Kako proučiti genetsku raznolikost Herba Cistanches?

Studija o genetskoj raznolikosti Herba Cistanches od strane RAPD-a

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Institut kineske Materia Medica, Kineska akademija kineske medicine, Peking 100700)

Abstract

svrha:Za proučavanje stanovništvagenetska raznolikostofCistanche deserticolaiCistanche tubulosa.

Metode:Dvije divlje populacijeCistanche deserticolai četiri divlje populacijeCistanche tubulosaanalizirao je RAPD, igenetska raznolikostpopulacija je analizirana softverskom verzijom 1.31 POPGENE-a.

Rezultati:Prosječan procenat polimorfnih lokusaCistanche deserticolaiznosio je 47,37 posto, polimorfni lokusi dvije populacije bili su 39,47 posto i 35,53 posto, a prosječna genska raznolikost Neija bila je 0.135 8. Shannon je bio više. Indeks informacija o statusu je 0.207 2, a koeficijent diferencijacije gena Gst {{1{{20}}}.254 6. Prosječan postotak polimorfnih lokusa u Cistancheu bio je 27,59 posto, a postotak polimorfnih lokusa u svakoj populaciji kretao se od 19,54 posto do 25,29 posto, od čega je Andier populacija imala najviših 25,29 posto, a prosječna Neijeva genska raznolikost bila je 0. {21}}, Shanonov indeks informacija o polimorfizmu je 0,1258, koeficijent diferencijacije gena Gst =0.175 5.

zaključak:Cistanche deserticolaiCistanche tubulosaimaju određenu diferencijaciju među populacijama. Thegenetska raznolikostDesert Cistanche je znatno viši od Cistanche tubulosa i diferencira se u dva ekotipa.

Ključne riječi: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetska raznolikost

[Klasifikacioni broj Kineske biblioteke] S 567 [Identifikacioni kod dokumenta] A [Broj artikla] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche je parazitska biljka koja pripada rodu Cistanche iz porodice Lidanaceae, poznata i kao Dayun, koja je dragocjeni kineski medicinski materijal. Glavni izvor biljke Cistanche deserticola u mojoj zemlji suCistanche deserticolaYCMa i C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Biljke domaćini Cistanche deserticola su Haloxylon ammodendron i Haloxylon ammodendron, koje su uglavnom rasprostranjene u Alashan ligi u Unutrašnjoj Mongoliji, sjevernom Xinjiangu, Qinghaiu, Gansuu i drugim mjestima. Rasprostranjenost Cistanche deserticola je ista kao i kod biljaka domaćina. U mojoj zemlji, Cistanche cistanche je rasprostranjen samo u okruzima oko pustinje Taklimakan južno od planine Tianshan u Xinjiangu, a njegova distribucija nije u potpunosti sinkronizirana s domaćinom Tamarixom. Druge regije kao što su sjeverni Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Unutrašnja Mongolija, Shaanxi i druga mjesta Tamarix biljaka nisu parazitske Cistanche Tubula[2]. Zbog brzog povećanja potražnje za cistancheom u posljednjih nekoliko godina, što je rezultiralo izumiranjem njegovih resursa, resursi divlje cistanche su se smanjili na samo nekoliko glavnih proizvodnih područja. Obje su navedene kao ugrožene zaštićene biljne vrste u mojoj zemlji [3], među kojimaCistanche deserticolaje uključen u CITES Dodatak II [4].

Nakon nekoliko godina istraživanja, istraživanja o vještačkom uzgoju cistanche su uspješna iu fazi su velike promocije i sadnje. Međutim, kako spriječiti propadanje vrsta Cistanche tokom industrijske proizvodnje, kako obnoviti ograničenu divlju populaciju što je prije moguće i očuvati dragocjene resurse divlje germplazme, ključ su za postizanje njenog održivog korištenja. Što se tiče zaštićene baštine Cistanche [Datum prijema], 2004-03-11 [Projekat Fonda] Projekat socijalne zaštite Ministarstva nauke i tehnologije (2001.109); Projekat "Deseti petogodišnji plan" Ministarstva nauke i tehnologije (2001BA701A09a) [Autor za dopisivanje] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Studija prenosa je još uvijek prazno. Ova studija koristi RAPD tehnologiju za proučavanje 2 divlje populacijeCistanche deserticolai 4 divlje populacijeCistanche tubulosa, i analizirati oba Razlika ugenetska raznolikostočekuje se da će pružiti važnu eksperimentalnu genetsku osnovu za zaštitu Cistanchea, dragocjenog kineskog lijeka.

cistanche

1. Materijal i metode

1.1 Materijali

Cistanche deserticolaprikupljen je iz okruga Jimsar u Xinjiangu i oblasti Jilantai u Drevnoj Alxa ligi u Unutrašnjoj Mongoliji. Populacije Cistanchea prikupljene su iz okruga Minfeng i okruga Yutian, Xinjiang. Okrug Minfeng je trenutno područje s najvećim prinosom Cistanche cistanche, s najvećom gustinom i relativno cjelovitim zajednicama prirodnih šuma. Točke uzorkovanja Andil, Sawuzek, Yatongguz i Daheyan okruga Yutian su glavna proizvodna područja, koja se nalaze u rijeci Andir, rijeci Yeyike, rijeci Yatongguzi i Kelaniya U donjem toku rijeke, udaljenost između populacija je veća od 50 km. Svaka populacija nasumično je uzorkovala 19-30 pojedinaca. Uzorci su brzo osušeni u silika gelu i korišteni za ekstrakciju DNK (Tabela 1).

Tabela 1. Uzorkovanje populacije i proizvodna područja Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa

1.2 Ekstrakcija DNK

Metoda ekstrakcije ukupne DNK koristi metodu visoke soli i niskog pH [5]. Uzorak DNK je podvrgnut spektrofotometru da bi se otkrila koncentracija DNK šablona, ​​zatim je za RAPD analizu korištena elektroforeza u 1 posto agaroznom gelu, EB bojenje, promatranje i fotografiranje pod ultraljubičastim svjetlom, elektroforezna DNK sa čistim trakama i manje repa.

1.3 Skrining RAPD prajmera

Pošto je eksperimentom utvrđeno da isti prajmer ima nezadovoljavajući učinak na istovremeno pojačanje obaCistanche deserticolai Cistanche tubulosa, prajmeri su pregledani nezavisno. 150 nasumičnih prajmera (10 bp), 25 μL reakcijskog sistema Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. korišćeno je za amplifikaciju i skrining; svaki prajmer je koristio 2 šablona populacije i 1 sterilisanu dvostruko destilovanu vodu kao praznu kontrolu, i dobio je 10 prajmera za amplifikaciju Cistanche deserticola sa jasnim trakama, jakim polimorfizmom i dobrom ponovljivošću: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 prajmeraCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 PCR amplifikacija i detekcija proizvoda

Odabrani prajmeri su korišteni za amplifikaciju DNK šablonaCistanche deserticolaiCistanche tubulosapomoću PCR. Genomska DNK je razrijeđena na 50 ng·μL -1 prema izmjerenoj koncentraciji kao šablon. Ukupna zapremina reakcije je 25 μL, od čega 10 × PCR pufer 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP mješavina (svaki 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, šablon DNK 1 μL, sterilisana dvostruko destilovana voda 18,8 μL, gornji rastvor za PCR amplifikacija je proizvod Shanghai Sangona. Pojačavanje je izvedeno na PTC-100 termalnom ciklusu. Program amplifikacije je bio preddenaturacija od 94 stepena u trajanju od 5 minuta, a zatim 40 ciklusa. Svaki ciklus je uključivao 94 stepena 45 s, 34 stepena 1 min, 72 stepena 1 min 30 s, i konačno produžiti na 72 stepena za 5 min. Amplificirani proizvodi su podvrgnuti elektroforezi na 2,0 postotnom agaroznom gelu (koji sadrži EB) u 1×TAE puferu i posmatrani i fotografisani pod SYNGENE gel sistemom za snimanje.

1.5 Statistika i analiza podataka

U spektru elektroforeze, odgovarajući položaj produkta reakcije na gelu se upoređuje prema standardu molekulske težine i procjenjuje se molekulska težina pojačanog proizvoda. Opseg sa opsegom se bilježi kao 1, a opseg bez pojasa se snima kao 0, formirajući matrični graf 0/1 i unoseći u računar, koristeći POPGENE32 za izračunavanje postotka polimorfnih mjesta (PPL) svake populacije, Neijev indeks genske raznolikosti (H), Shanonov indeks informacija o polimorfizmu (I), koeficijent diferencijacije gena (Gst), genska raznolikost (Ht),Genetska raznolikost(Hs), Neijev (1978) genetski identitet (I) i genetička udaljenost (D) unutar populacije, a klaster analiza je izvršena korištenjem UPGMA metode.

2. Rezultati i analiza

2.1 Genetička raznolikost Cistanchea

Svi uzorci su dobili trake molekularne težine u rasponu od 200 do 2 200 bp (Slika 1, 2). Ukupno je otkriveno 76 lokusa u 60 uzoraka iz 2 populacijeCistanche deserticola, od kojih su 36 bili polimorfni lokusi, koji su činili 47,37 posto , H=0.135 8, I=0.207 2. Među njima, Jimsarov PPL iznosi 39,47 posto, a Gilantyjev 35,53 posto. H je 0. 0 95 3 i 0.1 070 redom, a ja sam 0.15 12 i 0.163 7 redom. Ukupno je otkriveno 87 lokusa kod {{20}} pojedinaca iz 4 populacije Cistanchea, od kojih su 24 polimorfni lokusa, što čini 27,59 posto , H=0.084 8, I=0.1278. Najveći PPL bio je Andil sa 25,29 posto, dok je PPL bio niži u Savuzeku i Yatungusiju (oba 19,54 posto). H je 0.062 1 -0.080 0, ja je 0.095 0 -0.116. Veličina H i I je u skladu s trendom veličine PPL svake populacije, a koeficijenti su najveći u Andieru, a zatim u Dajanu. U slučaju istog PPL-a, Savuzekov H=0.{{40}} Zbroj I=0.097 0 je nešto veći od 0.{{44 }} i 0.095 0 od Yatunguske (Tabela 2).

Slika 1 RAPD pojačane trake nekih uzoraka pustinjeCistanche deserticola, primer S490 1-10. Garantie samples; 11-20. Jimpster uzorci M-DNK markera (200 - 2 000 bp)

Slika 2 RAPD pojačane trake nekih uzoraka Cistanche Tubulosa, prajmer S2 042 1-20. Xinjiang Andier uzorak M-DNK markera (200 - 2 000 bp)

Tabela 2 Thegenetska raznolikostofCistanche deserticolaiCistanche tubulosapopulacije

2.2 Analiza genetske varijacije Cistanchea

Prema nivou odgenetska raznolikostu populacijama (Hs), diferencijaciji između populacija (Dst) i udjelu genetskih razlika između populacija u ukupnim genetskim razlikama (Gst), može se vidjeti da je ukupna genetska raznolikost Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, gdje je Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, od kojih Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabela 3). Gore navedeni rezultati pokazuju da postoji određeni stepen genetske varijacije među populacijama. Varijacije između pustinjskih populacija Cistanche deserticola činile su 25,46 posto ukupnih varijacija, a varijacije populacija Cistanche tubulosa činile su 17,55 posto ukupne varijacije.

Tabela 3 Analiza genetskih varijacijaCistanche deserticolaiCistanche tubulosa.

2.3 Genetička udaljenost i analiza klastera među populacijama Cistanche deserticola

Genetska udaljenost dvije populacijeCistanche deserticolaje {{0}}.080 0, a genetski identitet je 0.9231. Genetska udaljenost četiri populacije Cistanchea bila je 0.012 0-0.031 5, a genetski identitet 0.9690-0.988 1 (Tabela 4) . Grupiranje jedinki Cistanche deserticola i cistanche tubulosa pokazuje da se Cistanche deserticola može grupirati u dvije različite grupe prema populaciji, dok različite jedinke cistanche tubulosa ne mogu biti grupirane po populaciji, što također ukazuje da je genetska diferencijacija među Cistanche deserticola populacija je relativno visoka. Velika, ali je genetska diferencijacija među populacijama Cistanche tubulosa mala.

Tabela 4. Genetski identitet (dolje lijevo) i genetska udaljenost (gore desno) odcistanche tubulosa.

3. Diskusija

3.1 Genetička raznolikost Cistanchea

Nivogenetska raznolikostbiljaka neodvojivo od njihovih bioloških karakteristika, staništa, porijekla i evolucije. Među njima najveći uticaj imaju sistem oplemenjivanja, rasprostranjenost, životni oblik i metode širenja polena i sjemena [6]. Prema statističkim rezultatima podataka o alozima za 499 biljnih vrsta u 165 rodova Ge Song et al. [7], polimorfizam Cistanche na nivou vrste trebao bi biti oko 50 posto, a polimorfizam na nivou populacije trebao bi biti oko 40 posto. Oko 0.17. Svi nivoi polimorfizma dobijeni u ovom eksperimentu su niži od ovih prosječnih vrijednosti. Istovremeno, u poređenju sa nivoima polimorfnih lokusa dobijenih RAPD metodama za nekoliko uobičajeno ugroženih biljaka, kao što je 32 posto ugrožene vrste Srebrna jela[18], 22,5 posto patuljastog božura i 27,6 posto ljubičastog božura [9] ] Može se vidjeti da je genetska raznolikost odCistanche deserticola je nešto niže od prosječnog nivoa, dok je genetska raznolikost Cistanche tubulosa već izuzetno niska.

3.2 Razlozi za nisku genetsku raznolikost Cistanchea

Cistanche je specifična parazitska biljka, rasprostranjena u uskim pustinjskim područjima u isto vrijeme. Stoga, jedinstven način života i relativno uzak životni prostor mogu biti inherentni razlog zaštogenetska raznolikostCistanche je općenito niži od običnih biljaka.

Razlika ugenetska raznolikostizmeđu Cistanche deserticola i Cistanche tubulosa može biti povezano s razlikom u rasponu distribucije ova dva i jesu li sinhronizirani s distribucijom domaćina. Područje distribucije Cistanche tubulosa je znatno manje od Cistanche deserticola, a njegova distribucija je izrazito neusklađena s biljkom domaćinom. Studije su pokazale da postoji bogatstvo raznolikosti među vrstama Tamarixa. Na primjer, Zhang Juan et al. izvijestili su da je genetska raznolikost Tamarix sibiricus čak 98,7 posto [10], dok je genetska raznolikost Cistanchea izuzetno loša, što ukazuje na dugoročnu evoluciju. Cistanche tubulosa je možda imala ozbiljna uska grla u istoriji, što je rezultiralo gubitkom velike količinegenetska raznolikost.

Istovremeno, prema istragama, utvrđeno je da nijedan odCistanche deserticolau krugu od 20 km od ljudskih naselja moglo bi se iskopati i normalno procvjetati. Iskopane su velike i male jame Cistanche, posebno u glavnim proizvodnim područjima cvijeta Cistanche. Zbog toga je to uzrokovano velikim količinama iskopavanja. Nedostatak porijekla i uništenje staništa mogu biti glavni razlozi koje je stvorio čovjekgenetska raznolikostod Cistanche.

3.3 Genetska diferencijacija Cistanchea

Zbog geografske udaljenosti između Xinjianga i Unutrašnje Mongolije, geografska izolacija uzrokovala je diferencijaciju i izolaciju izmeđuCistanche deserticolapopulacije, a dvije populacije formirale su različite genetski različite ekotipove zbog svoje adaptacije na uslove lokalnog staništa. Zbog svog uskog raspona distribucije i česte razmjene gena među populacijama, genetska diferencijacija među populacijama je manja nego kod Cistanche deserticola.

3.4 Preporuke za zaštitu Cistanchea

Genetska raznolikostje preduvjet za dugoročni opstanak vrsta kako bi se izbjeglo izumiranje. Smanjenje odgenetska raznolikostće smanjiti sposobnost populacija da se prilagode promjenama okoliša kako kratkoročno tako i dugoročno [11]. Stoga je zaštita genetske raznolikosti Cistanchea vrlo važna za zaštitu ove rijetke i dragocjene kineske medicine. S obzirom da je cistanche vrsta sa posebnim ekološkim tipom, treba je uglavnom zaštititi in situ, a prirodnu zaštitnu bazu Cistanche treba uspostaviti u skladu sa njenom genetskom raznovrsnošću. Na primjer, zaCistanche tubulosa, budući da genetski diverzitet uglavnom dolazi iz populacije, populacije sa velikom genetskom raznolikošću bit će prioritetni objekti zaštite [12], kao što su Minfengov Angier i Yutianov Daheyan može biti naveden kao prirodna zaštitna baza za Cistanche. Što se tičeCistanche deserticola, populacije Unutrašnje Mongolije i Xinjianga pretrpjele su značajne promjene, pa bi eksperimentalna istraživanja trebalo dodatno ojačati kako bi se odredile populacije koje su prioritetne za zaštitu. Istovremeno, sprovesti osnovna istraživanja o reproduktivnoj biologiji i ekologiji oprašivanja Cistanchea kako bi se pružile informacije za njegovu dalju zaštitu.

Reference

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. IdentifikacijaCistanchei istraživanje komercijalnih medicinskih materijala. Kineski medicinski materijali, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Sveobuhvatno istraživanje i opća primjena Tamarix biljaka. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.

[3] Fu Guoli. Crvena knjiga kineskih biljaka. Peking: Science Press, 1992.

[4] Upravni ured za uvoz i izvoz ugroženih vrsta Narodne Republike Kine, Naučni odbor za ugrožene vrste Narodne Republike Kine. Konvencija o međunarodnoj trgovini ugroženim vrstama divlje faune i biljaka (CITES), Dodatak II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Ekstrakcija i identifikacija ukupne DNK nekoliko ugroženih biljaka i njihovih srodnika. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Sistem oplemenjivanja biljaka, genetska struktura i zaštitagenetska raznolikost. Biodiverzitet, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Evoluciona biologija biljaka. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. RAPD analiza genetske raznovrsnosti jele. Kineska nauka (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. Preliminarni izvještaj o RAPD analizi patuljastog božura i ljubičastog božura. Kineski časopis za taksonomiju biljaka, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Preliminarna studija oGenetic Diversityprirodnih populacija Tamarix lanceolate. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam D R. Posljedice populacione genetike male veličine populacije: Implikacije za očuvanje biljaka. Godišnji pregled Ekologija i sistematika, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Princip populacijske genetike i njena primjena u zaštiti rijetkih i ugroženih biljaka. Biodiverzitet, 1999, 7(4): 340.

Od: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, broj 8. avgust 2004