Polisaharid Cistanche Deserticola slabi osteoklastogenezu i resorpciju kostiju putem inhibicije RANKL signalizacije i proizvodnje reaktivnog kisika

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song i dr

Osteoporoza je metabolička bolest koju karakteriziraju osteopenija i oštećenje mikrostrukture kostiju. Osteoklasti su primarne efektorske ćelije koje razgrađuju koštani matriks i njihova abnormalna funkcija dovodi do razvoja osteoporoze. Akumulacija reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) tokom staničnog metabolizma potiče proliferaciju i diferencijaciju osteoklasta, te stoga igra važnu ulogu u osteoporozi.Cistanchedeserticolapolisaharida(CDP) ima antitumorsko, antiinflamatorno i antioksidativno djelovanje. Međutim, utjecaj CDP-a na osteoklaste je nejasan. U ovoj studiji, bojenje kiselom fosfatazom otpornom na tartrat, imunofluorescencija, lančana reakcija reverzne transkripcije-polimeraze i Western blot analiza korišteni su kako bi se pokazalo da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)inhibirao osteoklastogenezu i resorpciju hidroksiapatita. Osim toga, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)takođe inhibirao ekspresiju gena markera osteoklasta, uključujući Ctsk, Mmp9 i Acp5, i nije imao efekta na receptorski aktivator ekspresije nuklearnog faktora κB (RANK). Mehanističke analize su pokazale da je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)povećava ekspresiju antioksidativnih enzima kako bi se smanjila RANKL posredovana proizvodnja ROS-a u osteoklastima i inhibira nuklearni faktor aktiviranih T stanica i aktivacija protein kinaze aktivirane mitogenom. Ovi rezultati sugeriraju da CDP može predstavljati lijek kandidata za liječenje osteoporoze uzrokovane prekomjernom aktivnošću osteoklasta.

KLJUČNE RIJEČIresorpcija kostiju,Cistanchedeserticolapolisaharid, MAPK, osteoklast, reaktivne vrste kiseonika

cistanche bodybuilding

1|UVOD

Ravnoteža između formiranja kostiju, posredovane osteoblastima, i resorpcije kostiju, posredovane osteoklastima, igra vitalnu ulogu u održavanju metaboličke homeostaze kostiju (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Kada resorpcija kosti premašuje formiranje kosti, dolazi do osteoporoze, koju karakterizira smanjena koštana masa i mikrostrukturno oštećenje kosti (Ikeda, 2008). Osteoporoza je česta bolest kod starijih osoba i žena u postmenopauzi i njena patogeneza nije u potpunosti razjašnjena (Cooper & Melton, 1992). Nedostatak estrogena je primarni uzrok osteoporoze (Manolagas, O'Brien i Almeida, 2013). Osim toga, reaktivne vrste kisika (ROS) mogu biti inducirane aktivatorom receptora nuklearnog faktora κB liganda (RANKL) i povezane su s formiranjem osteoklasta (Yip et al., 2005), te stoga mogu doprinijeti razvoju osteoporoze (Manolagas, 2010). Neke studije su otkrile da nedostatak Nrf2-antioksidansa povećava nivoe ROS-a i potiče diferencijaciju osteoklasta izazvanu RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Stoga, smanjenje proizvodnje ROS-a tokom diferencijacije osteoklasta treba procijeniti kao terapijsku strategiju za liječenje osteoporoze.

Osteoklasti su izvedeni iz hematopoetske loze monocita ili makrofaga i jedine su višenuklearne ćelije koje vrše resorpciju kosti (Teitelbaum, 2000). Stoga su istraživanja koja uključuju formiranje osteoklasta od velikog značaja u razvoju efikasnih tretmana za bolesti metabolizma kostiju (Lorenzo, 2017). Faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF) i RANKL, koje proizvode osteoblasti i aktivirane T ćelije, važni su citokini koji reguliraju osteoklastogenezu (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL inducira ekspresiju nuklearnog faktora aktiviranih T ćelija (NFATc1), koji je kritični transkripcioni faktor aktivan tokom formiranja osteoklasta (Ishida et al., 2002). Aktivirani NFATc1 potiče ekspresiju gena markera osteoklasta kao što su kisela fosfataza otporna na tartrat (TRAcP) i katepsin K (CTSK) koji reguliraju osteoklastogenezu i funkciju osteoklasta (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolisaharida(CDP) je izoliran iz mesnatih stabljikaCistanchei posjeduje imunološku regulaciju, antitumorske, antiaging i druge farmakološke efekte (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)imao inhibitorni efekat na proizvodnju azotnog oksida (NO) izazvanu lipopolisaharidom u mikroglijalnim ćelijama miša (BV-2 ćelije; Nan et al., 2013). Osim toga, ekstrakt bogat feniletanoidima (ECD) odCistanchepoboljšao sposobnost plivanja miševa smanjenjem oštećenja mišića, odlaganjem akumulacije mliječne kiseline i poboljšanjem skladištenja energije (Cai et al., 2010). Međutim, efekti CDP-a na funkciju i aktivnost osteoklasta ostaju nepoznati.

U ovoj studiji smo pokazali da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)inhibira RANKL-induciranu diferencijaciju osteoklasta i resorpciju kostiju. Osnovni mehanizam bio je taj CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)pojačava ekspresiju antioksidativnih enzima kako bi se smanjila proizvodnja ROS, a zatim potiskuje RANKL-aktiviran NFAT i mitogen-aktiviran protein kinaza (MAPK) signalne kaskade. Ovi rezultati sugeriraju da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)može se koristiti za liječenje osteoporoze uzrokovane prekomjernom osteoklastičnom resorpcijom kosti.

maca ginseng cistanche

2|MATERIJALI I METODE

2.1|Materijali

CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)(čistoća > 98 posto) nabavljena je od Solarbio (Peking, Kina) i pripremljena u koncentraciji od 1 mM u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS). Antitela su specifična za c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilisani (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK i ‐aktin dobijena su od Deda Mraza Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Antitela na V-ATPazu d2 su proizvedena kao što je prethodno opisano (H. Feng et al., 2009). Sistem za analizu 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum (MTS) i luciferaze dobijen je od Promega (Sydney, Australija) . Rekombinantni M-CSF je kupljen od R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinantni GST-rRANKL protein je eksprimiran i pročišćen kao što je prethodno opisano (Xu et al., 2000).

2.2|Ćelijska kultura

RAW264.7 ćelije (ćelije makrofaga miša) su dobijene iz American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) i uzgajane u -modificiranom minimalnom esencijalnom mediju (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australija) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina (kompletan medij). Monociti dobijeni iz koštane srži (BMM) izolovani su od 6 sedmica starih miševa C57BL/6J, koji su eutanazirani u skladu sa procedurama koje je odobrio Komitet za etiku životinja Univerziteta Zapadne Australije (RA/3/100/1244). Duge kosti su secirane bez mekih tkiva, a koštana srž je isprana iz femura i tibije, koja je potom uzgajana u potpunoj podlozi u prisustvu M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Analiza osteoklastogeneze

BMM su postavljeni u ploče za kulturu sa 96 jažica pri gustini od 6 × 103 ćelija po jažici i tretirani kompletnim medijumom koji sadrži M-CSF (50 ng/ml) i GST-rRANKL (100 ng/ml), u prisustvu ili odsustvo različitih koncentracija CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tri jezgra) identificirani su kao osteoklasti.

2.4|Ispitivanja citotoksičnosti

BMM su posađene u ploče sa 96 jažica sa 6 × 103 ćelije po jažici i ostavljene preko noći da se pričvrste. Sljedećeg dana, ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid). Nakon narednih 48 sati, MTS rastvor (20 µl/jažici) je dodan i inkubiran sa ćelijama 2 sata. Apsorbanca na 490 nm određena je čitačem mikroploča (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Imunofluorescentno bojenje

BMM su zasijani u gustini od 6 × 103 ćelija po jažici u prisustvu M-CSF (50 ng/ml) preko noći. Ćelije su zatim stimulirane sa M-CSF i GST-rRANKL (100 ng/ml) sve dok se nisu formirali zreli osteoklasti. Osteklasti su zatim tretirani različitim koncentracijama CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)48 sati prije fiksiranja sa 4 posto paraformaldehida, permeabiliziranje sa 0.1 posto Triton X‐100–PBS i blokiranje sa 3 posto goveđeg serumskog albumina u PBS. Pripremljene ćelije su inkubirane sa faloidinom konjugovanim rodaminom 45 minuta u mraku da bi se obojene na F-aktin. Ćelije su zatim isprane PBS-om, jezgre su obojene sa 4′,6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) i postavljene pokrovnim stakalcima za konfokalnu mikroskopiju.

cistanche iskustvo

2.6|Test resorpcije hidroksiapatita

Za mjerenje aktivnosti osteoklasta, BMM (1 × 105 ćelija po jažici) kultivirani na pločama obloženim kolagenom sa šest jažica (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) stimulirani su sa GST-rRANKL (100 ng/ml) i M-CSF (50 ng/ ml) dok se ne generišu zreli osteoklasti (Zhou et al., 2016). Ćelije su zatim lagano odvojene od ploče upotrebom rastvora za disocijaciju ćelija (Sigma-Aldrich) i jednak broj zrelih osteoklasta je zasejan u pojedinačne jažice u pločama sa 96 jažica obloženim hidroksiapatitom (Corning Osteoassay, Corning, NY). Zreli osteoklasti su inkubirani u mediju koji sadrži GST-rRANKL i M-CSF sa ili bez CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)u naznačenim koncentracijama. Nakon 48 sati, polovina jažica je imunohistohemijski obojena na aktivnost TRAcP, kao što je gore opisano, da bi se procijenio broj višenuklearnih ćelija po jažici. Preostale jažice su izbijeljene 10 minuta da bi se uklonile ćelije i omogućilo mjerenje resorbiranih područja. Resorbirana područja su fotografirana pod standardnom svjetlosnom mikroskopijom, a softver Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) je korišten za kvantifikaciju procentualne površine hidroksiapatitne površine koju resorbiraju osteoklasti.

2.7|Luciferazni reporterski testovi

Da bi se istražila aktivacija transkripcije NFATc1, ćelije RAW264.7 su stabilno transficirane sa NFATc1 odgovornim reporterskim konstruktom luciferaze (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transficirane ćelije su uzgajane u pločama sa 48 jažica pri gustini od 1,5 × 105 ćelija po jažici i prethodno tretirane različitim koncentracijama CDP-a.(Cistanchedeserticolapolisaharid)za 1 h. Nakon prethodnog tretmana, ćelije su stimulisane sa GST-rRANKL (100 ng/ml) tokom 24 sata, a aktivnost luciferaze je merena korišćenjem sistema luciferazne reporterske analize prema protokolu proizvođača (Promega).

2.8|Kvantitativna analiza lančane reakcije reverzne transkripcije-polimeraze (RT-PCR).

Ukupna RNK je izolirana iz ćelija pomoću Trizol reagensa prema protokolu proizvođača (Thermo Fisher Scientific). Komplementarna DNK je sintetizirana korištenjem reverzne transkriptaze virusa Moloney mišje leukemije sa 1 ug RNA šablona i oligo-dT prajmera. Pomnožavanje specifičnih sekvenci lančanom reakcijom polimeraze izvedeno je pomoću sljedećeg programa: 94 stepena u trajanju od 5 minuta, nakon čega slijedi 30 ciklusa od 94 stepena u trajanju od 40 s, 60 stupnjeva u trajanju od 40 s i 72 stepena u trajanju od 40 s, te završni korak proširenja 5 min na 72 stepena. Detaljne informacije o specifičnim prajmerima prikazane su u Tabeli 1. Relativni nivoi glasničke RNK su izračunati normalizacijom na ekspresiju gena za održavanje Hmbs.

2.9|Western blot analiza

BMM su kultivisani u kompletnoj podlozi sa M-CSF u pločama sa šest jažica i stimulisani sa GST-rRANKL (100 ng/ml) za navedena vremena. Ćelije su lizirane u radioimunoprecipitacionom puferu za lizu, a proteini su razdvojeni elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela i prebačeni na poli(viniliden fluorid) membrane (GE Healthcare, Silverwater, Australija). Membrane su blokirane u 5-postotnom obranom mlijeku 1 sat, a zatim ispitane različitim specifičnim primarnim antitijelima uz lagano mućkanje preko noći na 4 stepena. Membrane su isprane i potom inkubirane sa sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena. Reaktivnost antitijela je zatim detektirana s pojačanim hemiluminiscencijskim reagensom (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i vizualizirana pomoću Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Intracelularna detekcija ROS-a

Intracelularni nivoi ROS detektovani su korišćenjem 2′,7′-dihlorofluorescein diacetat ćelijskog ROS testnog kita (Abcam, Melburn, Australija). BMM (5 × 103 ćelije po jažici) su uzgajane u pločama sa 96 jažica i tretirane sa RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) i CDP tokom 72 sata. Intracelularni nivoi ROS-a mjereni su korištenjem 2′,7′-dihlorofluorescein diacetata, koji oksidira u fluorescentni DCF u prisustvu ROS-a. Ćelije su isprane u Hankovom puferu i inkubirane u mraku 30 minuta sa 10 µM DCFH-DA. Slike su dobijene konfokalnom mikroskopom.

2.11|Statističke analize

Svi podaci su reprezentativni za najmanje tri eksperimenta izvedena u tri primjerka osim ako nije drugačije naznačeno. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Jednosmjerna analiza varijanse praćena Student-Newman-Keulsovim post hoc testovima korištena je za određivanje značajnosti razlika između rezultata, pri čemu se p < 0.05="" smatra="">

3|REZULTATI

3.1|CDP inhibira RANKL-indukovanu osteoklastogenezu i fuziju osteoklasta

Da bi se utvrdilo da li je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)može potisnuti formiranje osteoklasta izazvano RANKL, prvo smo izveli test osteoklastogeneze koristeći mišje BMM (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM su tretirani RANKL i M-CSF tokom 5 dana uz povećanje koncentracije CDP. CDP je smanjio broj TRAcP-pozitivnih višenuklearnih ćelija kada je koncentracija CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)dostigao 5 µM ili više (Slika 1a,b). Za procjenu CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)toksičnosti i potvrdili da ovi rezultati nisu odraz smrti ili broja ćelija, izvršili smo MTS test. BMM su tretirani RANKL i M-CSF tokom 48 sati uz različite doze CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid). CDP nije imao efekta na proliferaciju BMM u koncentraciji od 15 µM ili manje (Slika 1c).

Testirati efekte CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)na fuziji osteoklasta, osteoklasti su inducirani tretmanom RANKL i M-CSF, sa ili bez različitih doza CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid). Osteoklasti su obojeni rodamin-faloidinom i DAPI kako bi se procijenio broj jezgara po osteoklastu (Slika 2a). I broj osteoklasta i prosječan broj jezgara po osteoklastu smanjili su se nakon CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)tretman (5-10 µM; Slika 2b,c). Dakle, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)imao inhibitorne efekte na osteoklastogenezu izazvanu RANKL-om i fuziju osteoklasta na način ovisan o dozi.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)smanjuje aktivnost resorpcije osteoklastičnog hidroksiapatita izazvanu RANKL

Proveden je test resorpcije hidroksiapatita da bi se otkrio učinak CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)na funkciju osteoklasta (slika 3a). Nakon inkubacije od 24 sata, broj osteoklasta po jažici se nije promijenio dok je područje resorpcije hidroksiapatita značajno smanjeno tretmanom sa 5 i 10 µM CDP u poređenju sa kontrolnim grupama (Slika 3b,c). Ovi rezultati pokazuju da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)ima snažne inhibitorne efekte i na formiranje osteoklasta i na aktivnost resorpcije osteoklasta bez ikakvih citotoksičnih efekata.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)inhibira ekspresiju gena markera osteoklasta

Da bi se dalje istražili inhibitorni efekti CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)na osteoklastogenezu i osteoklastičnu resorpciju kosti, BMM su tretirani RANKL i M-CSF 5 dana s različitim koncentracijama CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid). Zatim je izveden RT-PCR da bi se otkrila ekspresija gena markera osteoklasta. CDP je inhibirao ekspresiju Nfatc1, ključnog faktora transkripcije tokom osteoklastogeneze.(Cistanchedeserticolapolisaharid)na način ovisan o dozi (slika 4a). Osim toga, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)(5 i 10 µM) smanjili su ekspresiju gena povezanih sa resorpcijom kostiju, uključujući Mmp9, Ctsk i Acp5 (Slika 4b-d).

3.4|CDP potiskuje aktivnost NFATc1 i ekspresiju proteina nizvodno

Ispitati efekat CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)na RANKL-indukovanu aktivnost NFATc1, izvršen je test reportera luciferaze. Liječenje CDP-om(Cistanchedeserticolapolisaharid), pri koncentracijama od 5 µM i više, značajno inhibirao RANKL-indukovanu aktivnost NFATc1 (Slika 5a). Osim toga, western blot analiza je pokazala da je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)značajno potisnuta ekspresija proteina NFATc1 i c-Fos u BMM tretiranim RANKL i M-CSF tokom 3 i 5 dana (Slika 5b). Štaviše, ekspresija proteina povezanih sa funkcijom osteoklasta, kao što su V-ATPaza-d2 i CTSK, bila je smanjena u prisustvu CDP-a.(Cistanchedeserticolapolisaharid)u poređenju sa kontrolnim grupama. Međutim, CDP nije imao uticaja na ekspresiju RANK (Slika 5b).

3.5|CDP podstiče ekspresiju antioksidativnih enzima za uklanjanje proizvodnje ROS-a tokom osteoklastogeneze izazvane RANKL-om

Da bi se istražio osnovni mehanizam inhibicije osteoklastogeneze zavisne od CDP, BMM su tretirani RANKL (100 ng/ml) i M-CSF (50 ng/ml) zajedno sa PBS ili CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)za 72 h. Ispitivali smo efekat CDP-a na intracelularnu proizvodnju ROS-a stimulisanu RANKL-om. Intracelularni nivoi ROS su povećani RANKL tretmanom, koji je oslabljen CDP-om (5 i 10 µM; Slika 6a). I broj ROS-pozitivnih ćelija i intenzitet ROS bojenja smanjeni su CDP tretmanom na način ovisan o dozi (Slika 6b,c). Western blot analiza je pokazala da je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)promovira ekspresiju tioredoksina (TRX1) i glutation reduktaze (GSR) dok supresira ekspresiju inducibilne sintaze dušikovog oksida (NOS2) u BMM koji su tretirani RANKL i M-CSF 3 dana (slika 6d).

Za dalje istraživanje da li je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)potisnuli diferencijaciju osteoklasta smanjenjem proizvodnje ROS-a, zatim smo tretirali BMM peroksidom (10 µM) kako bismo imitirali visoki status ROS-a u stanicama. BMM su inducirani RANKL i M-CSF tokom 3 dana, a rezultati Western blot analize i RT-PCR pokazali su da peroksid podstiče ekspresiju NFATc1 i c-Fos u poređenju sa kontrolnim grupama. U skladu sa rezultatima na slici 5, ekspresija NFATc1 i c-Fos je potisnuta CDP-om(Cistanchedeserticolapolisaharid)dok je peroksid spasio inhibitorni efekat CDP (Slika 6e,f). Ovi podaci ukazuju na to da je CDP potisnuo ekspresiju NFATc1 i c-Fos uništavajući proizvodnju ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)potiskuje MAPK puteve tokom osteoklastogeneze izazvane RANKL

Zatim smo istražili efekat CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)tretman na ekspresiju TRAF6 posredovanu RANKL i aktivaciju MAPK puta. Nakon inkubacije u mediju bez seruma tokom 2 sata, BMM su stimulirani RANKL-om, sa ili bez CDP-a, tokom 60 minuta. Stimulacija sa CDP (10 µM) nije imala efekta na ekspresiju TRAF6 i oslabila je fosforilaciju JNK2 i ERK1/2 na 10 i 20 minuta (Slika 7). Dodatno, fosforilacija p38 je značajno inhibirana CDP-om(Cistanchedeserticolapolisaharid)tretman od 60 minuta u poređenju sa kontrolnim grupama (Slika 7). Ovi podaci otkrivaju da je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)potiskuje RANKL-inducirane MAPK signalne puteve, u skladu s njegovim inhibitornim učinkom na formiranje i aktivnost osteoklasta.

4|DISKUSIJA

Cistanche, poznat kao "pustinjski ginseng", nedavno je privukao veliku pažnju zbog svoje sposobnosti da modulira imunitet i djeluje zaštitno tokom starenja i oksidativnog stresa (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Pokazalo se da glikozidi supstituirani fenilpropanoidom, glavne aktivne komponente Cistanchea, inhibiraju aktivnost NO u makrofagima (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Osim toga, aCistancheEkstrakt smanjuje oksidativni stres u reperfuziranom miokardu nakon ishemije i igra značajnu ulogu u inhibiciji apoptotičkih puteva koji vode do kardioprotekcije (Yu, Li, & Cao, 2016). Kao važna komponenta Cistanchea, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)ima različite farmakološke funkcije. Naša trenutna studija je otkrila da CDP potiskuje RANKL-aktiviranu diferencijaciju i aktivaciju osteoklasta slabljenjem proizvodnje ROS-a, kao i aktivacije NFAT i MAPK.

Kao kisela fosfataza, TRAcP postoji u različitim ćelijama i obiluje osteoklastima i alveolarnim makrofagima (Snipes, Lam, Dodd, Grey, & Cohen, 1986). TRAcP je karakterističan enzim za osteoklaste i njegova ekspresija je usko povezana sa funkcijom osteoklasta, smatra se indikatorom aktivnosti osteoklasta i resorpcije kosti (Minkin, 1982). U našoj studiji, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)inhibirao broj TRAcP-pozitivnih ćelija, što ukazuje da je RANKL-indukovana osteoklastogeneza blokirana CDP-om(Cistanchedeserticolapolisaharid). Degradacija koštanog matriksa osteoklastima zavisi od katepsina K (CTSK) i MMP (Gruber, 2015). Ovdje je CDP značajno smanjio ekspresiju funkcionalnih gena osteoklasta kao što su Mmp9, Ctsk i Acp5.

Diferencijacija i funkcija osteoklasta regulirani su višestrukim signalnim putevima (Boyle, Simonet i Lacey, 2003). Nakon vezivanja za RANK, RANKL regrutuje adapterski protein TRAF6 da aktivira ekspresiju NFATc1, koji je važan faktor transkripcije za formiranje osteoklasta, koji utiče na ekspresiju gena specifičnu za osteoklaste, uključujući TRAcP i CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). U ovoj studiji smo otkrili da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)nije imao efekta na ekspresiju RANK i TRAF6 u osteoklastima. Međutim, CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)inhibirao RANKL-indukovanu aktivaciju NFATc1 tokom osteoklastogeneze BMM. Osim toga, pokazano je da ROS, proizveden od mitohondrija u procesu isporuke elektrona, potiče proliferaciju i diferencijaciju osteoklasta i regulira degradaciju koštanog matriksa (Ha et al., 2004). Nedavna studija je otkrila da je RANKL inducirao Bach1 nuklearni uvoz i oslabio proizvodnju antioksidantnog enzima posredovanu Nrf2, čime je povećao intracelularnu ekspresiju ROS i osteoklastogenezu kod miševa (Kanzaki et al., 2017). Osim toga, povećano intracelularno stvaranje ROS-a od strane homocisteina pojačalo je formiranje i aktivnost osteoklasta (Koh et al., 2006). Naša studija je otkrila da CDP smanjuje akumulaciju ROS u osteoklastima inhibirajući ekspresiju NOS2 i promovirajući ekspresiju antioksidativnih enzima, kao što su TRX1 i glutation reduktaza. Kada smo tretirali BMM peroksidom kako bismo poboljšali intracelularnu akumulaciju ROS-a, rezultati da povećani ROS može poboljšati ekspresiju NFATc1 otkrili su da je ROS uzvodno od NFATc1. Takođe smo otkrili da je peroksid spasio inhibitorni efekat CDP na ekspresiju NFATc1. Dakle, naši podaci sugeriraju da CDP potiskuje akumulaciju ROS kako bi inhibirao ekspresiju NFATc1, a zatim da bi potisnuo formiranje i funkciju osteoklasta.

ERK, JNK i p38 pripadaju porodici MAPK, koja je takođe uključena u regulaciju diferencijacije osteoklasta (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktivira MAPK put povećanjem fosforilacije ERK, JNK i p38 (Mizukami et al., 2002). Pokazali smo da je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)potisnu RANKL posredovanu fosforilaciju ključnih proteina u MAPK putu, doprinoseći tako inhibitornom efektu CDP-a na ekspresiju gena markera osteoklasta. Koliko znamo, ovo je prva studija koja pokazuje inhibitorne efekte CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)o proizvodnji ROS, aktivaciji NFAT i MAPK, što predstavlja nove mehanizme djelovanja CDP in vitro.

Ukratko, pokazali smo da je CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)ublažava osteoklastogenezu i resorpciju hidroksiapatita, te ekspresiju gena markera osteoklasta uključujući Ctsk, Mmp9 i Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)bio u stanju da potisne RANKL posredovanu ROS proizvodnju, kao i aktivaciju NFAT i MAPK (Slika 8). Zbirno, naši rezultati sugeriraju da CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)može predstavljati lijek kandidata za liječenje stanja povezanih s osteoklastima praćenih prekomjernom proizvodnjom ROS.

SLIKA 8 Šematski dijagram CDP-a(Cistanchedeserticolapolisaharid)funkcija u diferencijaciji osteoklasta. CDP(Cistanchedeserticolapolisaharid)potiskuje proizvodnju ROS-a izazvanu RANKL-om, kao i aktivaciju NFATc1 i MAPK, čime inhibira osteoklastogenezu. CDP,Cistanchedeserticolapolisaharida; MAPK, protein kinaza aktivirana mitogenom; NFATc1, nuklearni faktor aktivirane T ćelije; RANKL, receptorski aktivator liganda nuklearnog faktora κB; ROS, reaktivne vrste kiseonika [slika u boji može se pogledati na wileyonlinelibrary.com]

ZAHVALNICA

Ovu studiju podržali su Kineska fondacija za nauku o prirodi (81572164), Nacionalni program za istraživanje i razvoj ključnih tehnologija Kine (2017YFC1103300), Fondacija za prirodne nauke provincije Guangxi (2016GXNSFAA380295) i Univerzitetski istraživački projekat nauke i tehnologije Guangxi Pokrajina (KY2015YB054). Također je djelimično podržan od strane Projekta plana razvoja naučnih istraživanja i tehnologije Guangxi (GKG13349003, 1598013‐15), Fonda za infrastrukturu za medicinska i zdravstvena istraživanja Zapadne Australije, Fondacije za artritis Australije, Nagrade za istraživačku saradnju Univerziteta Zapadne Australije (UWA) i Australsko vijeće za zdravstvo i medicinska istraživanja (NHMRC, br. 1107828 i 1027932).

SUKOB INTERESA

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa

Od: 'Cistanchedeserticolapolisaharidaumanjuje osteoklastogenezu i resorpciju kosti inhibirajući RANKL signalizaciju i proizvodnju reaktivnih vrsta kiseonika od strane Dezhi Songa i sur.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684