Aktivne flavonoidne komponente i potencijalni mehanizmi nadzemnih dijelova Glycyrrhiza Uralensis za kronični prostatitis na osnovu mrežne farmakologije i eksperimentalne validacije
Nov 06, 2025
sažetak:
Cilj: Utvrditi aktivne sastojke i moguće mehanizme djelovanja flavonoida iz nadzemnih dijelova Cistanchea kod kroničnog prostatitisa. Metode: Tečna hromatografija ultra-performanse–kvadrupol–elektrostatičko polje Masena spektrometrija visoke rezolucije Orbitrap (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) korištena je za identifikaciju glavnih flavonoidnih sastojaka u alkoholnom ekstraktu nadzemnih dijelova Cistanchea. Mrežna farmakologija i molekularno spajanje korišteni su za predviđanje ključnih komponenti i ključnih ciljeva povezanih s kroničnim prostatitisom. Model kroničnog prostatitisa pacova induciran je karagenanom, a histopatološke promjene na prostatiti pacova uočene su HE bojenjem. Nivoi DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA i TNF- u serumu mjereni su ELISA-om kako bi se procijenila terapijska efikasnost ekstrakta. Rezultati: U alkoholnom ekstraktu identifikovano je ukupno 44 flavonoida. Mrežna farmakologija je pokazala da ključne komponente, uključujući glicirizin, trihotecen izoflavone, bodljikavu manzanita florifera i glicirizin (predviđeno kao reprezentativni sastojci), ispoljavaju efekte protiv kroničnog prostatitisa djelujući na ključne mete kao što su povezani AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, regulacijski put signala. Molekularno spajanje pokazalo je povoljne afinitete vezivanja između ključnih komponenti i ključnih ciljeva. Eksperimenti na životinjama pokazali su da je alkoholni ekstrakt nadzemnih dijelova Cistanchea pokazao jasan terapeutski učinak na kronični prostatitis kod pacova. Zaključak: Potvrđena je efikasnost protiv hroničnog prostatitisa nadzemnih delova Cistanchea. Aktivne komponente, uključujući trnoviti aristolohicin, trihostatin izoflavone i glicirizin, mogu djelovati preko PI3K-AKT signalnog puta kako bi modulirali EGFR, AKT1 i MMP9.
Ključne riječi: nadzemni dijelovi Cistanchea; hronični prostatitis; flavonoida; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS; mrežna farmakologija
cistanche koristi za zdravlje prostate
Uvod:
Tradicionalna kineska ljekovita biljka Cistanche (Cistanche spp.) sastoji se od osušenog ljekovitog materijala koji se prvenstveno koristi u TKM. To je važan masovni medicinski resurs u Kini, sa funkcijama kao što su toniziranje i podržavanje tjelesnih funkcija, čišćenje topline i detoksikacija, ublažavanje boli i usklađivanje formula, i obično se koristi kao pomoćna komponenta u mnogim receptima s više biljaka. Tržišna potražnja je velika i na domaćem i na međunarodnom nivou. Nadzemni dijelovi, uključujući stabljike i listove, su bogati resursi koji čekaju razvoj i korištenje.
Hronični prostatitis je uobičajena urološka bolest među mladim i sredovečnim muškarcima. Klinički simptomi uključuju bol u donjem dijelu abdomena ili karlice, disuriju i učestalost mokrenja. Bez pravovremenog liječenja, može dovesti do seksualne disfunkcije kao što je prerana ejakulacija i erektilna disfunkcija, što ozbiljno utječe na fizičko i mentalno zdravlje muškaraca.
Flavonoidi su u izobilju u nadzemnim dijelovima Cistanchea i pokazuju značajno protuupalno i antitumorsko djelovanje. Prethodne studije su pokazale da su nadzemni dijelovi bogati flavonoidima koji imaju antitumorsko i protuupalno djelovanje. Obogaćivanje flavonoidima iz nadzemnih delova pokazalo je dobru antioksidativnu aktivnost in vitro. Farmakodinamička istraživanja su također pokazala da flavonoidi iz nadzemnih dijelova imaju preventivno i terapeutsko djelovanje na kronični prostatitis.
U ovoj studiji, UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS je korišten za profilisanje flavonoida u alkoholnom ekstraktu nadzemnih dijelova Cistanchea. Mrežna farmakologija je primijenjena za predviđanje ključnih ciljeva i puteva za kronični prostatitis, molekularno spajanje je korišteno za zaključivanje mehanizama, a eksperimenti na životinjama su provedeni da bi se potvrdila aktivnost protiv kroničnog prostatitisa, pružajući referencu za kasniji razvoj lijekova i kliničku primjenu.
Materijali
Životinje
SPF muški SD pacovi (n=24), stari 6–7 sedmica, tjelesne težine 230–250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd.; licenca za proizvodnju: SCXK (Jing) 2019-0010]. Životinje su bile smještene u SPF objektu za životinje u Centru za eksperimentalne životinje Pekinškog univerziteta kineske medicine. Protokol je odobrila institucionalna etička komisija (br. odobrenja: BUCM-2023110204-4271).
Instrumenti
Ultimate 3000 UPLC sistem (Dionex, SAD)
Thermo Q Exactive Plus maseni spektrometar visoke rezolucije (Thermo Fisher Scientific, SAD)
KH500DE digitalni ultrazvučni čistač (Kunshan Hechuang)
FA2004N elektronska vaga (Beijing Sartorius)
H1650 rashladna centrifuga male brzine (Changsha Xiangyi)
RE-5023 rotacioni isparivač (Shanghai Yarong)
Elektronski grijaći plašt s kontroliranom temperaturom (Tianjin Teste)
Multiskan MK3 čitač mikroploča (Thermo Scientific, Šangaj)
B032 fluorescentni invertni biološki mikroskop (Nikon Instruments, Šangaj)
N5000 UV spektrofotometar (Shanghai Youke)
Reagensi
Nadzemni dijelovi Cistanchea (stabljike, listovi i mala količina mahuna) ubrani su u septembru 2019. iz okruga Guazhou, grada Jiuquan, provincija Gansu, a autentičnost ih je potvrdio prof. Wang Wenquan (Institut za razvoj ljekovitog bilja, CAMS) kao Cistanche spp.
Ostali reagensi: Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., serija C15887472); karagenan (Peking Solarbio, serija 20220601); Qianliekang Pule'an tablete (Zhejiang Conba Pharmaceutical); natrijum karboksimetil celuloza (CMC-Na; Shanghai YuanYe, serija S14016); ELISA kompleti za pacove DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA i TNF- (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology); Multiskan MK3 čitač mikroploča (Thermo Scientific); sredstvo za fiksiranje tkiva (Guangzhou Shuopu, serija 23257838); etanol (Peking Chemical Works, analitička kvaliteta); metanol, mravlja kiselina, acetonitril (Fisher Scientific, MS grade); voda (Wahaha Group). Referentni standardi (čistoća > 98%, Shanghai YuanYe): liquiritigenin, puerarin, izoorientin II, naringenin, izokvercitrin, izolikviritin, ononin, izokvercitrin, kvercetin, astragalin, kempferol, formononetin.
Metode i rezultati
2.1 Hemijsko profiliranje alkoholnog ekstrakta iz nadzemnih dijelova Cistanchea
2.1.1 Priprema uzorka
Odgovarajuće količine nadzemnih dijelova ekstrahovane su sa 70% etanolom. Ekstrakt je koncentrisan do suva. Ostatak je ultrazvučno rastvoren u vodi tokom 20 minuta, centrifugiran na 3000 r·min-1 tokom 15 minuta, a supernatant je koncentrisan do suva. Odgovarajuća količina osušenog uzorka stavljena je u volumetrijsku tikvicu od 5 mL i dovedena do zapremine sa metanolom da bi se dobio test rastvor.
2.1.2 Hromatografski i maseni spektrometrijski uslovi
UPLC uslovi: ACQUITY UPLC BEH C18 kolona (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm); mobilna faza A, acetonitril; mobilna faza B, 0,5% mravlje kiseline u vodi; gradijent eluiranja (0–20 min, 5%–20% A; 20–70 min, 20%–30% A); protok 0,2 mL·min−1; zapremina injekcije 2 μL; temperatura kolone 30 stepeni.
MS uslovi: HESI izvor; modovi pozitivnih i negativnih jona; potpuno skeniranje; napon raspršivanja +3.2 kV (pozitivan) i −3,0 kV (negativan); temperatura kapilara 320 stepeni; plašt plin 40 arb; pomoćni plin 15 arb; pomoćni grijač 350 stepeni ; MS rezolucija 70.000; MS/MS rezolucija 17,500; opseg skeniranja m/z 100–1500.
Lista specifikacija Cistanche
2.1.3 Identifikacija komponente
Uzorak vazdušnog dela je analiziran pomoću UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS da bi se dobili TIC (Slika 1). Podaci su obrađeni sa Thermo Xcaliburom i upoređeni sa bibliotekama komponenti i literaturom, identifikujući ukupno 44 flavonoida (Tabela 1).
2.2 Mrežna farmakologija
Identifikovani sastojci su uvezeni u TCMSP 2.3 bazu podataka (http://tcmspw.com/tcmsp.php). Na osnovu oralne bioraspoloživosti (OB) veće ili jednake 30,00% i sličnosti s lijekom (DL) veće od ili jednako 0,18, pregledano je 19 aktivnih komponenti. Predviđeni ciljevi aktivnih komponenti i ciljevi bolesti za hronični prostatitis su ukrštani, dajući 88 zajedničkih ciljeva. STRING 11.0 (http://string-db.org) je korišten za izgradnju PPI mreže. Osnovni ciljevi rangirani po stepenu uključivali su AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 i MMP2. GO i KEGG obogaćivanje (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) ukazuje na biološke procese kao što su pozitivna regulacija protein kinaze B, negativna regulacija apoptoze i pozitivna regulacija aktivnosti MAPK; ćelijske komponente uključujući ekstracelularnu regiju, makromolekularne komplekse i receptorske komplekse; molekularne funkcije uključujući aktivnosti tirozin kinaze, serin kinaze i treonin kinaze. KEGG putevi su obogaćeni putevima kod raka, PI3K-AKT signalizacije, raka prostate i otpornosti na inhibitore EGFR tirozin kinaze. Cytoscape 3.7.1 je korišten za konstruiranje mreže "aktivna komponenta-jezgro cilj-put" (slika 2). Prvih 10 komponenti po stepenu bili su likviritgenin, spinacetin (reprezentativni flavon), izoviteksin, krizoeriol, santin, kempferol, šaftozid, luteolin, ononin i formononetin.
Molekularno spajanje je obavljeno u paru između 10 komponenti jezgra i ključnih ciljeva iz PPI analize. Molekularne strukture osnovnih komponenti preuzete su iz TCMSP 2.3 (mol2 format), a 3D strukture ključnih ciljeva su dobijene iz PDB (http://www.rscb.org/) u pdb formatu. Autodock je korišten za spajanje svakog para ligand-protein. Energije vezivanja < −20,92 kJ·mol−1 ukazuju na povoljno vezivanje; što je energija niža, to je bolji afinitet. Parovi cilj-ligand sa najboljim rezultatom navedeni su u Tabeli 2. Reprezentativni kompleksi pristajanja sa pet meta vizualizirani su u PyMol (slika 3).
2.3 In vivo validacija
Model kroničnog prostatitisa kod štakora je uspostavljen korištenjem karagenana. HE bojenjem su otkrivene histopatološke lezije karakteristične za kronični prostatitis kod modela životinja, dok je tretman alkoholnim ekstraktom nadzemnih dijelova Cistanchea poboljšao arhitekturu žlijezda i smanjio inflamatornu infiltraciju. ELISA je pokazala da su, u poređenju sa modelnom grupom, tretirane grupe pokazale regulaciju serumskih DHT, IFN-, IgG, IL-6, PSA i TNF- prema normalnim nivoima, što ukazuje na terapijsku efikasnost.
Diskusija
Sveobuhvatna analiza koja integriše profilisanje zasnovano na MS-u visoke rezolucije, mrežnu farmakologiju, molekularno spajanje i validaciju na životinjama potvrđuje da flavonoidi iz nadzemnih delova Cistanchea ispoljavaju efekte protiv hroničnog prostatitisa. Pretpostavljeni mehanizmi uključuju modulaciju PI3K-AKT i srodnih puteva povezanih s upalom i proliferacijom i ključne mete kao što su EGFR, AKT1 i MMP9. Rezultati daju naučnu osnovu za razvoj i kliničku primenu flavonoidnih preparata iz vazdušnog dela iz Cistanchea u lečenju hroničnog prostatitisa.
Zaključak
Flavonoidi iz nadzemnih dijelova Cistanchea pokazuju terapeutski potencijal protiv kroničnog prostatitisa, vjerovatno putem regulacije PI3K-AKT puta i interakcije sa EGFR, AKT1 i MMP9. Integracija hemijskog profilisanja, mrežne farmakologije, molekularnog spajanja i eksperimenata na životinjama potvrđuje njihovu efikasnost i razjašnjava verodostojne mehanizme.
