i potencijalni ciljevi
Na osnovu prethodnog istraživanja projektnog tima i informacija iz baza podataka i literature, odabrano je deset reprezentativnih spojeva s farmakološkom aktivnošću [10–11]:verbaskozid, izoverbaskozid, ehinakozid, 2′-acetil-verbaskozid, cistanozid A, cistanozid B, salidrozid, izokrenatozid II, cistanhe glikozid A i cistanhe glikozid F.
Ekstrakt verbaskozida (akteozida) Cistanche sa visokim sadržajem za liječenje lipida u krvi
Lista specifikacija ekstrakta Cistanche
KoristećiSwissTargetPrediction, postignuto je 44 cilja;NetInferpredvideo prvih 20 ciljeva, dajući 45 ciljeva;SuperPreddao 118 ciljeva. Nakon spajanja i uklanjanja duplikata,195 jedinstvenih metasu identifikovani.
OdGSE89632skup podataka, koji je uključivao 39 uzoraka NAFLD i 24 normalna uzorka,589 različito eksprimiranih genabili pregledani. Kombinovanje podataka izGeneCardsiDisGeNET, 2.315 gena za bolesti povezanih sa NAFLD-omdobijene su nakon deduplikacije (slike 1A-1B). Ukrštanjem ciljeva povezanih sa jedinjenjem sa ciljevima bolesti,77 ciljeva koji se preklapajuidentificirani su kao potencijalne terapijske mete Cistanche feniletanoidnih glikozida protiv NAFLD (slika 1C).
Ovi ciljevi su uvezeni uSTRING database with an interaction threshold >0.400. Izolirani čvorovi su uklonjeni, a mreža je vizualizirana putemCytoscape, što rezultira aPPI mreža sa 75 čvorova i 408 rubova(Slika 1D). Koristeći funkciju "Analyze Network" u Cytoscapeu, prvih 10 ciljeva na osnovu vrijednosti stepena identificirani su kao ključni ciljevi:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.
3.1.2 GO, KEGG i DO analize obogaćivanja
GO analiza obogaćivanja otkrila je 93 pojma zamolekularna funkcija (MF), 38 forćelijska komponenta (CC), i 989 forbiološki proces (BP). Vizualizirano je 10 najboljih unosa u svakoj kategoriji (Slika 2). Rezultati su pokazali da Cistanche feniletanoidni glikozidi mogu ispoljiti anti-NAFLD efekte putem puteva povezanih saupala, citokini, metabolizam i imunološki odgovor.
DO obogaćivanje identifikovano833 bolestipovezane sa ciljevima, sa 25 najboljih vizualiziranih (slika 4), uključujućimetaboličke, imunološke, kardiovaskularne, bolesti povezane s gojaznošću i bolesti jetre, sve usko povezano sa NAFLD.
3.1.3 Mreža „Složena–Cilja–puta“.
Na osnovu rezultata obogaćivanja KEGG, amreža „složena–cilja–put“.je izgrađen pomoćuCytoscape 3.9.1. Zeleni kvadrati predstavljaju aktivne spojeve, plavi krugovi predstavljaju mete, a narandžasti čvorovi u obliku slova V predstavljaju puteve (slika 5). Ovo ilustruje da Cistanche feniletanoidni glikozidi ispoljavaju anti-NAFLD efekte krozviše jedinjenja, ciljeva i puteva, saehinakozid i verbaskozidkao najzastupljenija i najbrojnija jedinjenja markera u izdanju za 2020Kineska farmakopeja.
3.1.4 Molekularno spajanje
Prvih pet ključnih ciljeva u PPI mreži (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1) su spojeni sa aktivnim jedinjenjima i izračunate su njihove minimalne energije vezivanja (slika 6). Svi rezultati pristajanja bili su manji od–6 kcal/mol, što ukazuje na jake afinitete vezivanja.TNF je pokazao najjači afinitet. Neki rezultati pristajanja su vizualizirani korištenjemPyMOL(Slika 7).
3.2 Eksperimenti na ćelijama
3.2.1 Efekti FFA na akumulaciju lipida u HepG2 ćelijama
Kao što je prikazano uSlika 8, povećanje koncentracije FFA od 0,5 do 2 mmol/L dovelo je do povećanja crvenih lipidnih kapljica, koje su se spojile u velike kapljice lipida, što ukazuje na uspješno punjenje lipida.
3.2.2 Učinci FFA i feniletanoidnih glikozida Cistanche na vitalnost ćelije
Kao što je prikazano uSlika 9A, FFA koncentracije1 mmol/L i manjenije imao značajan uticaj na vitalnost ćelija (P > 0,05); dakle,1 mmol/Lje izabran za modeling. Kao što je prikazano uSlika 9B, Cistanche feniletanoidni glikozidi do200 μg/mLnije značajno uticala na održivost (P > 0,05), ali400 μg/mLznačajno inhibirala vitalnost (P < 0,01). stoga,25, 50 i 100 μg/mLsu odabrane kao niske, srednje i visoke doze za liječenje.
3.2.3 Učinci na akumulaciju lipida
Kao što je prikazano uSlika 10, modelna grupa je pokazala značajnu akumulaciju crvenih lipidnih kapljica u poređenju sa kontrolnom grupom (P < 0,01), potvrđujući uspješno modeliranje. Tretman sa50 i 100 μg/mLCistanche feniletanoidnih glikozida značajno smanjuju stvaranje lipidnih kapljica (P < 0,01). USlika 11, nivoi TG i TC bili su povišeni u modelnoj grupi (P < 0,01), dok su sve tretirane grupe pokazale značajno smanjene nivoe u poređenju sa modelnom grupom (P < 0,01).
3.2.4 Efekti na oštećenje mitohondrija
JC-1 boja se akumulira u zdravim mitohondrijama i emituje crvenu fluorescenciju; u oštećenim mitohondrijama ostaje u monomernom obliku i emituje zelenu fluorescenciju. Kao što je prikazano uSlika 12, crvena fluorescencija je dominirala u kontrolnoj grupi, dok je zelena fluorescencija bila istaknuta u grupi modela. Grupe za liječenje pokazale su smanjenu zelenu fluorescenciju i povećanu crvenu fluorescenciju, što ukazuje na poboljšani potencijal mitohondrijske membrane.
3.2.5 Efekti na intracelularne nivoe ROS
Kao što je prikazano uSlika 13, grupa modela pokazala je značajno povećan intenzitet fluorescencije (P < 0,01), što ukazuje na povišen ROS. Tretman feniletanoidnim glikozidima Cistanche značajno je smanjio nivoe ROS u svim koncentracijama (P < 0,01).
3.2.6 Efekti na apoptozu
Hoechst 33342 boji jezgre, a apoptotička jezgra pokazuju svijetloplavu, kondenziranu ili fragmentiranu morfologiju. Kao što se vidi uSlika 14, kontrolna grupa je imala minimalnu sjajnu fluorescenciju, dok je modelna grupa pokazala obilje jarko plavih apoptotičkih jezgara. Terapijske grupe su pokazale smanjeni intenzitet fluorescencije, što ukazuje na smanjenu apoptozu.
3.2.7 Efekti na TNF/PI3K/Akt signalni put i Bax ekspresiju
Kao što je prikazano uSlika 15, u poređenju sa kontrolnom grupom, model grupa je pokazala značajno povišenu ekspresijuTNF-α, PI3K p85, Akt i Baxproteini (P < 0,05, P < 0,01). Nakon tretmana:
Sve grupe Cistanche feniletanoidnih glikozida pokazale su smanjenjeTNF-αizraz (P < 0,01),
The50 μg/mLgrupa pokazala smanjenuPI3K p85izraz (P < 0,01),
The100 μg/mLgrupa pokazala smanjenuAkt i Baxizraz (P < 0,05).
4. Diskusija
NAFLD je složena bolest jetre povezana s metaboličkim poremećajima, uključujućineravnoteža metabolizma lipida, otpornost na inzulin i oksidativni stres[12]. posljednjih godina,tradicionalna kineska medicina (TCM)pokazao značajno obećanje u liječenju NAFLD-a.
Savremena istraživanja su to otkrilafeniletanoidni glikozidi iz Cistancheamože regulirati metabolizam lipida i glukoze u jetri i inhibirati oksidativni stres, upalu i fibrozu [13-15]. Jetra koristiβ-oksidacijaza metabolizam masnih kiselina iCYP7A1za pretvaranje holesterola u žučne kiseline za homeostazu lipida [16–18]. U okruženjima s visokim sadržajem masti, metabolički disbalans dovodi do akumulacije lipida i NAFLD-a [19].
Ovo istraživanje je to potvrdiloHepG2 ćelije izazvane FFApokazao povećane kapljice lipida i povišene nivoe TC i TG. Tretman sa Cistanche feniletanoidnim glikozidima značajno je smanjio stvaranje lipidnih kapljica i nivoe TC/TG, poboljšavajući steatozu jetre.
Mitohondrijska disfunkcija dovodi do smanjene β-oksidacije, prekomjerne proizvodnje ROS-a i peroksidacije lipida [20]. ROS dodatno oštećuje mitohondrije, pogoršavajući steatozu [21]. Naši rezultati pokazuju da Cistanche feniletanoidni glikozidismanjiti ROS, poboljšatipotencijal mitohondrijske membrane, i ublažitioksidativni stres, čime se ublažava nakupljanje masti.
Mrežna farmakologija je pokazala da anti-NAFLD efekti uključuju višestrukometaboličkih puteva i puteva povezanih s apoptozom. Molekularno spajanje pokazalo je jake afinitete vezivanja između aktivnih spojeva i ciljeva, posebnoTNF, što ukazuje na njegovu centralnu ulogu.
TheTNF putje kritična u ćelijskoj signalizaciji. TNF-α se vezuje zaTNFR1, aktivirajući puteve receptora smrti i indukujući apoptozu [22]. Takođe aktiviraPI3K/Akt putkroz parakrinu signalizaciju [23–24]. Abnormalna PI3K/Akt signalizacija povezana je sa akumulacijom lipida, upalom i fibrozom kod NAFLD-a [25]. Naši podaci pokazuju da Cistanche feniletanoidni glikozidiinhibiraju apoptozui smanjiti ekspresijuTNF-α, PI3K, Akt, iBax, u skladu s mrežnim predviđanjima, potvrđujući važnostTNF/PI3K/Akt put.
Zaključak
Cistanche feniletanoidni glikozidi regulišu NAFLD putemviše procesa i puteva, uključujući:
Smanjenje nakupljanja lipida,
Inhibiranje oksidativnog stresa,
Ublažavanje oštećenja mitohondrija,
Suzbijanje apoptoze.
Ovi efekti mogu biti usko povezani saTNF/PI3K/Akt signalni put. Ova studija pruža ne samo naučnu podršku za primjenu Cistanche feniletanoidnih glikozida u liječenju NAFLD-a, već i referencu za razvoj i klinička istraživanja novih terapijskih lijekova.
