Cistanche glikozidi ublažavaju fibrozu prostate kod benigne hiperplazije prostate regulacijom MiRNA-483-3p

 

SAŽETAK

Cilj:Istražiti meliorativne učinke cistanche glikozida na fibrozu prostate kod benigne hiperplazije prostate (BPH) i mehanizam koji uključuje regulaciju mikroRNA (miRNA)-483-3p.

Metode:Mužjaci miševa su nasumično raspoređeni u pet grupa: normalna kontrola, kontrola BPH modela, finasterid, cistanche glikozidi i cistanche glikozidi + antagonist miRNA-483-3p. BPH model je uspostavljen bilateralnom orhiektomijom praćenom svakodnevnom supkutanom injekcijom testosteron propionata. Nakon 30 dana, taloženje kolagena u prostati je procijenjeno Massonovim trihromskim i Sirius Red bojenjem i mjeren je sadržaj hidroksiprolina (Hyp). Nivoi mRNA prostate transformirajućeg faktora rasta-1 (TGF-1), mitogen-aktivirane protein kinaze 2 (MK2) i mitogen-aktivirane protein kinaze kinaze 6 (MKK6), kao i nivoa miRNA-483-3p, određeni su kvantitativnim PCRqP u realnom vremenu. Nivoi proteina prostate TGF-1, MK2, fosforiliranog MK2 (p-MK2), MKK6 i fosforiliranog MKK6 (p-MKK6) procijenjeni su Western blotingom. Direktno vezivanje miRNA‑483‑3p za MK2 ispitano je pomoću testa reportera luciferaze.

Rezultati:U odnosu na normalnu kontrolnu grupu, kontrolna grupa modela BPH pokazala je značajno povećano taloženje kolagena u prostati; povišeni nivoi mRNA TGF-1, MK2 i MKK6; i viši nivoi proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKK6 (svi P < 0,01), dok su nivoi miRNA-483-3p značajno smanjeni (P < 0,01). U poređenju sa kontrolnom grupom modela BPH, cistanche glikozidi su povećali regulaciju miRNA-483-3p, smanjili nivoe mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, snizili nivoe proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKK2 i p-MKK6 prostatičku kolekciju i sve. Primjetno je da je istodobna primjena antagomira miRNA-483-3p s glikozidima cistanche značajno smanjila miRNA-483-3p, povećala taloženje kolagena i povišene nivoe mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, kao i nivoe proteina i TMGF-2, p1KF-2. p-MKK6 u poređenju sa samo cistanche glikozidima (svi P < 0,01). Test luciferaze je pokazao da miRNA-483-3p direktno cilja na MK2.

Zaključak: Cistanche glikozidi ublažavaju fibrozu prostate u BPH regulacijom miRNA‑483‑3p i inhibiranjem MK2 signalizacije.

Ključne riječi: Cistanche glikozidi; miRNA‑483‑3p; prostata;fibroza; benigna hiperplazija prostate

 

 

 

Cistanche Deserticola vrhunskog kvaliteta

Više znanja o biljci za liječenje BPH

 

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

Uvod

Benigna hiperplazija prostate (BPH)je uobičajeno stanje kod sredovečnih i starijih muškaraca, a prevalencija raste s godinama. Izvještaji pokazuju da prevalencija BPH prelazi 50% među muškarcima starijim od 50 godina. BPH i povezani simptomi donjeg urinarnog trakta (LUTS) nameću znatna opterećenja na kvalitetu života i dugoročne troškove zdravstvene zaštite. Klinički, inhibitori 5 -reduktaze i blokatori adrenergičkih receptora su preporučene farmakoterapije. Međutim, ‑blokatori ne smanjuju volumen prostate, a 25–30% pacijenata ne pokazuje poboljšanje LUTS-a sa 5 -inhibitorima reduktaze; štaviše, 5–7% se može čak i pogoršati. Iako se hirurške inovacije kao što je thulium laserska prostatektomija sve više koriste u poređenju sa transuretralnom resekcijom prostate, postoperativni LUTS se i dalje javljaju u stopama koje prelaze 23%.

Trenutni dokazi ukazuju na tri glavna patobiološka procesa u BPH: hiperplaziju žlijezda, kontrakciju glatkih mišića i fibrozu prostate. Ovi procesi djeluju nezavisno ili sinergistički kako bi potaknuli kliničku progresiju. BPH obično (iako ne uvek) koegzistira sa LUTS; fibroza, koju karakterizira prekomjerno taloženje ekstracelularnog matriksa, ugrožava fleksibilnost uretre unutar prostate i doprinosi opstrukciji mokraće. Ipak, terapijske opcije koje specifično ciljaju na fibrozu organa ostaju ograničene.

Cistanche (Cistanche spp.) je tradicionalna ljekovita i hranljiva biljka. Njegovi karakteristični feniletanoidni glikozidi (koji se ovdje zajednički nazivaju cistanche glikozidi, kao što su ehinakozid i akteozid) pokazuju široku bioaktivnost, uključujući antimikrobne, hipolipidemijske, antialergijske, kardiotonične, antidijabetičke, antitumorske, neuroprotektivne, imuno-antioksidativne. Nagomilani dokazi ukazuju na antifibrotičko djelovanje ovih glikozida u organima kao što su bubrezi, pluća, srce i jetra. Međutim, nisu prijavljeni njihovi efekti na fibrozu prostate. Ova studija je ispitala utjecaj cistanche glikozida na fibrozu prostate i istražila osnovne mehanizme, fokusirajući se na os miRNA-483-3p/MK2 relevantnu za remodeliranje ekstracelularnog matriksa.

Cistanche Deserticola vrhunskog kvaliteta

 

Materijali i metode

Materijali

 

miRNA‑483‑3p antagomir (hemijski modifikovan): kupljen od Shanghai GenePharma Co., Ltd. (br. serije: 12953).

Injekcija testosteron propionata: Tianjin Jinyao Pharmaceutical Co., Ltd. (br. serije: 150822).

Cistanche glycosides: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (purity >=98%, Batch No.: M14062). Note for nutraceutical developers: material corresponds to standardized phenylethanoid glycoside fraction; ensure specification by HPLC content (e.g., total PEGLs, echinacoside/acteoside).

Finasterid tablete: MSD (Hangzhou) Pharmaceutical Co., Ltd. (br. serije: U011856; 5 mg/tableti).

Komplet za analizu Luciferaze (serijski broj: E2920) i vektor psiCHECK‑2 (br. serije: C8021): Promega (SAD).

qPCR komplet za detekciju: KAPA Biosystems (serija br.: KM4101).

Komplet za testiranje hidroksiprolina (Hyp): Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Serija br.: 20190626).

Prajmere za TGF-1, MK2 i MKK6 sintetizirao je Wuhan Tianyi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.

Cistanche Deserticola vrhunskog kvaliteta

 

Životinje

Sedam sedmica stari mužjaci C57BL/6 miševa bez specifičnih patogena (SPF) (22-24 g) su dobijeni sa Poljoprivrednog univerziteta Huazhong (br. licence za proizvodnju: SCXK Hubei 2015‑0019). Životinje su bile smještene na 23 ± 2 stepena, 50 ± 5% vlažnosti, pod ciklusom od 12 h svjetlosti/12 h mraka.

 

Oprema

 

StepOnePlus PCR sistem u realnom vremenu (Applied Biosystems, SAD).

Luminoskan 5200110 mikropločasti luminometar (Thermo Fisher Scientific, SAD).

Eksperimentalni dizajn i BPH model
Nakon 1 sedmice aklimatizacije, miševi su nasumično raspoređeni (tabela slučajnih brojeva) u pet grupa (n=6 po grupi): normalna kontrola, kontrola BPH modela, finasterid, cistanche glikozidi i cistanche glikozidi + miRNA-483-3p antagomir. Model BHP-a induciran je hirurškom kastracijom plus dnevnom supkutanom injekcijom testosteron propionata u dozi od 7,5 mg·kg⁻¹ tokom 30 dana. Grupa koja je primala finasterid je primala oralni finasterid 1 mg·kg⁻¹ dnevno (rastvoren u 0,5% CMC-Na). Grupa cistanche glikozida primala je oralne cistanche glikozide 100 mg·kg⁻¹ dnevno. Kombinovana grupa je primala oralne glikozide cistanche 100 mg·kg⁻¹ dnevno plus injekciju miRNA-483-3p antagomira u venu repa u dozi od 10 mg·kg⁻¹ svakih 5 dana prema uputstvima proizvođača. Kontrolne grupe normalnog i BPH modela dobile su jednaku količinu 0,5% CMC-Na oralno.

Nakon 30 dana, miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom natrijum pentobarbitala (80 mg·kg⁻¹) i eutanazirani cervikalnom dislokacijom. Prostata je izrezana; dijelovi su fiksirani i ugrađeni za Massonovo trihromsko i Sirius Red bojenje, a svježa tkiva su obrađena za qPCR, Western blot i biohemijske testove. Postupci na životinjama su u skladu sa propisima provincije Hubei o upravljanju laboratorijskim životinjama (Broj kvalifikacija operatera: TY20190784).

Cistanche Deserticola vrhunskog kvaliteta

 

Procjena fibroze prostate

Taloženje kolagena je procijenjeno Sirius Red i Massonovim trihromnim bojenjem. Sadržaj hipa u tkivu prostate je kvantificiran prema uputama za komplet. Za svaki slajd, tri nasumična polja su analizirana pomoću Image‑Pro Plus 6.0 da bi se izračunao procenat pozitivno obojene površine.

Evaluacija aktivnosti MK2 Pathway

qPCR: Izmjereni su nivoi mRNA prostate MK2, TGF-1 i MKK6. Prajmer sekvence:

MK2 (264 bp) naprijed 5'-GGAAGTGCCTGCTGAT-3', obrnuto 5'-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3';

TGF‑ 1 (153 bp) naprijed 5'-AGGAGACGGAATACAGGG-3', obrnuto 5'-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3';

MKK6 (146 bp) naprijed 5'-CCTCAGACCAGTTCCAC-3', obrnuto 5'-CGCATCTTCTCCACCA-3'.

Western blot: Nivoi proteina TGF‑1, MK2, p‑MK2, MKK6 i p‑MKK6 određeni su prema prethodno utvrđenim protokolima.

Mjerenje miRNA‑483‑3p
miRNA‑483‑3p prajmeri: naprijed 5'-GGGTCACTCCTCCCCCT-3', reversno 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'; RT prajmer 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG-3'. qPCR je izveden prema uputama za komplet.

 

Luciferase Reporter Assay

MK2 3'UTR je kloniran u vektor psiCHECK‑2 da bi se konstruirali reporterski plazmidi divljeg tipa (WT) i mutantni (MUT). HEK-293T ćelije su ko-transficirane sa miRNA-483-3p i reporterskim plazmidima koristeći Lipofectamine 3000; kontrolne ćelije su primile prazan vektor. Nakon 24 h mjerena je aktivnost luciferaze prema protokolu kita.

Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoću SPSS 17.0. Jednosmjerna ANOVA je primijenjena nakon potvrde normalnosti i homogenosti varijanse. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. LSD post hoc testovi su korišteni za višestruka poređenja. Razlike su smatrane statistički značajnim pri P < 0,05.

 

Rezultati

U poređenju sa normalnom kontrolnom grupom, kontrolna grupa modela BPH pokazala je značajno povećanje taloženja kolagena u prostati; povišene ekspresije mRNA TGF-1, MK2 i MKK6; i viši nivoi proteina TGF‑1, p‑MK2 i p‑MKK6 (svi P < 0,01). Nivoi miRNA‑483‑3p su značajno smanjeni (P < 0,01).

U odnosu na kontrolu BPH modela, cistanche glikozidi su značajno povećali regulaciju miRNA-483-3p, snizili nivoe mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, snizili nivoe proteina TGF-1, p-MK2 i p-MKGK6 depozicije prostatičnog kolagena i p-MKGK6.

U poređenju sa samim cistanche glikozidima, kombinacija cistanche glikozida sa antagomirom miRNA-483-3p značajno je smanjila miRNA-483-3p i povećala taloženje kolagena, plus nivoe mRNA TGF-1, MK2 i MKK6, kao i nivoe proteina TGMK-1 i TGMK-1. p‑MKK6 (svi P < 0,01).

Test luciferaze je potvrdio da miRNA-483-3p direktno cilja na MK2.

 

Diskusija (kratka, fokusirana na nutricionizam)

Ova studija pokazuje da cistanche glikozidi ublažavaju fibrozu prostate u modelu BPH izazvanog kastracijom/testosteronom tako što povećavaju regulaciju miRNA-483-3p i potiskuju aktivnost MK2 puta nizvodno od TGF-signalizacije. S obzirom na ograničenja trenutne farmakoterapije za BHP u rješavanju fibroznog remodeliranja, cistanche glikozidi mogu predstavljati komplementarnu nutraceutičku strategiju usmjerenu na balans ekstracelularnog matriksa.

Za razvoj dodataka prehrani, razmatranja uključuju:

Standardizacija: definisati ukupne feniletanoidne glikozide i jedinjenja markera (npr. ehinakozid veći ili jednak 20%, akteozid veći ili jednak 10% prema HPLC).

Translacija doze: 100 mg·kg⁻¹ kod miševa je približno 8–12 mg·kg⁻¹ humane ekvivalentne doze (HED) koristeći skaliranje površine tijela, otprilike 500–800 mg/dan za odraslu osobu od 60–70 kg; potrebna je klinička validacija.

Kvalitet i sigurnost: osigurajte identitet (botanički izvor, zagađivači, teški metali, pesticidi) i procijenite potencijalne interakcije sa ‑blokatorima ili inhibitorima 5‑reduktaze.

Tvrdnje: tvrdnje o strukturi/funkciji trebale bi se fokusirati na "podržavanje protoka mokraće i ravnoteže tkiva prostate" i izbjegavati jezik liječenja bolesti bez kliničkih dokaza.

 

Zaključci

Cistanche glycosidesublažavaju fibrozu prostate u BPH regulacijom miRNA‑483‑3p i inhibiranjem MK2 signalizacije. Ovi nalazi podupiru daljnja translacijska istraživanja o standardiziranim ekstraktima cistanchea kao pomoćnim nutraceuticima za zdravlje prostate.

 

Priznanja

Ovaj rad je podržala Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (grant br.. 81703594).

Informacije o autoru
Yang Chuhao (1991–), žena, Wuhan, Hubei, klinički farmaceut, MS; glavna oblast istraživanja: klinička farmacija. ORCID: 0000-0002-8921-5758; Tel: +86-27-82440854.