Himerične čestice humanog papiloma virusa-16 nalik virusu koje predstavljaju peptide P18I10 i T20 iz omotača HIV-a-1 izazivaju HPV16 i HIV-1-specifičan humoralni imunitet i imunitet posredovan T ćelijama kod BALB/c miševa
Dec 07, 2023
sažetak:
U ovoj studiji, HIV-1 P18I10 CTL peptid izveden iz V3 petlje HIV-1 gp120 i T20 antifuzioni peptid HIV-1 gp41 umetnuti su u HPV16 L1 kapsidni protein da konstruiše himerične HPV:HIV (L1:P18I10 i L1:T20) VLP koristeći sistem ekspresije ćelija sisara. HPV: HIV VLP su pročišćeni hromatografijom. Pokazali smo da umetanje P18I10 ili T20 peptida u DE petlju HPV16 L1 kapsidnih proteina nije uticalo na in vitro stabilnost, samosastavljanje i morfologiju himernih HPV: HIV VLP. Ono što je važno, nije ometalo reaktivnost HIV-1 antitijela usmjerenih na sekvencijalne i konformacijske P18I10 i T20 peptide predstavljene na himernim HPV: HIV VLP-ovima niti na indukciju HPV16 L{28}}specifičnih antitijela in vivo. Primijetili smo da himerične L1:P18I10/L1:T20 VLP vakcine mogu izazvati HPV16-, ali slabe odgovore HIV-1-specifičnih antitijela i izazvati HPV16- i HIV{37}}specifične T- ćelijski odgovori kod BALB/c miševa. Štaviše, može biti potencijalni poticaj za povećanje HIV-specifičnih ćelijskih odgovora u heterolognoj imunizaciji nakon primjene BCG.HIVA vakcine. Ovaj istraživački rad bi doprinio korak ka razvoju nove himerične HPV: platforme za vakcinu zasnovanu na HIV VLP za kontrolu HPV16 i HIV{42}} infekcije, koja je hitno potrebna u zemljama u razvoju i industrijaliziranim zemljama.
cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Ključne riječi:
HIV{0}}; HPV16; vakcina; virusne čestice; P18I10; T20 enfuvirtid; BCG.HIVA; humoralni imunitet; Imunitet posredovan T ćelijama
1. Uvod
Virus ljudske imunodeficijencije-1 (HIV-1), koji uzrokuje sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS), otkriven je ranih 1980-ih godina i od tada je postao globalna epidemija [1]. Iako visoko aktivni antiretrovirusni tretman (HAART), zajedno sa profilaksom prije izlaganja (PrEP) može imati stvarni utjecaj na kontrolu HIV-1 infekcije, vakcinacija je i dalje osnovni pristup za javnu dobrobit i da okončanje globalne HIV-1 epidemije [2]. Uprkos više od tri decenije detaljnog HIV-1 istraživanja i brojnih kliničkih ispitivanja vakcine, licencirana HIV{10}} vakcina do sada je još uvijek nedostižna. Ispitivanje RV144 provedeno na Tajlandu bio je prvi slučaj koji je otkrio skromnu efikasnost od 31,2% protiv zaraze HIV-1 infekcijom [3]. Većina drugih kandidata za vakcinu protiv HIV-1 koji su bili podvrgnuti kliničkim ispitivanjima uglavnom su bili zasnovani na DNK, rekombinantnim virusnim vektorima ili modelima proteina podjedinica [4,5]. U idealnom slučaju, efikasna vakcina protiv HIV-1 je sposobna inducirati urođene imunološke odgovore, neutralizirati antitijela kako bi se spriječila virusna infekcija [6], kao i citotoksični T limfociti (CTL) odgovori za eliminaciju inficiranih stanica [7]. Međutim, izazivanje svakog odgovora može zahtijevati različite strategije vakcinacije, što zahtijeva odvojene, ali paralelne razvojne napore. Odabir imunogena i vektora isporuke imat će značajan utjecaj na funkciju i specifičnost HIV-1 vakcina [8,9]. Ponovljeni neuspjesi u korištenju standardnih pristupa za razvoj HIV-1 vakcine doveli su do prepoznavanja važnosti odabira vektora isporuke, režima primarnog pojačanja i specifičnosti imunogena iu humoralnim i u ćelijskim odgovorima. Već je poznato više od 100 tipova humanog papiloma virusa (HPV), a smatra se da su HPV genotipovi 16 i 18 odgovorni za otprilike 70% karcinoma grlića materice u svijetu [10]. HPV L1 virusu slične čestice (VLP), klasifikovane kao vrsta podjediničnih vakcina, mogu pretežno izazvati uporedive L1- specifične humoralne odgovore na virion divljeg tipa, kao i odgovore posredovane T ćelijama [11–13]. Trenutno su na tržištu licencirane tri HPV vakcine za prevenciju i sve su bazirane na VLP-ovima HPV L1 kapsidnog proteina. Dva od njih, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, SAD) i Gardasil-9 (Merck) proizvode se putem ekspresionog sistema kvasca (Saccharomyces cerevisiae), dok se drugi, Cervarix (GSK, Brentford, UK), proizvodi po sistemu bakulovirus ekspresijski vektor/ćelija insekata (BEVS/IC) [14]. Do sada, optimalni uslovi proizvodnje HPV16 L1 proteina u sistemu ekspresije sisara nisu bili dobro utvrđeni. Stoga je razvoj kombinovane vakcine koja bi štitila od HPV i HIV infekcija logičan napor u borbi protiv ova dva glavna globalna patogena.
U našoj prethodnoj publikaciji preglednog rada u vezi sa konceptima dizajna vakcina za HIV-1 bazirane na virusu sličnim česticama (VLP), spomenuli smo da VLP bez omotača, kao što su VLP papiloma virusa, mogu igrati funkcionalnu ulogu kao vektori isporuke za predstavljanje HIV-1 CTL ili epitopi neutralizirajućih antitijela [15,16]. Ova hipoteza je potvrđena u nekoliko himeričnih goveđih papiloma virusa (BPV) L1 VLP koji predstavljaju P18I10 CTL epitop iz V3 petlje gp120 HIV-1 proteina ovojnice (Env) i 2F5 epitopa ili MPER regije gp41 HIV-1 Env [17–22]. Strukturna karakteristika L1 kapsidnih proteina tipa humanog papiloma virusa-16 (HPV16) je slična onoj kod BPV-a i može se samostalno sastaviti u jednoslojne L1 VLP-ove [23]. Pet HPV16 L1 proteina formira pentamer, a 72 pentamera se samosastavljaju u HPV16 VLP [24]. Međutim, još uvijek nema jasnih dokaza da bi himerni HPV16:HIV kapsidni proteini mogli biti stabilni in vitro i da se sami sastavljaju u morfološki integralne VLP. S druge strane, pokazalo se da su HPV16 L1 VLP-ovi visoko imunogeni i sposobni da izazovu antigen-specifične imunološke odgovore T i B-ćelija [11-13]. Ostaje da se vidi da li bi prezentacija epitopa HIV-1 kroz HPV: HIV VLP mogla biti imunogena. U ovoj studiji, imali smo za cilj da razvijemo himernu VLP-baziranu HPV: HIV vakcinu koristeći ljudske 293F ćelije, dobro uspostavljen sistem ekspresije ćelija sisara. HPV 16 L1 protein je djelovao kao strukturni okvir vakcine, a peptidi P18I10 i T20 su odabrani kao HIV{49}} imunogeni i umetnuti u DE petlju HPV 16 L1 proteina. Imunodominantni P18I10 CTL epitop koji se sastoji od 10 aminokiselina (ostaci 311–320: RGP GRAFVTI) izveden je iz treće varijabilne domene (V3) glikoproteina ovojnice HIV-1 gp120. P18I10 peptid je identificiran kao H-2Dd-restriktirana MHC klasa-I molekula da inducira odgovore citotoksičnih T limfocita (CTL) [25,26]. Peptid T20, poznat kao Enfuvirtid i dizajniran kao antiretrovirusni multimerni fuzioni peptid, sastoji se od sekvence od 36 aminokiselina (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) koja oponaša C-terminalnu heptad helix sekvencu blizu membrane0 s proksimalni vanjski region (MPER) glikoproteina ovojnice HIV-1 41 (gp41) [27]. Ova dva epitopa bazirana na HIV-1 T (P18I10) i B (T20) ćelija odabrana su kao početna tačka i dokaz koncepta eksperimenta za himerni VLP baziran HPV: platformu za razvoj vakcine protiv HIV-a.
Tokom protekle decenije, testirani su mnogi različiti formati vakcine protiv HIV{2}} zasnovane na VLP [15]. Iako je većina prethodnih strategija vakcine protiv HIV-1 VLP [28] ili himernog BPV: HIV VLP [17–22] bila fokusirana na izazivanje imunoloških odgovora korištenjem homolognog režima primarne stimulacije, dvije prethodne studije sugerirale su da heterologna imunizacija koji se sastoji od rekombinantnihMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) koji eksprimira HIV-1 Gag prime i HIV-1 Gag VLP pojačanje može doprinijeti poboljšanju imuniteta T-ćelija [29,30]. U našoj istraživačkoj grupi, pokazali smo primanje rBCG-a koji eksprimira HIVA imunogen i pojačavanje rekombinantnim virusnim vektorom MVA.HIVA je bilo sigurno i izazvalo je HIV-1-specifične imune odgovore T-ćelija kod BALB/c miševa [31–33]. HIVA imunogen, koji je dizajnirao dr. Tomas Hanke, sastoji se od HIV-1 Gag proteina pune dužine u kombinaciji sa više CTL epitopa uključujući epitope P18I10 na C-kraju [34]. Stoga smo željeli procijeniti da li BCG.HIVA može potaknuti imuni odgovor T-ćelija izazvanog HIV-om: HPV (L1:P18I10) VLP kod BALB/c miševa.
U ovoj studiji, himerni HPV: HIV (L1:P18I10 i L1:T20) imunogeni su dizajnirani i proizvedeni korišćenjem sistema ekspresije 293F. Himerna ekspresija proteina L1:P18I10 i L1:T20 potvrđena je imunološkim bojenjem. HPV: HIV VLP su naknadno pročišćeni metodom 3-stepene hromatografije, uključujući kationsku (CEC), hromatografiju isključenja veličine (SEC) i hromatografiju afiniteta heparina (H-AC). Zatim, in vitro stabilnost, in vitro samosastavljanje i morfologija prečišćenih HPV: HIV VLP-ova potvrđeni su neredukujućim SDS-PAGE, testom molekularne mase i transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM), respektivno. Sekvencijalni i konformacioni peptidi P18I10 i T20 predstavljeni na himernim HPV: HIV VLP-ovi su dalje okarakterisani anti-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 monoklonskim antitelima in vitro korišćenjem Western blot i indirektnog ELISA testa. Konačno, imunogenost HPV: HIV VLP-ova procijenjena je na BALB/c modelu miševa. Pokazali smo da himerne vakcine zasnovane na L1:P18I10 i L1:T20 VLP mogu izazvati HPV16- i HIV-1-specifične odgovore antitijela, a himerne L1:P18I10 VLP mogu inducirati HPV16- i HIV{ {37}}specifični odgovori T-ćelija kod BALB/c miševa. Budući da je razvoj i proizvodnja imunogene HPV: HIV vakcine još uvijek nedostižni, ova studija je pružila osnovnu strategiju koja bi mogla biti vrijedna podrške globalnim naporima za razvoj novih himernih vakcina zasnovanih na VLP za kontrolu HPV i HIV{40}} infekcija.
2. Materijali i metode
2.1. Konstrukcija vakcinalnog soja BCG.HIVA2auxo.int
Rekombinantni BCG koji eksprimira HIVA imunogen je prethodno konstruisan korišćenjem E.coli-mycobacterial integrativnog šatl vektora p2auxo.int. Konstrukcija E. coli/mikobakterijskog vektora koji eksprimira HIVA antigen je prethodno opisana [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int je razrijeđen u PBS-Tween20 do 2 × 107 cfu/mL, obrađen ultrazvukom da razbije bakterijske nakupine i inokuliran u stražnji jastučić za hranu ili BALB/c miševe (50 µL, 106 cfu/miš).
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
2.2. Bakterijske kulture i transformacija
Ćelije glicinskog auksotrofnog soja E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, SAD), koje je obezbijedio dr. Pau Ferrer, uzgajane su u minimalnoj M9-mediji (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}}.5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glukoza, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0.1 mmol/L; tiamin, 0.1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , dopunjen glicinom (70 µg/mL). E. coli M151Gly ćelije su transformisane sa p2auxo.HIVA plazmidima elektroporacijom. Za ovo, kulture E. coli su uzgajane do optičke gustoće od 0,9 na 600 nm i transformisane korišćenjem Bio-Rad genskog pulsera elektroporatora na 2,5 kV, 25 µF i 200 Ω. Transformirane ćelije su potom kultivisane na M9-D agar pločama (komponente kao što je prethodno opisano, sa dodatkom 1,5% baktoagara) bez dodatka glicina za selekciju ili sa dodatkom glicina kao kontrole. Lizinski auksotrofni BCG soj, BCG∆lys, koji su ljubazno obezbijedili WR Jacobs Jr., BR Bloom i T. Hsu transformiran je sa p2auxo.HIVAint plazmidnom DNK elektroporacijom. Mikobakterije su uzgajane u bujonu Middlebrook 7H9 ili na mediju Middlebrook agar 7H10 sa dodatkom albumin-dekstroza-katalaze (ADC; Difco) koja sadrži 0,05% Tween 80. L-lizin monohidroklorid (Sigma, Kawasaki, Japan) je otopljen u vodi. koristi se kao dodatak u konačnoj koncentraciji od 40 µg/mL. Za transformaciju, BCG je kultivisan do optičke gustine od 1,5 na 600 nm i transformisan korišćenjem Bio-Rad gen pulsera elektroporatora na 2,5 kV, 25 µF i 1000 Ω. Transformanti su zatim kultivisani na medijumu Middlebrook agar 7H10 sa dodatkom ADC koji sadrži 0,05% Tween 80 bez dodavanja lizina.
2.3. Ćelijske linije i ćelijska kultura
Ćelije 293F (Tibco), izvedene iz ćelija ljudskog embrionalnog bubrega (HEK) 293, uzgajane su u ekspresijskom mediju FreeStyle 293 (Tibco) sa dodatkom 5 mL/L penicilin-streptomicina (Tibco) i inkubirane u inkubatoru od 37 ◦ vlažna atmosfera od 5% CO2 na platformi orbitalnog šejkera koja se okreće brzinom od 125 o/min.
2.4. Proizvodnja L1:P18I10 i L1:T20 proteina pomoću 293F sistema ekspresije
Konstrukt pCDNA3.1 sadržavao je L1:P18I10 ili L1:T20 DNK kodirajuće sekvence koje odgovaraju himernim L1:P18I10 i L1:T20 proteinima, respektivno. HIV-1 P18I10 CTL peptid (RGPGRAFVTI) ili T20 peptid (YTSLIHSLIESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) umetnut je u DE petlju HPV16 L1 kapsidnog proteina. HPV16 L1 DE sekvenca petlje koja kodira 130-136 aminokiselina zamijenjena je ili P18I10I10 ili T20 peptidom. Kodirajuće sekvence L1:P18I10 ili L1:T20 DNK modificirane su Kozak sekvencom, optimizirane sa ljudskim kodonom, okružene restrikcijskim enzimskim mjestima HindIII i XbaI i klonirane u pcDNA3.1(+) vektor korištenjem GeneArt usluga sinteze gena ( Thermo Fisher, Waltham, MA, SAD). Rekombinantna plazmidna DNK (pDNA) je transformisana u E. coli DH5 kompetentne ćelije (Invitrogen) za amplifikaciju i ekstrahovana korišćenjem plazmidnih Maxi kitova (QIAGEN, Hilden, Nemačka). 293F ćelije su kultivisane sa 30 mL FreeStyle 293 ekspresionog medija u Erlenmajerovoj tikvici od 125 mL (Corning, New York, NY, SAD) do gustine od 1,0 × 106/mL i prolazno transficirane sa L1:P18I10 ili L1:T20 granom polietilenimin sa MW od 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) pri optimiziranom omjeru DNK prema PEI 1:3 (w/w) i DNK prema mediju za kulturu 1:1 (w/v), prema prema uputama proizvođača [35]. 293F ćelije su sakupljene 96 h nakon transfekcije. 293F ćelije mogu dostići konfluentnu gustinu od 3,6 × 106 ćelija/mL sa približno 50% održivosti.
2.5. Imunofluorescentno bojenje
Ćelije su permeabilizirane na stakalcu sa 100% hladnim acetonom. Nakon toga, fiksirane ćelije su ispitane sa anti-HPV16 L1 antitijelom CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) i uhvaćene sa anti-mišjim IgG-FITC (Sigma). Imunološki obojeni monoslojevi ćelija su temeljito isprani PBS-om i prekriveni medijumom za montažu sa DAPI (Abcam). Imunofluorescentne slike su pregledane pod invertovanim mikroskopom pri uvećanju od 40x. Efikasnost transfekcije određena je odnosom FITC (zeleno) pozitivnih ćelija prema DAPI (plavo) obojenim ćelijama.
2.6. Pročišćavanje HPV: HIV (L1:P18I10 i L1:T20) VLP
Ukupno 108 transficiranih 293F ćelija u erlenmajerskoj tikvici od 125 mL (30 mL medijuma za kulturu/boca) sakupljeno je centrifugiranjem na 1500 rpm tokom 5 minuta i isprano dva puta sa PBS. Ćelijske pelete su resuspendovane u puferu za lizu formulisanom sa 1% Triton X-100, inhibitorom proteaze (1:100) (Millipore) i benzonazom (25 U/mL) (Millipore). Ćelijski lizati su pročišćeni pomoću 0,45 µm PVDF filtera šprica (Millipore). Uzorci HPV: HIV (L1:P18I10 i L1:T20) VLP su serijski pročišćeni korištenjem kationske izmjene (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, SAD), isključenja veličine (Capto Core 700, GE) i afiniteta (HiTrap Heparin HP , GE) hromatografija. Kromatografski protokoli su opisani u našim prethodnim studijama [36,37] i slijedili su protokol proizvođača [38]. Signal L1 proteina u svakom koraku prečišćavanja karakteriziran je Western blot analizom i ispitan anti-HPV16 L1 antitijelom CAMVIR-1 [39].
2.7. SDS-PAGE bez redukcije
HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi su pomiješani sa 2× Laemmli puferom za uzorke (BIO-RAD) u odsustvu ili prisustvu 5% (v/v) 2-merkaptoetanola ({{11} }ME) i reagovao na sobnoj temperaturi (RT) 24 h. Uzorci su razdvojeni 8-16% TGX proteinskim gelovima bez mrlja (BIO-RAD). Zatim su gelovi prebačeni na PVDF membrane. Membrane su ispitane sa anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb u razrjeđenju od 1:4000. Nakon toga, membrane su inkubirane sa konjugatom anti-mišjeg IgG peroksidaze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u razrjeđenju 1:4000. Signal je razvijen i vizualiziran hemiluminiscencijom korištenjem Western Blot ECL supstrat kita (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Slike mrlja su dobijene korišćenjem Odyssey Fc sistema za snimanje.
2.8. Analiza molekularne mase
HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi bez 2-ME tretmana su filtrirani kroz uređaje za ultrafiltraciju od 1000 kDa molekularne težine (MWCO) (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 VLP sa 2-ME tretmanom propušteni su kroz 100 kDa MWCO ultrafiltracione uređaje (Amicon). Retentati su rekonstituisani do prvobitne zapremine i sakupljeni iz rezervoara za uzorke filter uređaja, dok su filtrati sakupljeni na dnu epruvete za centrifugiranje. L1 signal je mjeren korištenjem dot blota koji je ispitan sa anti-HPV16 L1 mAb i detektovan konjugatom anti-mišjeg IgG-peroksidaze (Sigma-Aldrich). Slike su dobijene pomoću Odyssey Fc Imaging Systema na kanalu hemiluminiscencije.
Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem
2.9. Negativno bojenje i transmisiona elektronska mikroskopija
Nakon punjenja bakrenih rešetki obloženih ugljikom (Sigma-Aldrich) pod ultraljubičastim svjetlom u trajanju od 5 minuta, komercijalni HPV16 L1 (Abcam), pročišćeni L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi ekvilibrirani sa 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 M NaClm ) apsorbirani su na rešetkama 1 min i isprani tri puta miliQ vodom. HPV: HIV VLP su negativno obojeni sa 2% uranil acetata na pH 4,5 (Sigma-Aldrich) tokom 1 min. Višak sredstava za bojenje uklonjen je kvalitativnim filter papirom Whatman (Sigma-Aldrich). Rešetke su postavljene u komoru za odvlaživanje najmanje 2 h prije posmatranja. Slike su dobijene transmisionim elektronskim mikroskopom (Tecnai Spirit 120 kV) pri uvećanju SA135K (100 nm) i SA59000 (200 nm), respektivno.
2.10. Elektroforeza natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel i Western Blotting analiza
Jednake količine (500 ng) HPV16 L1 proteina (Abcam), prečišćenih L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova pomiješane su sa 2× Laemmli pufera za uzorke koji sadrži 5% 2-ME i kuhano na 95 ◦C 5 minuta . Uzorci su razdvojeni sa 8-16% TGX proteinskih gelova bez mrlja, a zatim prebačeni na PVDF membranu (Millipore, Burlington, MA, SAD) koristeći Semi-Dry transfer uređaj (Bio-Rad). Membrana je blokirana sa 5% obranog mlijeka u TBST. Zatim su membrane ispitane sa anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb u razrjeđenju od 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 mAb petlje (NIBSC, EVA3012) u razrjeđenju od 1: 40 i HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) u razblaženju od 1:4000, respektivno. Nakon toga, membrane su inkubirane sa konjugatom anti-mišjeg IgG peroksidaze (Sigma-Aldrich) u razrjeđenju 1:4000. Za razvoj signala korišten je Western ECL supstrat kit (BIO-RAD). Slike mrlja su dobijene korišćenjem Odyssey Fc sistema za snimanje na kanalu hemiluminiscencije.
2.11. Imunizacija miševa, sakupljanje seruma i izolacija splenocita
Ovo je preliminarna studija dokaza o konceptu koja pokazuje imunogenost HPV: HIV VLP (L1:P18I10 i L1:T20 VLP). Doza, način primjene i interval početnog pojačanja našeg HPV: HIV VLPs upućuju na prethodne studije koje su imunizirale miševe goveđim papiloma virusom (BPV): HIV VLP za izazivanje odgovora antitijela [20,21]. Prečišćeni HPV: HIV VLP-ovi su emulgirani sa jednakom zapreminom (225 µg po svakoj dozi od 0,5 mL) aluminijum hidroksifosfat sulfata (Thermo Fisher), kako bi se osigurala slična formulacija licenciranoj Gardasil-9 HPV vakcini [40]. Sve grupe miševa su imale jednaku spolnu distribuciju (mužjak n=4 i ženka n=4 po grupi). U grupama A i B, BALB/c miševi su imunizirani intramuskularno (im) sa 10 µg L1:P18I10 ili L1:T20 VLP-a, respektivno, slijedeći homologni prime-boost režim. U grupi C, miševi su inokulirani sa 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int intradermalno (id, na podlozi za hranu) i pojačani sa 10 µg L1:P18I10 VLP intramuskularno. U grupi D, pozitivni kontrolni miševi su inokulirani sa Gardasil- 9 primenom nakon čega je uslijedio Gardasil-9 boost intramuskularno sa 10 µg HPV16 L1 VLP. U grupi E, negativni kontrolni miševi su dva puta imunizirani PBS puferom. Interval prvog pojačanja bio je 2 sedmice. Miševi su žrtvovani 28. dana. Uzorci krvi su sakupljeni iz srca miševa. Serumi su prikupljeni centrifugiranjem i pohranjeni na -20 ◦C za ELISA test. Mišje slezene su uklonjene i presovane pojedinačno kroz ćelijsko cjedilo (Falcon) sa gumenim klipom šprica od 5 mL. Nakon uklanjanja crvenih krvnih zrnaca puferom za lizu ACK (Lonza), splenociti su isprani i resuspendirani u mediju limfocita R10 (RPMI 1640 dopunjen sa 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), penicilin-streptomicinom, 20 mM HEPES i {{15 46}}ME) u koncentraciji od 2 × 107 ćelija/mL.
2.12. Enzimski imunosorbentni test
Za testiranje HPV16 L1- i HIV-1-specifičnih antitijela koja se vezuju za himerni HPV: HIV VLP konstrukti in vitro, 50 µL jednake koncentracije (200 ng/mL) rekombinantnog HPV16 L1 proteina (Abcam, ab119880 ), prečišćeni L1:P18I10 i L1:T20 VLP u 50 mM karbonatnom bikarbonatnom puferu (pH=9.6) (Sigma) 2- su serijski razrijeđeni 2-prestruko i obloženi na Maxisorb ploče (Nunc). Ploče su inkubirane na 4 ◦C preko noći. Ploče su blokirane puferom za blokiranje (5% obranog mlijeka u TBST) na 37 ◦C najmanje 2 h. Nakon dva puta ispiranja sa TBST, ploče obložene VLP-om su inkubirane sa anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb u razrjeđenju od 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) u razrjeđenju 1:8000 i anti- HIV-1 gp120 V3 mAb petlje (NIBSC, EVA3012) u razblaženju 1:40 u puferu za blokiranje, respektivno, na 37 ◦C tokom 2 h. Nakon tri puta ispiranja sa TBST, ploče su inkubirane sa konjugatom rekombinantnog proteina G peroksidaze (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) u razrjeđenju 1:4000 u puferu za blokiranje na 37 ◦C tokom 1 h. TMB je korišten za razvoj signala enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) i zaustavljen je sa 50 µL 2M H2SO4. Optička gustina (OD) svake jažice je izmjerena i zabilježena na talasnoj dužini od 450 nm korištenjem čitača mikroploče apsorbancije EL × 800.
Za mjerenje VLP-induciranih antitijela kod BALB/c miševa, mikrotitarske ploče su obložene sa 50 µL 2 µg/mL rekombinantnog HPV16 L1 proteina (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptida (NIBSC, ARP734) T20 peptid (NIBSC, ARP984), respektivno, sa 50 mM karbonat-bikarbonatnog pufera (pH=9.6). Ploče su inkubirane na 4 ◦C preko noći. Ploče su blokirane puferom za blokiranje (5% obranog mlijeka u TBST) na 37 ◦C najmanje 2 h. Istovremeno, serumi sakupljeni od miševa imuniziranih AE grupe razrijeđeni su sa 5% obranog mlijeka u TBST u omjeru 1:50. Nakon dva puta ispiranja sa TBST, ploče su inkubirane sa razblaženim serumom na 37 ◦C tokom 2 h. Nakon tri puta ispiranja sa TBST, pločama je dodat rekombinantni protein G HRP konjugat u razblaženju od 1:4000 u puferu za blokiranje i inkubirane na 37 ◦C tokom 1 h. TMB je korišten za razvoj ELISA signala i zaustavljen je sa 50 µL 2M H2SO4. OD svake jažice je mjeren na talasnoj dužini od 450 nm korištenjem čitača mikroploče apsorbancije EL × 800 (Biotek).
2.13. IFN-ELISpot test
Enzimski vezani imunološki apsorbirajući spot (ELISpot) je izveden korištenjem komercijalnog kita za mišje IFN-ELISpot (Mabtech, Nacka Strand, Švedska), prema uputama proizvođača. ELISpot ploče (MSISP4510, 96-jažice sa poliviniliden difluoridnim membranama, Millipore, Middlesex County, MA, SAD) tretirane su 70% EtOH i obložene pročišćenim monoklonskim antitijelom protiv mišjeg interferona (IFN-) razrijeđenog u fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS) do konačne koncentracije od 5 µg/mL na 4 ◦C preko noći. Zatim je u svaku jažicu dodato 2,5 × 105 svježih splenocita. Nakon toga, ćelije iz grupa A i B su stimulirane sa 2 µg/mL HPV16 L1 VLP-a i HIV-1 P18I10 peptida, respektivno. Svi uzorci i kontrole su postavljeni u duple jažice. ELISpot testovi su inkubirani 16 h na 37 ◦C, 5% CO2. Ploče su zatim isprane 5 x PBS-om, inkubirane 2 h s biotiniliranim anti-IFN-monoklonskim antitijelima (mAb) razrijeđenim u PBS 2% fetalnom telečjem serumu (FCS) do konačne koncentracije od 2 µg/mL, isprane 5 puta u PBS, i inkubirano sa konjugatom streptavidin-alkalne fosfataze u PBS 2% FCS. Zatim su ploče isprane 5 puta sa PBS prije inkubacije sa 100 µL rastvora supstrata 5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfata (BCIP)/nitro plavog tetrazolijuma (NBT) (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, SAD). Nakon 5-10 minuta, ploče su isprane vodom iz slavine, osušene, a nastale mrlje su prebrojane pomoću ELISPOT čitača (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Njemačka). Za svaku životinju, srednja vrijednost pozadinskih odgovora oduzeta je pojedinačno iz svih jažica kako bi se omogućilo poređenje ćelija koje formiraju IFN-spot (SFC)/106 između grupa. Da bi se definisali pozitivni odgovori, prag je definisan kao najmanje pet tačaka po jažici i odgovori koji prelaze srednji broj tačaka u jažicama negativne kontrole plus tri standardne devijacije negativnih kontrolnih jažica.
2.14. Statistička analiza
Sva statistička analiza obavljena je korišćenjem softvera Prism 6 GraphPad (CA, USA). Koristili smo podatke iz eksperimenata provedenih na 5 različitih ELISA koncentracija obloge ploče (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) rekombinantnog HPV16 L1 proteina (Abcam, ab119880) i HPV: HIV VLP. Prikupili smo podatke iz 2 grupe (HPV16 L1 i HPV: HIV VLP) i prikupili tri replika za svaku koncentraciju premaza. Grafikon u Prismi je pokazao podatke kao dijagram raspršenja koji pokazuje koncentraciju prevlake (ng/mL) na X-osi i OD450 na Y-osi. Pošto smo pretpostavili da su naši in vitro ELISA podaci povezani u linearnom obrascu, izvršili smo analizu linearne regresije i uporedili nagibe dvije linije kako bismo potvrdili da skup podataka-1 i skup podataka-2 (antitijelo reaktivnost između HPV16 L1 i HPV: HIV VLP) se razlikuju po svom djelovanju. Odabrali smo intervale pouzdanosti od 95% uz liniju koja najbolje odgovara. Prizma je automatski preklopila liniju linearne regresije na oba naša skupa podataka i iscrtala je isprekidanu liniju koja predstavlja 95% intervala pouzdanosti. Tokom analize linearne regresije, softver je izračunao samo srednju vrijednost Y našeg skupa podataka koja je pokazala da pokazuje dobro uklapanje. Osim toga, Prism nam je dao komentar, pa možemo zaključiti da su razlike između dvije padine izuzetno značajne.
Imali smo 5 setova (ELISA) i 4 seta (ELISPOT) podataka prikupljenih iz eksperimenata imunizacije miševa. Ovi skupovi podataka imali su jednak broj (muški n=4 i ženski n=4) u svakoj grupi. Koristili smo Gardasil-9-imunizirane miševe kao pozitivnu kontrolnu grupu i PBS imunizirane miševe kao negativnu kontrolnu grupu. Podaci naših dizajniranih eksperimenata nisu se podudarali ili uparili. Preduzeli smo jednosmjernu analizu varijanse (ANOVA) kako bismo vidjeli da li su ove sredine različite. Prvo smo provjerili da naši podaci odgovaraju Gausovoj normalnoj distribuciji. Otkrili smo da neke grupe podataka u ELISA testu nisu prošle Gaussov test normalne distribucije. Stoga smo izvršili neparametarsku statističku analizu ovih podataka. Nasuprot tome, sve grupe podataka u ELISPOT testu su prošle Gaussov test normalne distribucije. Stoga smo izvršili parametarsku statističku analizu ovih podataka. Prag značajnosti i nivo pouzdanosti su postavljeni na 0.05 (ekvivalentno intervalu pouzdanosti od 95%). p vrijednost koja općenito pokazuje vjerovatnoću da postoje razlike između grupa. Budući da je naša glavna briga za ovaj eksperiment koje su razlike između naših grupa, višestruka poređenja u Prizmi dala su nam rezultat poređenja u svim grupama sa svakom drugom grupom.
2.15. Etičke izjave
BALB/c miševi stari od šest do osam sedmica kupljeni su od Enviga (kompanija Inotiv, Chicago, IL, SAD) i odobreni od strane lokalnih vlasti (Generalitat de Catalunya, broj projekta 11157) i Etičkog komiteta Universitat Autònoma de Barcelona. Eksperimenti na životinjama strogo su usklađeni sa zakonima o dobrobiti životinja Generalitata de Catalunya. Sve eksperimente je odobrio lokalni istraživački etički komitet (Procedura 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).
3. Rezultati
3.1. Dizajn imunogena L1:P18I10 i L1:T20 i evaluacija HPV: ekspresija proteina HIV-a korištenjem 293F sistema ekspresije
P18I10 peptid iz petlje treće varijabilne domene HIV-1 Env (V3) i T20 peptid iz proksimalnog vanjskog područja HIV-1 Env membrane (MPER) umetnuti su u HPV16 L1 DE protein petlje kako bi se stvorio himerni L1 :P18I10 i L1:T20 imunogeni. Himerne sekvence koje kodiraju DNK L1:P18I10 i L1:T20 klonirane su u pcDNA3.1 (+) ekspresijski vektor plazmidne DNK za prolaznu transfekciju u 293F ćelijama (Slika 1A). Strukture monomera HPV16 L1, himernih L1:P18I10 i L1:T20 kapsidnih proteina preliminarno su predviđene korišćenjem servera SWISS modela (Slika 1B). HPV16 glavni kapsid protein L1 (7cn2.1.R) odabran je kao strukturni šablon za izgradnju modela homologije HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 kapsidnog proteina. U poređenju sa konformacijom vezanog peptida P18I10 u prethodnoj studiji [41], smjer glavnog lanca od N do C kraja peptida P18I10 na našem himernom L1:P18I10 proteinu ide s desna na lijevo (slika 1B, srednji i gornji panel), a izloženi bočni lanci P18I10 mogu potencijalno stupiti u interakciju s receptorima T ćelija (slika 1B, srednji i donji panel). U poređenju sa strukturom peptida inhibitora fuzije HIV-1 u prethodnom preglednom radu [42], umetnuti peptid T20 na HPV16 L1 kapsid protein je predstavljen kao formacija nalik -helix (slika 1B, desni i gornji panel ), a izloženi bočni lanci T20 bi potencijalno mogli biti prepoznati od strane receptora B ćelija (slika 1B, desna i donja ploča). Budući da se HPV16 L1 kapsidni proteini mogu homogeno sastaviti u T=7 ikosaedralnu česticu sa 72 pentamerna kapsomera [43], prikaz visoke gustoće P18I10 ili T20 peptida na vanjskoj površini himernog HPV-a: HIV VLP je potencijalno jako imunostimulirajući da izazovu epitop-specifične imune odgovore.
Slika 1. Dizajn L1:P18I10 i L1:T20 imunogena i konstrukcija himernih HPV: HIV VLP-ova upotrebom 293F ekspresionog sistema. (A) Himerne sekvence koje kodiraju DNK L1:P18I10 i L1:T20 klonirane su u vektore ekspresije pcDNA31+ za prolaznu transfekciju u 293F ćelijama. (B) Predviđanje monomernih struktura HPV16 L1 i himernog HPV: HIV kapsidnih proteina korišćenjem servera SWISS modela. HPV16 glavni kapsid protein L1 (7cn2.1.R) je odabran kao strukturni šablon za izgradnju HPV16 L1 (lijevi panel), L1:P18I10 (srednji panel) i L1:T20 (desni panel) model homologije kapsidnog proteina. Sekundarni strukturni elementi HPV16 L1 kapsidnog proteina su označeni slovima h1–h5 za 5 -heliksa. Petlje HPV16 L1 kapsidnog proteina između lanaca označene su BC, CD, DE, EF, FG i HI. Sekundarni strukturni elementi HIV-1 P18I10 i T20 peptida L1 su označeni strelicama (gornji panel). Dio peptida P18I10 i T20 koji strši iznad površine HPV16 L1 kapsidnog proteina označen je strelicama (donja tabla). (C) Imunofluorescentno bojenje L1 proteina u 293F ćelijama. Sljedeće pDNA.L1:P18I10 (lijevo), pDNA.L1:T20 (sredina) i pDNA.bez umetanja (desno) su transficirane u 293F ćelijama. Transficirane ćelije su ispitane sa anti-HPV16 L1 mAb i detektirane sa anti-mišjim IgG-FITC (zeleni kanal). Ćelijska jezgra su obojena DAPI (plavi kanal). Imunofluorescentne slike su spojene pomoću Adobe Photoshopa
Budući da HPV16 L1 protein C terminalna sekvenca posreduje u ćelijskoj mašineriji nuklearnog uvoza tokom infekcije [44], signali nuklearne lokalizacije (NLS) HPV16 L1 proteina su identifikovani u prethodnim studijama [45]. Monoklonsko antitijelo CAMVIR-1 je odabrano da prepozna HPV16 L1 epitop (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], a boja na bazi fluoresceina FITC je korištena kao reporter za praćenje ekspresije L1:P18I10 i L1: T20 proteini. Slike imunofluoprisustva jasno su pokazale da je HPV16 L1 (zeleno) uglavnom lokalizovan u jezgrima (plavo) 293F ćelija. Nije uočen L1 signal u kontrolnim 293F ćelijama transektovanim plazmidom (pcDNA3.1 plazmid bez inserta) (Slika 1C). Rezultati sugeriraju da se i himerni L1:P18I10 i L1:T20 kapsidni proteini mogu eksprimirati korištenjem transfekcije posredovane polietileniminom (PEI) i prepoznati HPV16 L1 CAMVIR-1 monoklonskim antitijelom.
3.2. Pročišćavanje L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova korištenjem hromatografskih metoda
The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa i heterologna donja traka<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.
Slika 2. Prečišćavanje i karakterizacija L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova. (A) Šematski dijagram toka procesa L1:P18I10 i L1:T20 VLP prečišćavanja hromatografijom. (B, C) Western blot analiza uzoraka L1:P18I10 i L1:T20 VLP iz svakog koraka prečišćavanja. Signal L1 u svakom koraku prečišćavanja karakteriziran je Western blot analizom sa anti-HPV16 L1 mAb. Strelica pokazuje molekulsku težinu od ~56 kDa L1:P18I10 i ~58 kDa proteina L1:T20. Traka 1: pročišćeni ćelijski lizat (CCL); Traka 2: protok (FT) iz hromatografije izmjene katjona (CEC) učitavanje uzorka; Traka 3: CEC eluat; Traka 4: FT od koraka regeneracije CEC 2M NaCl; Traka 5: hromatografija isključivanja veličine (SEC) FT-1; Traka 6: SEC FT-2; Traka 7: FT iz učitavanja uzorka afinitetne hromatografije za heparin (H-AC); Traka 8: H-AC eluat; Traka 9: FT od koraka regeneracije H-AC 2M NaCl; Traka 10: 10-preklopna dijafiltracija.
3.3. In vitro stabilnost i samosastavljanje L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova
Kako bismo potvrdili da pročišćeni HPV: HIV VLP pokazuju sličnu in vitro stabilnost kao HPV16 L1 VLP, izveli smo nereducirajući SDS-PAGE da bismo procijenili disulfidno unakrsno povezivanje HPV: HIV kapsidnih proteina (Slika 3A). Poznato je da pH, jonska snaga, temperatura [52] i redoks okruženje koreliraju sa disulfidnim vezama HPV16 L1 kapsidnih proteina [53]. HPV L1 VLP-ovi imaju tendenciju da se samosastavljaju pri niskom pH i visokoj jonskoj snazi. Maksimalno rastavljanje VLP-ova tipično zahtijeva izlaganje visokoj koncentraciji redukcionog agensa, kao što je 5% 2-merkaptoetanola (2-ME) tokom relativno dugog trajanja [54]. U nedostatku redukcionih agenasa 2-ME, samo mali dio HPV-16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 proteina migrirao je na monomere sa prividnom molekulskom težinom (MW) od 55 kDa . Otprilike 70% L1 proteina je disulfidno povezano u veće dimere ili pentamere, sa predviđenim MW od 110 kDa i 280 kDa (Slika 3A, trake 2, 4 i 6). Nasuprot tome, skoro svi HPV-16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 proteini u puferu za rastavljanje pojavili su se kao monomerne strukture u nereducirajućem SDS-PAGE (Slika 3A, traka 3, 5 i 7). Ovi rezultati su pokazali da in vitro stabilnost prečišćenih L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova predstavlja slične obrasce disulfidnog umrežavanja kao HPV16 L1 VLP pod istim pH, jonskom snagom i termičkim uslovima. Čini se da se pročišćeni VLP-ovi razlažu do nivoa pentamera, trimera i dimera nakon dugotrajnog izlaganja visokim koncentracijama redukcijskih agenasa. Ovi podaci su u skladu s prethodnim studijama [53,54] Međutim, rastavljanje HPV: HIV VLP-ova još uvijek je bilo daleko od potpune (monomeri).
Slika 3. In vitro stabilnost L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova. (A) Disulfidno umrežavanje L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova u neredukcionom SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, pročišćeni L1:P18I10 i L1:T20 VLP su pomiješani sa Laemmli puferom za uzorke u odsustvu ili prisustvu 2-merkaptoetanola (2-ME), respektivno, i analizirani nereducirajućim SDS-PAGE. Položaj L1 monomera (55 kDa), L1 dimera (110 kDa) i L1 pentamera (280 kDa) je označen strelicom. Traka 1: marker molekularne težine proteina; Traka 2: HPV16 L1 VLP; Traka 3: HPV16 L1 VLP tretiran sa 2-ME; Traka 4: L1:P18I10 VLP; Traka 5: L1:P18I10 VLP tretiran sa 2-ME; Traka 6: L1:T20 VLP; Traka 7: L1:T20 VLP tretiran sa 2-ME. (B) Analiza molekularne mase L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova. Sastavljeni VLP-ovi koji nisu tretirani sa 2-ME (trake 2, 4 i 6) filtrirani su kroz uređaje za dijafiltraciju od 1000 kDa za graničnu molekulsku težinu (MWCO) (gornji panel). Rastavljeni VLP-ovi tretirani sa 2-ME (trake 3, 5 i 7) filtrirani su kroz 100kDa MWCO centrifugalne filter uređaje (donji panel). Retentati (R) su sakupljeni iz rezervoara za uzorke filter uređaja, dok su filtrati (F) sakupljeni na dnu centrifugalnih epruveta. Signal L1 proteina je detektovan korišćenjem dot blot testa sa anti-HPV16 L1 mAb.
To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) i sačuvani su u retentatima. Obrazac se podudarao s podacima koji su uočeni u nereducirajućem SDS-PAGE. Iako su sve VLP grupe tretirane sa 2-ME prikazane u monomernom pojasu (~55 kDa) u nereducirajućoj SDS-PAGE (Slika 3A, traka 3, 5 i 7). Međutim, odgovarajući smanjeni VLP-ovi nisu filtrirani kroz ultrafiltracione membrane od 100 kDa (slika 3B, donja ploča). Ovi rezultati sugeriraju da su himerni HPV: HIV proteini bili sposobni za samosastavljanje na veće čestice, ali maksimalno rastavljanje VLP-a na monomere zahtijeva ne samo smanjenje disulfidnih veza već i druge denaturirajuće faktore, kao što su pH ili jonska snaga.
3.4. Morfološka karakterizacija L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova
Transmisiona elektronska mikroskopija (TEM) je korištena za ispitivanje morfološke konformacije HPV16 L1 i HPV: HIV VLP. HIV-1 P18I10 i T20 peptidi su umetnuti u DE petlje HPV16 L1 proteina, respektivno. Ovi komercijalni HPV16 L1 i himerni HPV: HIV kapsidni proteini mogu spontano da se sami sastavljaju in vitro u integralne VLP u prečniku od približno 50-60 nm (Slika 4A-C, desni panel). U poređenju sa elektronskim mikrografijama HPV16 L1 VLP-ova objavljenim u prethodnim studijama [55,56], ikosaedralna struktura HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova ovdje je bila manje kontrastna i nejasna. To se može pripisati negativnom reagensu za mrlje koji smo koristili u ovoj studiji. U našoj nedavnoj studiji objavljenoj u prethodnoj studiji [37] i drugom tekućem radu pod recenzijom (podaci nisu prikazani), dobili smo dobar kvalitet i rezoluciju elektronskih mikrofotografija kada L1:P18I10 VLP-ovi izvedeni iz kvasca i bakulovirusa (isti himerni konstrukt) su uravnoteženi u PBS i negativno obojeni fosfovolframnom kiselinom (PTA). Budući da smo u ovoj studiji koristili različite VLP sisteme za proizvodnju i prečišćavanje, L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi izvedeni iz ćelija sisara su uravnoteženi sa Tris-HCl i negativno obojeni uranil acetatom. Iako bi se elektronski mikrografi mogli poboljšati, još uvijek smo mogli uočiti jasan obrazac da bi se većina HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 kapsidnih proteina mogla samostalno sastaviti u morfološke VLP pod TEM ekranom (Slika 4A-C, lijevi panel ). U osnovi, HPV VLP su zaštićeni od agregacije u uslovima visoke soli [57]. Neki od detektabilnih agregacija HPV16 L1 i HPV-a: HIV VLP-ovi u puferu sa malo soli Tris-HCl mogu se vidjeti pod manjim uvećanjem (Slika 4A–C, lijevi panel). Iz ovih rezultata smo zaključili da modifikacija djelomične sekvence L1 DE petlje umetanjem HIV-1 P18I10 ili T20 peptida nije značajno utjecala na morfologiju HPV: HIV VLP.
Slika 4. Elektronske mikrofotografije L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova. (A) Morfologija HPV16 VLP. (B) Morfologija L1:P18I10 VLP-ova. (C) Morfologija L1:T20 VLP-ova. Pročišćeni VLP-ovi su apsorbirani na bakrenim rešetkama obloženim UV zračenjem i negativno obojeni sa 2% uranil acetata. Slike su dobijene transmisijskom elektronskom mikroskopom. Traka predstavlja 200 nm pri uvećanju 59,000 (lijevi panel) i 100 nm pri uvećanju 135K (desni paneli), respektivno
3.5. Prezentacija i reaktivnost HPV-16 i HIV-1 epitopa
Da bi se potvrdilo da su sekvencijalni HIV-1 epitopi P18I10 ili 2F5 predstavljeni u hromatografski pročišćenim L1:P18I10 ili L1:T20 VLP-ovima, obavljena je Western blot analiza i indirektna ELISA korištenjem mAb specifičnih za epitop. Odabrali smo dobro poznato monoklonsko antitijelo (mAb), nazvano CAMVIR-1, da prepozna visoko konzervirani epitop (GFGAMDF, aa 230–236) HPV16 L1 proteina [39,58]. Prethodno objavljeno mAb ciljano na HIV-1 gp120 V3 epitop petlje (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) odabrano je da detektuje sekvencijalne epitope P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. S druge strane, široko neutralizirajuće antitijelo (bnAb) koje prepoznaje HIV-1 gp41 2F5 epitop (ELDKWA) protiv širokog spektra laboratorijskih HIV-1 sojeva odabrano je za karakterizaciju T20 peptida [ 60,61]. Western blot test testiran sa HPV16 L1 mAb pokazao je trake 55, 56 i 58 kDa koje odgovaraju HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 proteinu, respektivno (Slika 5A, B, lijevo). Molekularna težina (MW) proteina L1:P18I10 bila je slična HPV16 L1 proteinu (Slika 5A, lijevo). Traka koja odgovara L1:T20 proteinu uočena je nešto viša od HPV16 L1 proteina, kao što je predviđeno iz dodatne aminokiselinske sekvence (Slika 5B, lijevo). Trake od približno 56 i 58 kDa, koje odgovaraju proteinu L1:P18I10 i L1:T20, otkrivene su u Western blot testu sa anti-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 mAb, respektivno (Slika 5A, B, desno ). Smatrali smo da je molekularna težina (MW) anti-2F5-obojenog L1:T20 proteina tačna i odgovara očekivanim 58 kDa (Slika 5B, desno). Međutim, MW anti-HIV-1 gp120 V3-obojenog L1:P18I10 proteina je nešto niža (slika 5A, desno). Ovo se može pripisati heterogenoj strukturi himernih L1:P18I10 proteina. Budući da bi sekvencijalna konformacija epitopa mogla biti izgubljena pod uvjetom denaturiranja u SDS-PAGE. Stoga smo dalje izvršili indirektnu ELISA testu kako bismo demonstrirali konformacijski peptid P18I10 pravilno predstavljen na našim himernim L1:P18I10 VLP-ovima (Slika 5E). S druge strane, anti-HIV-1 gp120 V3 antitijelo petlje koje smo koristili prepoznalo je cijelu petlju HIV-1 V3, a ne epitop P18I10. Posljedično, ukupni anti-V3 signal je bio niži (Slika 5A, B, desni paneli). Uprkos tome, ovi rezultati su pokazali da su sekvencijalni HIV-1 P18I10 i T20 peptidi predstavljeni u HPV-u: HIV VLP.
Slika 5. Prikaz epitopa HPV-16 i HIV-1. (A, B) Sekvencijalna detekcija epitopa himernih L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova. Prečišćeni L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi su analizirani Western blot-om, koristeći anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP-ovi su korišteni kao kontrola. Molekularna težina proteina L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) i L1:T20 (58 kDa) označena je strelicom. Traka 1: marker molekularne težine proteina; Traka 2: HPV16 L1 protein; Traka 3: L1:P18I10 protein; Traka 4: L1:T20 protein. (C, D) Vezivanje HPV16 L1 mAb za himerne L1:P18I10 i L1:T20 VLP. (E) Vezivanje anti-HIV-1 gp120 V3 mAb za himerne L1:P18I10 VLP. (F) Vezivanje HIV-1 2F5 mAb za himerne L1:T20 VLP. Linijski graf indirektnih ELISA testova je urađen za detekciju konformacionih epitopa rekombinantnih HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 VLP vezanih za anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 ili 2F5 mAbs, respektivno. Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. Jednostavan test linearne regresije je urađen da se uporedi razlika linija prečišćenih L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova sa standardnom krivom komercijalnih L1 VLP-ova; ns: nije značajno; ** p < 0,01.
Štaviše, da bismo utvrdili da li se konformacijski epitopi HIV{{{{50}}}} konformacijskih epitopa prisutnih na HPV-u: HIV VLP-ovi mogu identificirati pomoću gp120 V3 i 2F5 neutralizirajućih antitijela in vitro, izvršili smo indirektni ELISA test da provjerimo specifičnost i reaktivnost vezivanja epitopa. Kao što je prikazano na slici 5C, D, HPV16 L1, L1:P18I10 i L1:T20 VLP su prepoznali anti-L1 mAb. Izvršili smo analizu linearne regresije da bismo uporedili nagib svake linije razblaženja. Rezultati su otkrili da se specifičnost vezivanja L1 epitopa za L1:P18I10 ili L1:T20 VLP nije razlikovala od HPV16 L1 VLP-ova. Štaviše, anti-HIV-1 gp120 V3 mAb je bilo u stanju da veže L1:P18I10 VLP, ali ne i HPV16 L1 VLP (Slika 5E). Pored toga, 2F5 mAb može prepoznati L1:T20 VLP, ali ne i HPV16 L1 VLP (Slika 5F). Nakon analize linearne regresije, razlika u specifičnosti vezivanja epitopa gp120 V3 između L1:P18I10 i HPV16 L1 bila je izuzetno značajna (p < 0,01%). Specifičnost vezivanja 2F5 epitopa L1:T20 VLP-ova značajno se razlikovala od HPV16 L1 VLP-ova (p < 0,01%). Ovaj obrazac je otkrio da hidrofobni ćelijski lipidi nisu potrebni za vezivanje 2F5-neutralizirajućih antitijela za HPV: HIV VLP in vitro. Iako je reaktivnost anti-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 neutralizirajućih antitela na HPV: HIV VLPs relativno blaga, vezivanje anti-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 mAb za HPV: HIV VLP je značajno specifičan za epitop.
3.6. Imunogenost L1:P18I10 i L1:T20 VLP nakon BALB/c imunizacije miševa
Procijenili smo HPV16- i HIV-1-specifične imune odgovore nakon BALB/c imunizacije miševa sa L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovima. Raspored imunizacije je prikazan na slici 6A. Budući da je imunogenost izazvana VLP-om nakon mukozne primjene bila generalno slabija nego nakon sistemske primjene, miševi su imunizirani intramuskularno jednom šestinom doze Gardasil-9 HPV16 L1 [22,62]. Adjuvans aluminijum hidroksi fosfat sulfata za dozu (10 µg/100 µL) himernog HPV: HIV VLP-a je podešen na istu koncentraciju (1 mg/1 mL) kao Gardasil-9. Kako bi se procijenila spolna razlika u ishodima vakcinacije, procijenjeno je poređenje odgovora antitijela između mužjaka (n=4) i ženki (n=4) miševa. U grupi L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP i Gardasil-9, odgovori ženki miševa na anti-HPV16 L1 antitela bili su u prosjeku viši od onih mužjaka miševa (Slika 6B). 2 od 4 (50%) L1:P18I10 VLP imunizirane ženke, 3 od 4 (75%) L1:T20 VLP imunizirane ženke i sve (100%) Gardasil imunizirane ženke miševa izazvale su veći titar anti-L1 antitijela nego mužjaci miševa. Anti-L1 odgovori izazvani ženkama miševa u grupi Gardasil-9 bili su značajno veći od mužjaka miševa (p=0.0041) (Slika 6B). Veoma nizak nivo odgovora anti-L1 antitela je detektovan u grupi BCG.HIVA prajminga i L1:P18I10 VLP pojačanja. Ovaj obrazac korespondira sa prethodnim nalazima koji opisuju da BCG pretežno indukuje T-ćelijske odgovore, a ne proizvodnju IgG [63].
Slika 6. Indukcija humoralnih imunoloških odgovora pomoću L1:P18I10 i L1:T20 VLP kod BALB/c miševa. Raspored imunizacije je prikazan u (A) Sve grupe miševa su imale jednaku spolnu distribuciju (mužjak n=4 i ženka n=4). Grupe A i B: homologna prime-boost imunizacija sa 10 µg L1:P18I10 ili L1:T20 VLP intramuskularno (im); Grupa C: prajming sa 106 cfu rBCG.HIVA intradermalno (id) i pojačavanje sa 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Grupa D: homologna prime-boost vakcinacija sa Gardasil-9 koja sadrži 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Grupa E: imunizacija dva puta sa PBS puferom. Interval prvog pojačanja bio je 2 sedmice. Krajnja tačka ovog ispitivanja bila je 28. dan. Serumi su sakupljeni i razblaženi u titru od 1:50 za ELISA test. (B) HPV L{30}}specifični IgG kod mužjaka i ženki miševa. (C–E) Epitop-specifični IgG inducirani L1:P18I10 i L1:T20 VLP. ELISA je izvedena za analizu anti-L1, anti-P18I10 i anti-T20 IgG induciranih od strane BALB/c miševa nakon različitih prime-boost kombinacija kao što je gore opisano. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD Jednosmjerni ANOVA (neparametarski) test je urađen da se uporede razlike između grupa. OD: optička gustina. Ns nije značajno; ** p < 0,01
Procijenili smo da li miševi imunizirani sa L1: P18110 i L1: T20 VLP mogu inducirati HPV-16 L1-specifična i HIV-1 epitop-specifična antitijela kod BALB/c miševa. VLP-indukovana IgG antitela u mišjim serumima merena su ELISA testom obloženim rekombinantnim HPV16 L1 proteinom, P18I10, odnosno T20 peptidima. Statistička razlika u L1-specifičnim IgG na serumskom titru od 1:50 otkrivena je u grupi Gardasil-9 u poređenju sa kontrolnom grupom PBS (p=0.0039). Anti-L1 odgovori među Gardasil-9, L1:P18I10 i L1:T20 VLP imuniziranim miševima bili su slični i nisu se značajno razlikovali (Slika 6C). BCG.HIVA2auxo.int prime i L1:P18I10 VLP miševi su izazvali vrlo nizak nivo anti-L1 IgG. Ovi rezultati sugeriraju da HPV: HIV VLP imunizirani miševi proizvode isti nivo anti-L1 IgG kao miševi imunizirani Gardasil-9-(Slika 6C). Iako se brojčano čini da grupa L1:P18I10 VLP ima trend prema višem nivou P18I10 epitop-specifičnih IgG u odnosu na druge imunizacijske grupe, ove razlike nisu bile statistički značajne (Slika 6D). Kod nekih od miševa imuniziranih L1:P18I10 VLP (4 od 8, 50%), uočena su veća anti-P18I10 vezujuća antitijela u poređenju sa Gardasil-9-imuniziranim miševima. Alternativno, analiza T-testa je otkrila da je razlika između grupe L1:P18I10 VLP i Gardasil-9 značajna (p=0.005) (podaci nisu prikazani). U grupi L1:T20 VLP, otkriven je značajno veći odgovor antitijela na peptid T20 u poređenju sa grupom Gardasil-9 (p=0.0083). Kao što se očekivalo, titri anti-T20 nisu bili detektovani u Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP i BCG.HIVA prime u kombinaciji sa L1:P18I10 VLP grupama za pojačavanje (Slika 6E). Titar T20 peptid-specifičnog antitela bio je relativno nizak. Ovo je vjerovatno zbog: (1) T20 je subdominantni peptid; (2) za izazivanje MPER ili 2F5 neutralizirajućih antitijela potrebni su peptidno-lipidni konjugati (Slika 6E). Sve u svemu, naši rezultati su pokazali da L1:P18I10 i L1:T20 VLP mogu indukovati HPV16-, ali slabe HIV-1-specifične odgovore antitijela kod miševa.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Da bismo procijenili imuni odgovor T-ćelija specifičnih za HPV i HIV kod miševa, slijedili smo raspored imunizacije prikazan na slici 7A. Pored toga, heterologno BCG.HIVA2auxo.int primiranje i pojačavanje L1:P18I10 VLPs upoređeno je sa homolognom L1:P18I10 VLP primenom i pojačanom imunizacijom kako bi se procijenila učestalost imunih odgovora specifičnih-HPV16 i HIV{12}} T-ćelija. Nije bilo razlika između Gardasil-9 i PBS grupa u pogledu sekrecije IFN-a nakon stimulacije splenocita HPV16 L1 VLP-ovima. Razlike u L1- specifičnoj sekreciji IFN-a također nisu bile značajne između L1:P18I10 VLP i Gardasil-9 grupa. Zaključili smo da se slabo lučenje L1-specifičnog IFN-a može pripisati niskoj koncentraciji (2 µg/mL) HPV16 L1 VLP-ova koji se koriste kao stimulansi. Grupa BCG.HIVA2auxo.int prime i L1:P18I10 VLP boost indukovala je veću učestalost splenocita koji luče IFN i uočene su značajne razlike u sekreciji IFN u poređenju sa miševima vakcinisanim Gardasil-9 grupom (p {{36 }}.0103). 3 od 8 miševa (~38%) izazvalo je najviše L1- specifične IFN-odgovore (Slika 7B). Ovo se može pripisati nespecifičnoj adjuvantnosti BCG prema našim prethodnim studijama [64–66]. Očigledni efekat pražnjenja, čak i kod divljeg tipa BCG-a, u skladu je sa sposobnošću derivata rBCG-a da djeluju kao moćni adjuvansi za naknadno pojačavanje vakcina [64,65]. Što se tiče HIV-1-specifičnih T-ćelijskih odgovora, najveća ukupna veličina ćelija koje formiraju IFN tačku (SFC)/106 splenocita je uočena kod BCG.HIVA2auxo.int miševa u poređenju s miševima koji su primali Gardasil{54} } vakcine ili L1:P18I10 VLP. Miševi koji su primijeni BCG.HIVA i pojačani sa L1:P18I10 VLPs izazvali su značajno veću sekreciju IFN-a u poređenju sa miševima vakcinisanim sa L1:P18I10 VLP homolognim prime-boostom (p=0.0268). Pored toga, uočeno je značajno veće lučenje IFN-a kod miševa vakcinisanih sa L1:P18I10 VLP u poređenju sa miševima koji su primali Gardasil-9 vakcine (p=0.0157) (Slika 7C). Kao što se i očekivalo, lučenje IFN-a nije bilo detektovano u grupama Gardasil-9 i PBS. Ovi rezultati su pokazali da (1) L1:P18I10 VLP-ovi izazivaju HIV{82}}specifične imune odgovore T-ćelija; (2) L1:P18I10 VLP-ovi izazvali su imuni odgovor T-ćelija specifičnih za HPV i (3) BCG.HIVA2auxo.int bi mogao pojačati HIV{92}}specifične imune odgovore T-ćelija izazvane L1:P18I10 VLP.
Slika 7. Indukcija odgovora T ćelija specifičnih za HPV16 i HIV-1 pomoću himernih L1:P8I10 VLP-ova i BCG.HIVA kod BALB/c miševa. Raspored imunizacije je prikazan na (A). Sve grupe miševa su imale jednaku spolnu distribuciju (mužjak n=4 i ženka n=4). Grupa A: homologna prime-boost imunizacija sa 10 µg L1:P18I10 VLP intramuskularno (im); Grupa B: prajming sa 106 cfu rBCG.HIVA intradermalno (id) i pojačavanje sa 10 µg L1:P18I10 VLPs im; Grupa C: homologna prime-boost vakcinacija sa Gardasil-9 koja sadrži 10 µg HPV16 L1 VLPs im; Grupa D: imunizacija dva puta sa PBS puferom. Interval prvog pojačanja bio je 2 sedmice. Krajnji cilj ovog ispitivanja bio je 28. dan. Splenociti su izolovani za IFN-ELISpot test. Imuni odgovori T-ćelija na HPV16 i HIV-1 procijenjeni su ex vivo pomoću IFN-ELISpot nakon stimulacije splenocita HPV16 L1 VLP i P18I10 peptidom. (B, C) HPV16 L1- i HIV-1 P8I10-specifični T-ćelijski odgovori izazvani L1:P8I10 VLPs i BCG.HIVA prime u kombinaciji sa L1:P18I10 VLP pojačanjem. Podaci su prikazani kao medijan ± SD. Jednosmjerni ANOVA test je urađen da se uporede razlike između grupa. Ns nije značajno; * p < 0,05.
4. Discussion
I HPV16 i HIV-1 su seksualno prenosive bolesti i trenutno su u fokusu mnogih studija o vakcinama. Iako su HPV profilaktičke vakcine komercijalizovane i prijenos HIV-1 je u velikoj mjeri kontroliran anti-retrovirusnim liječenjem (ART) i PrEP-om, hitna je potreba za efikasnom, sigurnom i pristupačnom himernom HPV: HIV vakcinom protiv oba virusa. U ovoj studiji, (1) pokazali smo da ekspresioni sistem 293F i metoda hromatografskog prečišćavanja mogu biti izvodljivi pristupi za proizvodnju i prečišćavanje himernih L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ova; (2) potvrdili smo da umetanje P18I10 ili T20 peptida u DE petlju HPV16 L1 kapsidnih proteina nije uticalo na in vitro stabilnost, samosastavljanje i morfologiju himernih HPV: HIV VLP; (3) Sekvencijalni i konformacijski peptidi P18I10 ili T20 izloženi DE petljama himernog HPV-a: HIV VLP-ovi mogu se otkriti anti-HIV-1 gp120 V3 i 2F5 neutralizirajućim antitijelima in vitro; (4) Himerni L1:P18I10 i L1:T20 VLP mogu izazvati HPV, ali slaba HIV{34}}specifična vezujuća antitijela kod BALB/c miševa. Nadalje, umetanje HIV-1 P18I10 ili T20 peptida u HPV16 L1 protein nije utjecalo na in vivo HPV16 L{42}}specifična antitijela; (5) L1:P18I10 VLP-ovi mogu inducirati i HPV16 i HIV{48}}specifične T-ćelijske odgovore; (6) BCG.HIVA prime i L1:P18I10 VLP pojačanje izazvalo je najveću veličinu splenocita koji proizvode IFN u poređenju sa L1:P18I10 VLP homolognim prime-boost kod BALB/c miševa. Ovi nalazi su podržali dalji razvoj HIV{59}} vakcina na bazi rBCG i himernog HPV-a: HIV VLP. Sve u svemu, ova studija pruža osnovnu strategiju koja bi mogla biti dostojna da podrži globalne napore za razvoj novih himernih vakcina zasnovanih na VLP-u za kontrolu HPV i HIV infekcija.
U ovoj studiji, L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi mogli bi izazvati isti nivo anti-HPV16 L1 vezujućih antitijela kao HPV Gardasil-9 vakcina. Međutim, L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovi izazivaju samo niske nivoe odgovora antitela koji se vezuju za HIV za epitope P18I10 i T20. Pretpostavili smo da bi to moglo biti zbog ELISA testnih ploča koje su obložene rekombinantnim HPV16 L1 proteinom, HIV-1 P18I10 peptidom i HIV-1 T20 peptidom, respektivno. Mišja anti-L1 antitijela inducirana našim L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovima mogu ciljati višestruke vezivne epitope L1 proteina. Nasuprot tome, mišja anti-HIV-1 antitela izazvana našim L1:P18I10 i L1:T20 VLP-ovima ciljaju samo jedan HIV peptid (P18I10 ili T20) na HPV: HIV VLP. Posljedično, ukupne maksimalne vrijednosti OD450 anti-HIV-1 vezujućih antitijela bile su mnogo niže od anti-HPV16 L1 antitijela.
Razlog zašto smo odabrali HPV16 L1 kapsidni protein DE petlju kao preliminarnu regiju umetanja HIV-1 imunogena odnosio se na prethodnu studiju koja je imunizirala miševe goveđim papiloma virusom (BPV): HIV VLP za indukciju odgovora antitijela [20]. Poznato je da epitopi locirani unutar površinski izloženih DE i FG petlji HPV L1 glavnih kapsidnih proteina dominantno doprinose unakrsnim neutralizirajućim antitijelima izazvanim vakcinom [67]. Nadalje, prethodne studije su pokazale da umetanje HIV-1 MPER u BPV L1 DE petlju može inducirati djelomično neutralizirajuća antitijela koja specifično prepoznaju nativnu konformaciju MPER u HIV-1 Env [20]. Međutim, nema podataka da li rekombinantni BPV L1:MPER VLP utiče na imunogenost i neutralizaciju protiv BPV nakon umetanja HIV-1 MPER u BPV L1 protein. U našoj studiji koja koristi HPV16 L1 VLP kao vektor za isporuku antigena HIV-a, uočili smo da umetanje peptida HIV-1 nije modificiralo HPV L1 strukturu, te da himerni HPV: HIV proteini još uvijek imaju sposobnost formiranja VLP-ova. Osim toga, sproveli smo koncept premošćavanja imunog sistema kako bismo demonstrirali uporedive imunološke odgovore između HPV: HIV VLP kandidata (našeg) i odobrene HPV vakcine zasnovane na VLP (licencirani Gardasil-9). Naši podaci su otkrili da umetanje HIV-1 P18I10 ili T20 peptida u himerni HPV: HIV VLP-ovi mogu izazvati sličan titar HPV16 L1-specifičnih vezujućih antitijela, u poređenju sa HPV Gardasilom-9 vakcina. Specifična za tip anti-HPV16 L1 vezujuća antitijela uočena s licenciranom HPV Gardasil-9 VLP vakcinom u poređenju sa himernim verzijama HPV Gardasil-9 VLP vakcine bila su u skladu s našim podacima.
Dužina i mjesto optimalnog HIV-1 stranog antigena ugrađenog u HPV16 L1 VLP i in vitro stabilnost rezultirajućeg himernog HPV: HIV VLP-a treba provjeriti prije imunizacije miševa. Naša trenutna studija je pokazala da umetanje P18I10 ili T20 peptida u HPV16 L1 protein nije uticalo na in vitro stabilnost, samosastavljanje i morfologiju himernih HPV: HIV VLP-ova. Ovi rezultati su bili u skladu sa prethodnim studijama koje su pokazale da umetanje HIV-1 MPER domena u sekvencu petlje BPV L1 DE nije uticalo na kapacitet BPV L1 kapsidnog proteina da se samo-sastavlja na VLP [20]. U osnovi, epitopi smješteni unutar površinski izloženih DE i FG petlji HPV L1 kapsidnih proteina dominantno doprinose indukciji L1-specifičnih unakrsno neutralizirajućih antitijela [67]. Ovdje smo pokazali da umetanje HIV-1 P18I10 ili T20 peptida u HPV16 L1 DE petlju nije uticalo na indukciju L1-specifičnih antitijela himernim HPV-om: HIV VLP nakon imunizacije miševa. Pored toga, epitopi HIV-1 P18I10 ili T20 na HPV16 DE petlji himernog HPV: HIV VLP su otkriveni in vitro i bili su imunogeni in vivo. HPV16 L1 VLP-ovi predstavljaju potencijalnu skelu za površinski prikaz HIV-1 epitopa od interesa. U ovoj studiji, izvršili smo indirektnu ELISA testu kako bismo demonstrirali konformacijski P18I10 i T20 peptid predstavljen na površini našeg himernog HPV: HIV VLP-a. U budućnosti, imuno-elektronska mikroskopija bi takođe mogla biti dodatni pristup za demonstriranje strukturne lokalizacije i organizacije antigena P18I10 ili T20 unutar HPV: HIV VLP.
Samosastavljanje je reprezentativni indeks in vitro stabilnosti HPV16 L1 VLP-ova. Poznato je da pH, jonska snaga, temperatura [52] i redoks okruženje koreliraju sa disulfidnim vezama HPV16 L1 kapsidnih proteina [53]. Raniji radovi na VLP-ovima papiloma virusa sugerisali su važnost disulfidnih veza za samosastavljanje L1 glavnog kapsida [68,69]. Formiranje disulfida ukazuje na veći cistein L1 kapsidnog proteina u odgovarajućoj geometriji [53]. Ove disulfidne poprečne veze povezuju ostatke 175 i 428 (za HPV16) koji stabilizuju HPV virione i VLP [70]. U ovoj studiji analizirali smo obrasce intermolekularnog disulfidnog unakrsnog povezivanja kao indirektne dokaze koji dokazuju da naši kapsidni proteini L1:P18I10 i L1:T20 imaju tendenciju samosastavljanja in vitro. Na slici 3A, pokazali smo da pročišćeni L1:P18I10 i L1:T20 VLP predstavljaju slične obrasce intermolekularnog disulfidnog umrežavanja kao HPV16 L1 VLP pod istim pH, jonskom snagom i termičkim uslovima. Na slici 3B, dalje smo pokazali da su pročišćeni L1:P18I10 i L1:T20 proteini bili sposobni da se samosastavljaju na veće čestice (veće od L1 pentamera MW 280 kDa) in vitro. Stoga, zajedno sa morfološkim samosastavljajućim VLP uzorkom (iako ikosaedralna struktura nije bila sasvim dobra) uočenim na slici 4, zaključili smo da je naš pročišćeni himerni HPV: HIV VLP stabilan in vitro. Osim stabilnosti VLP-a, treba uzeti u obzir i mnoge druge kritične faktore koji mogu utjecati na imunogenost himernog HPV-a: HIV VLP-ove, kao što je mjesto umetanja imunogena među različitim petljama VLP-a [71], doza, intervali prvog pojačanja i način primjene [22]. , itd.
Peptidi P18I10 izvedeni iz petlje HIV-1 gp120 V3 predstavljeni su u ćelijama inficiranim HIV-om pomoću molekula I klase glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC-I) [26]. CD8+, citotoksični T limfociti (CTL), mogu prepoznati MHC-I-restriktirane P18I10 antigene i lučiti različite citokine, kao što je IFN- za eliminaciju HIV-inficiranih ćelija [72-75]. Rekombinantna virusna ili plazmidna DNK su dobri nosioci vakcine za ekspresiju P18I10 peptida u ćelijama domaćina i induciranje P18I10-specifičnih ćelijskih odgovora putem MHC-I puta [76–79]. Na primjer, kombinovani režim pojačanja DNK primenom i modificiranog virusa vakcinije Ankara (MVA) bio je dovoljan za indukciju IFN- i CTL odgovora protiv epitopa P18I10 [79]. Naprotiv, egzogeni P18I10 peptidi nisu efikasno predstavljeni CD8+ T-ćelijama putem MHC-I puta [80,81] i zahtijevaju učešće odgovarajućih adjuvansa [82–85] ili nosača antigena, kao što su VLP-ovi. Na primjer, imunogenost sintetičkih P18I10 peptida dopunjenih adjuvansima bila je marginalna zbog odsustva determinanti T-pomoćnika [82-85]. Ranije je prijavljeno da HIV-1 Gag VLPs [86], VLP površinski antigen hepatitisa B (HBsAg) [87], parvovirus VP2 VLP [88] i papiloma virus L1 VLP [17–19] mogu djelovati kao vektori isporuke za prezentaciju CTL epitopa ograničenog na MHC-I in vivo. Iako je mehanizam VLP-induciranih MHC-I-restriktiranih T-ćelijskih odgovora još uvijek nejasan, struktura čestica VLP-a mogla bi imati koristi od endocitnog preuzimanja makrofaga ili dendritskih stanica, čime se pristupa citosolu i potom ulazi u tipičan MHC-I put [89, 90]. Osim toga, uočeno je da MHC-I-restriktirana determinanta P18I10 indukuje CD4+ pomoćne T-ćelijske odgovore putem MHC-II puta [91,92]. Hibridni BPV1 L1 VLP se mogu koristiti kao nosioci antigena epitopa za izazivanje terapeutskih CTL odgovora specifičnih za virus putem MHC-I i MHC-II puteva [17,19], pružajući obećavajuću strategiju za dizajn vakcine za kontrolu virusne infekcije. Neke rane studije su takođe ukazale na BPV L1 VLP-ove koji eksprimiraju epitop HPV16 E7 ili P18I10 epitop HIV-1 gp120 V3 petljom indukovane površine sluzokože, kao i sistemski VLP epitop-specifičan humoralni i T ćelijski imunitet [18]. U skladu s prethodnim studijama, preliminarno smo pokazali da naši himerni HPV: HIV (L1:P18I10) VLP mogu indukovati HIV-specifične imune odgovore T-ćelija kod BALB/c miševa nakon stimulacije splenocita peptidom P18I10. Pored toga, BCG.HIVA prajming je poboljšao HIV-1-specifične imune odgovore T-ćelija kod miševa. Međutim, multifunkcionalni imunološki odgovori T-ćelija inducirani L1:P18I10 VLP-ovima bi zahtijevali daljnje imunološke studije.
Širi odgovori CD8+ T-ćelija na višestruke konzervirane CTL epitope su korisni za prevazilaženje HIV-1 genetske raznolikosti i bijeg [7,93–100]. Racionalni dizajn HIV-1 imunogena T-ćelija, kao što je HIVA, trebao bi imati potencijal da odgovori na više CTL epitopa [34]. HIV-1 HIVA imunogen, koji je dizajnirao dr. Tomas Hanke, sastoji se od HIV-1 Gag proteina pune dužine u kombinaciji sa više CTL epitopa uključujući epitope P18I10 na C-kraju [34]. DNK, MVA i rBCG su odabrani kao sredstva za isporuku HIVA imunogena i inducirali su visoku magnitudu i širinu ćelijskih odgovora specifičnih za CTL epitop korištenjem heterolognih režima primarnog pojačanja u modelima miša i neljudskog primata (NHP) [34,101]. Naše prethodne studije su pokazale da je BCG.HIVA prime u kombinaciji sa MVA.HIVA boostom izazvao HIV-1-specifične IFN-proizvodne CD8+ T-ćelije kod BALB/c miševa [31–33,102]. Zanimljivo je da bi VLP mogli biti potencijalni pojačivač za povećanje HIV-specifičnih ćelijskih odgovora u heterolognoj imunizaciji rBCG [29,30] ili DNK vakcinama [103,104]. Na primjer, rBCG koji eksprimira HIV-1 Gag protein mogao bi efikasno pripremiti imuni sistem T-ćelija za jačanje Gag VLP-a u NHP modelima [29,30]. U trenutnoj studiji, pokazali smo da primanje BCG.HIVA može pojačati imune odgovore T-ćelija izazvanih HPV: HIV (L1:P18I10) VLP-ovima. Dalje ćemo istražiti veličinu polifunkcionalnih CD4+, CD8+ i memorijskih T-ćelija odgovora generiranih ovim rBCG prime i VLP režimom pojačanja.
cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem
Trenutno se naša istraživačka grupa fokusira na razvoj obećavajućih rBCG: vakcine protiv HIV-a koje eksprimiraju nove HIV-1 T-ćelijske imunogene, kao što su tHIVconsvX i HIVACAT (HTI) T-ćelijski imunogen, za poboljšanje HIV-a-1 varijantno podudaranje i širina odgovora T-ćelija. HIVconsvX imunogeni druge generacije su dizajnirani redefiniranjem očuvanih regija grupe M i korištenjem bivalentnog dizajna mozaika kako bi se maksimiziralo podudaranje potencijalnih epitopa 9-mer T-ćelija u vakcini sa globalnim varijantama [64]. HTI imunogen je dizajniran da pokrije mete T-ćelija na koje se reakcije T-ćelija uglavnom primjećuju kod HIV-1-inficiranih pojedinaca s niskim virusnim opterećenjem HIV{13}} [65,66]. Budući da je dokazano da su papiloma VLP nosioci višestrukih CTL epitopa [17], nastojali smo konstruirati himerične HPV16 L1 VLP-ove koji nose višestruke očuvane HIV-1 CTL epitope u kombinaciji s rBCG-om koji eksprimira ThivconsvX ili HTI T-ćelijske imunogene za indukciju šireg CTL imuni odgovori na HIV-1. Visoka gustina i višestruke kopije HIV-1 CTL epitopa predstavljene na himernom HPV-u: HIV VLP-ovi mogu poboljšati isporuku antigena imunološkom sistemu i inducirati veću učestalost CTL odgovora. Nasuprot tome, veća je vjerovatnoća da će rekombinantni BCG generirati nižu frekvenciju CTL odgovora zbog spore replikacije in vivo. Budući da BCG ima izrazit uticaj na diferencijaciju T ćelija, što znači da BCG može inducirati pamćenje CD8+ T ćelija kroz učešće CD4+ T-pomoćnih ćelija [105], ovo imunogeno svojstvo može učiniti BCG pogodnim kao primarni agens u heterolognim prime-boost režimima. Stoga smo očekivali da bi se naš HPV: HIV VLP mogao činiti obećavajućim pojačivačem za povećanje veličine i širine HIV{28}} CTL odgovora kada se primijeni rekombinantnim BCG koji eksprimira novi HIV-1 T-ćelijski imunogen .
T20 peptid sadrži visoko konzervirani linearni epitop 2F5 (ELDKWA). Za 2F5 antitelo prikupljeno od dugotrajno zaraženih HIV-om pacijenata je prijavljeno da ima široku neutrališuću efikasnost [106,107]. Smatra se da je MPER gp41 slabo imunogen, što je možda povezano s njegovom lokacijom blizu ćelijskog i virusnog fosfolipidnog dvosloja [108]. Upotreba DNK vektora koji predstavljaju MPER u lipidnom okruženju je korisna za indukciju gp41-specifičnih nAbs [109–111]. Na primjer, dokazano je da DNK vakcine koje kodiraju HIV-1 T20-, koje je dizajnirala dr. Britta Wahren, izazivaju odgovore neutralizirajućih antitijela (nAb) unakrsnih klada [109]. Nasuprot tome, mnogi rani pokušaji da se induciraju nAbs ciljani na gp41 korištenjem strategija peptida ili podjedinične vakcine su propali [112–116]. Nedavno su neke studije ukazale na BPV L1 VLP-ove koji eksprimiraju 2F5 epitop ili MPER HIV-1 gp41 indukovanih 2F5-specifičnih antitijela kod miševa rezultirali su neutralizacijom unakrsnog klada [20,21]. Sličan obrazac imunogenosti pronađen je kada je površinski antigen hepatitisa B (HBsAg) spojen sa epitopom HIV-1 2F5 ili MPER [59,117–119]. Ovdje smo pokazali da predstavljanje HIV-1 T20 i P18I10 peptida u našem himernom HPV16 L1 VLP može inducirati odgovore antitijela protiv HIV-1 i HPV16. Neutralizirajući epitopi stabilizirani na konformacijskoj skeli, kao što su HIV-1 funkcionalni šiljci ili VLP, mogli bi biti glavni tok dizajna imunogena B-ćelija za postizanje širokih neutralizirajućih antitijela (bnAbs) [93]. Međutim, većina novih bnAb epitopa (otprilike 90%) su nekontinuirani i konstituisani regioni spojeni u 3-dimenzionalne konfiguracije [120]. Iako se prezentacija diskontinuiranih epitopa na proteinskom skelu može predvidjeti kompjuterskim modeliranjem [121], ovi bnAb epitopi bi mogli biti izazvani da budu ugrađeni u HPV16 L1 proteinsku skelu bez omotača. Nasuprot tome, manjina HIV-1 B-ćelijskih imunogena, kao što je MPER (2F5) HIV-1 gp41 ili V3 petlja (P18IIB) gp120, sadrži linearne neutralizirajuće epitope i može biti pogodna za HPV: okosnica proteina HIV-a. Stoga smo odabrali linearni 2F5 neutralizirajući epitop koji je uključen u prošireni T20 peptid HIV-1 MPER u smislu povoljne strukture za formiranje -heliksa [122]. T20 peptidi bi se mogli spojiti i stabilizirati na L1 kapsidnim skelama kako bi se izazvali odgovori neutralizirajućih antitijela ako bi se mogla predstaviti nativna konfiguracija epitopa 2F5. U ovoj studiji smo otkrili da su 2F5 nAbs vezani za himerne HPV: HIV (L1:T20) VLP in vitro. Štaviše, L1:T20 VLP-ovi također mogu inducirati T20-specifična vezujuća antitijela kod BALB/c miševa. Postojao je sve veći dokaz da HIV-1 peptid indukovana antitijela imaju slična svojstva kao anti-HIV-1 fuzioni peptid Enfuvirtid da veže hidrofobni trans-membranski T20 ostatak koji se nalazi u MPER gp41 tokom HIV-1 fuzije i doprinose kontroli virusa [109,123,124]. Prema našim prethodnim pregledima, racionalan dizajn himernih vakcina baziranih na VLP-u za indukciju HPV i HIV-specifičnih neutralizirajućih antitijela i CTL odgovora bi uvijek trebalo razmotriti u smislu selekcije imunogena, vektora za isporuku antigena i režima primarnog pojačanja. U zaključku, ova studija je pokazala alternativnu platformu za ekspresiju zasnovanu na ćelijama sisara i skalabilnu metodu hromatografskog prečišćavanja za projektovanje himernih HPV: HIV VLP. Smatramo da će naše nove metode pročišćavanja pomoći u oporavku antigena HPV: HIV VLP-a iz ćelija sisara s ciljem smanjenja vremena, troškova i rada uz povećanje kapaciteta za industrijsku proizvodnju. Osim toga, pokazali smo da HPV16 L1 VLP mogu raditi kao platforma za isporuku za nošenje HIV-1 peptidnog antigena jer umetanje peptida P18I10 ili T20 u DE petlju HPV16 L1 kapsidnih proteina nije uticalo na in vitro stabilnost, samosastavljanje i morfologiju himernog HPV-a: HIV VLP i jeste ne ometa HPV16 L{107}indukciju specifičnih antitijela in vivo. S druge strane, himerni HPV: HIV VLP-ovi mogu izazvati HPV16 i HIV-specifične imune odgovore B i T-ćelija protiv oba virusa. Ovaj izvještaj istražuje mogućnost razvoja HIV{111}} vakcina zasnovanih na rekombinantnom BCG-u koji eksprimira HIV{112}} imunogene i HPV: HIV VLP, koje se mogu koristiti za imunizaciju protiv HIV-a{113}} djece. Budući da je razvoj efikasne himerične vakcine protiv HPV16 i HIV-a-1 još uvijek izazov, ovaj rad doprinosi razvoju novog himernog HPV-a: platforma za vakcinu zasnovanu na HIV VLP-u za kontrolu HPV16 i HIV-a{{118 }} infekcija, koja je hitno potrebna u zemljama u razvoju i industrijalizovanim zemljama.
Reference
1. UNAIDS Globalna statistika o HIV-u i AIDS-u-2018 Informativni list. 2019. Dostupno na internetu: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (pristupljeno 15. juna 2020.).
2. Baeten, JM PrEP za HIV: Ocjena A za dokaze, ali se čeka na uticaj. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]
3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; et al. Vakcinacija sa ALVAC-om i AIDSVAX-om za prevenciju HIV-1 infekcije na Tajlandu. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]
4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Glavne naučne prepreke u razvoju HIV vakcine: Istorijska perspektiva i budući pravci. Front. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]
5. Robinson, HL HIV/AIDS vakcine: 2018. Clin. Pharmacol. Ther. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]
6. Wang, Q.; Zhang, L. Široko neutralizirajuća antitijela i dizajn vakcine protiv HIV-1 infekcije. Front. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]
7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T ćelije u kontroli, liječenju i prevenciji HIV-a. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]
8. Pollard, AJ; Bijker, EM Vodič za vakcinologiju: Od osnovnih principa do novih razvoja. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]
9. Shapiro, SZ Lekcije za opšta vakcinološka istraživanja iz pokušaja da se razvije vakcina protiv HIV-a. Vakcina 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]
10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Prevalencija podtipova humanog papiloma virusa 16 i 18 među jemenskim pacijentima sa rakom grlića materice. Asian Pacific J. Cancer Prev. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]
11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Karakterizacija domena HPV16 L1 petlje u formiranju konformacionog epitopa specifičnog za tip. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]
12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Ćelijski posredovan imunitet izazvan česticama sličnim HPV 16 L1 virusu kod miševa. Microb. Patog. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]
13. Schiller, J.; Lowy, D. Objašnjenja za visoku moć HPV profilaktičkih vakcina. Vakcina 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]
14. Markowitz, LE; Schiller, JT Vakcine protiv humanog papiloma virusa. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]
15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Koncepti dizajna vakcina za HIV{4}} bazirane na virusima sličnim česticama. Front. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]
16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Dizajniranje vakcina baziranih na himernim virusima za humani papiloma virus i HIV: naučene lekcije. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]
17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH, čestice slične papiloma virusu za isporuku višestrukih citotoksičnih epitopa T stanica. Virology 2000, 273, 374–382. [CrossRef]
18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Imunizacija sluznice česticama sličnim papiloma virusu izaziva sistemski i mukozni imunitet kod miševa. Virology 1998, 252, 39–45. [CrossRef]
19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Čestice slične virusu papiloma mogu isporučiti definirane CTL epitope na put MHC klase I. Virology 1998, 240, 147–157. [CrossRef]
20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Spear, GT; Qiao, L. Čestice slične goveđem papiloma virusu koje predstavljaju konzervirane epitope iz membransko-proksimalnog vanjskog područja HIV-1 gp41 indukovane mukoznim i sistemskim antitijelima. Vaccine 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]
21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Spear, GT; Qiao, L. Indukcija mukoznih i sistemskih neutralizirajućih antitijela protiv virusa humane imunodeficijencije tipa 1 (HIV-1) oralnom imunizacijom goveđim papiloma virusom-HIV-1 gp41 himernim česticama sličnim virusu. J. Virol. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]
22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Način primjene himernog BPV1 VLP određuje karakter induciranog imunološkog odgovora. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]
23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, Heather; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Efikasno samosastavljanje humanog papiloma virusa tipa 16 LI i L1-L2 u čestice slične virusu. J. Virol. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]
24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Karakterizacija virusnih čestica u GARDASIL®-u pomoću kriotransmisione elektronske mikroskopije. Hum. Vaccines Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]
25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Citotoksični T limfociti specifični za HIV-1 gp160 antigen i sintetički P18IIIB peptid u HLA-A11-imuniziranoj osobi. AIDS Res. Hum. Retrovirusi 1994, 10, 19–25. [CrossRef]
26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Molekularna analiza TCR i peptid/MHC interakcije korištenjem peptida izvedenih iz P18-I10- sa jednom zamjenom D-amino kiseline. Biophys. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]
27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identifikacija i karakterizacija pod džepa na N-trimeru HIV-a-1 Gp41: Implikacija za ulazak virusa i cilj lijeka. Aids 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]
28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Pilot faza II studije o sigurnosti i imunogenosti HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) kod asimptomatskih HIV seropozitivnih subjekata. J. Infect. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]
30. Chege, GK; Burgers, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; et al. Robusni imunitet na auksotrofnu Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV vakcinu kandidata u modelu neljudskog primata. J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]
30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Grey, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Režim imunizacije sa primenom rekombinantnog BCG i Pr55gag virusnih čestica na bazi HIV tipa 1 podtipa C uspješno izaziva Gag-specifične odgovore kod pavijana. Vaccine 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]
31. Joseph, J.; Saubi, N.; Im, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Vakcinacija novorođenih miševa sa BCG.HIVA222 + MVA.HIVA pojačava HIV-1-specifične imune odgovore: Utjecaj starosti i puteva imunizacije. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]
32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Inženjering novog dizajna mikobakterijske vakcine za pedijatrijsku vakcinu protiv HIV-TB vektorisane lizinskim auksotrofom BCG-a. Mol. Ther. Metode Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]
33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitart, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Pretklinički razvoj BCG.HIVA2auxo.int, koji sadrži integrativni ekspresijski vektor, za HIV-TB pedijatrijsku vakcinu. Povećanje stabilnosti i specifičnog HIV-1 T-ćelijskog imuniteta. Hum. Vaccines Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]
34. Hanke, T.; McMichael, AJ Dizajn i konstrukcija eksperimentalne HIV-1 vakcine za jednogodišnje-2000 kliničko ispitivanje u Keniji. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]
35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Proizvodnja rekombinantnog proteina visokog nivoa i visoke propusnosti prolaznom transfekcijom ljudskih 293-EBNA1 ćelija koje rastu u suspenziji. Nukleinske kiseline Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]
36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Kromatografsko pročišćavanje u jednom koraku humanog papiloma virusa tipa 16 L1 proteina iz Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]
37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Ekspresija himernog HPV-HIV proteina L1P18 u pichia pastoris; pročišćavanje i karakterizacija čestica sličnih virusu. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]
38. GE. Upotreba CaptoTM Core 700 i Capto Q ImpRes u prečišćavanju čestica sličnih humanom papiloma virusu. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1–4.
39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Proizvodnja i karakterizacija monoklonskog antitijela na humani papiloma virus tip 16 korištenjem rekombinantnog virusa vakcinije. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]
40. Merck Canada Inc. Monografija proizvoda Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.
41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Kristalna struktura H-2D(d) MHC klase I u kompleksu sa HIV-1- izvedenim peptidom P18-110 pri rezoluciji 2,4 Å: Implikacije za T ćelije i NK ćelije prepoznavanje. Imunitet 1998, 9, 199–208. [CrossRef]
42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Trenutni peptidni inhibitori fuzije HIV tipa-1. Antivir. Chem. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]
43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktura malih čestica sličnih virusu sastavljenih iz L1 proteina humanog papiloma virusa 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]
44. Dan, popodne; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Humani papiloma virus 16 Kapsidi posreduju u nuklearnom ulasku tokom infekcije. J. Virol. 2019, 93, e{4}}. [CrossRef]
45. Zhou, J.; Doorbar, J.; Sunce, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identifikacija signala nuklearne lokalizacije humanog papiloma virusa tipa 16 L1 proteina. Virology 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]
46. Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Bioprocesiranje čestica nalik virusu: Izazovi i mogućnosti. Pharm. Bioproces. 2013, 1, 407–409.
47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Pozitivno nabijene sekvence kapsidnih proteina humanog papiloma virusa tipa 16 dovoljne su da posreduju u prijenosu gena u ciljne stanice preko receptora heparan sulfata. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]
48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Sinteza i sklapanje virusa sličnih čestica humanih papiloma virusa tipa 6 i tipa 16 u fisionom kvascu Schizosaccharomyces pombe. Virology 1995, 206, 126–135. [CrossRef]
49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Proizvodnja čestica sličnih virusu humanog papiloma virusa tipa 16 u transgenim biljkama. J. Virol. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]
50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Skalabilna proizvodnja HPV16 L1 proteina i VLP-a iz listova duhana. PLOS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]
52. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Proizvodnja čestica nalik L1 virusu humanog papiloma virusa tipa 16 od strane rekombinantnih ćelija Lactobacillus casei. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]
52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; High, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et al. Procjena termičke stabilnosti Gardasila®. Hum. Vakcina. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]
53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Kvantitativni opis in vitro skupa čestica sličnih virusu humanog papiloma virusa 16. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]
54. McCarthy, MP; White, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Kvantitativno rastavljanje i ponovno sastavljanje virusnih čestica humanog papiloma virusa tipa 11 in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]
55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papilomavirus L1 glavni kapsidni protein se samosastavlja u čestice slične virusu koje su visoko imunogene. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]
57. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Proizvodnja imunogenih humanih papiloma virusa-16 glavnih kapsidnih proteina izvedenih virusnim česticama. Indijski J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.
57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stabilizacija čestica sličnih humanom papiloma virusu nejonskim surfaktantima. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]
58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identifikacija tipa humanog papiloma virusa 16-specifičnog epitopa na C-terminalnom kraku glavnog kapsidnog proteina L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]
59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Glavni neutralizirajući domen HIV-I je visoko imunogen kada se eksprimira na površini jezgre hepatitis B čestica. Vaccine 1993, 11, 817–824. [CrossRef]
60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. Neutralizirajuća HIV-1 gp41 envelope Cluster II ljudska monoklonska antitijela pokazuju polireaktivnost za vezivanje za fosfolipide i proteinske autoantigene. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]
62. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; et al. Kašnjenje povratka HIV-1 nakon prestanka antiretrovirusne terapije putem pasivnog prijenosa ljudskih neutralizirajućih antitijela. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]
62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Niže.; et al. Korelacija između mišje i in vitro relativne potencije za čestice nalik virusu humanog papiloma virusa tipa 16 i uzorke vakcine Gardasil. Hum. Vakcina. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]
63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Napredak i izazovi u razvoju HIV vakcine zasnovane na rekombinantnoj Mycobacterium bovis BCG: naučene lekcije. Expert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]
