Karakteristični HPLC–MS profil granula formule Cistanche Deserticola
Oct 13, 2025
Autori: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Članstvo: Šangajski institut za kontrolu hrane i lijekova; NMPA Ključna laboratorija za kontrolu kvaliteta tradicionalnih kineskih lijekova, Šangaj 201203, Kina
Abstract
Karakteristična metoda hromatografskog profilisanja za granule formule Cistanche deserticola ustanovljena je na osnovu HPLC-MS. Koristeći ovjerene komade dekocije Cistanche deserticola i referentnu supstancu ehinakozida kao reference, deset serija uzoraka ekstrahovano je direktno sa 50% metanola i analizirano HPLC. Razdvajanje je izvršeno na koloni Phenomenex Luna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) sa gradijentom acetonitril–0,1% mravlja kiselina pri 1,0 mL/min, 30 stepeni, i UV detekcijom na 330 nm. Konstruisan je referentni karakteristični hromatogram sa devet uobičajenih pikova, među kojima je pet pikova identifikovano pomoću LC/Q‑TOF‑MS. Deset serija je pokazalo sličnost veću ili jednaku 0,981. Preciznost, stabilnost i ponovljivost metrike karakterističnog profila su bile zadovoljavajuće. Metoda je jednostavna, efikasno identifikuje granule formule Cistanche deserticola i može se koristiti za procenu kvaliteta.
Ključne riječi: Cistanche deserticola; granule formule; karakteristični hromatogram; ehinakozid; verbaskozid (akteozid); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; cistanche beneficije; najbolja cistanche na prodaju
Uvođenje Cistanchea
Cistanche (Rou Cong Rong)je poznati tonik tradicionalne kineske medicine (TCM) sa tonizirajućim, esencijalnim i laksativnim djelovanjem na bubrege. Prvi put je zabilježen u Shennongovom Classic of Materia Medica i naveden kao lijek vrhunskog kvaliteta. Izdanje Farmakopeje Narodne Republike Kine iz 2020. (I. dio) definira autentične izvore kao osušene, ljuskave, mesnate stabljike Cistanche deserticola YC Ma ili Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, s metodama obrade uključujući sirovi proizvod i prerađeni proizvod. Glavne hemijske komponente uključuju feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignane i šećere, koji podupiru farmakološke aktivnosti kao što su neuroprotekcija, anti-starenje, hepatoprotekcija i laksacija; izgledi za kliničku primjenu su široki. Među njima, PhG su najaktivniji sastojci.
Formula Cistanche deserticola granule su granule od jedne biljke pripremljene od prerađene C. deserticola koristeći moderne proizvodne tehnike za upotrebu u kliničkim receptima. Trenutno ne postoji nacionalni standard za njihovu kontrolu kvaliteta. Prethodne studije objavile su metode određivanja sadržaja ili otiske prstiju za granule formule C. tubulosa, ali ne postoje literatura o karakterističnim hromatogramima posebno za granule formule C. deserticola. U ovoj studiji prikupljeno je deset serija kako bi se po prvi put uspostavio HPLC karakterističan profil za granule formule C. deserticola, sa pet pikova identifikovanih pomoću LC-MS. Ovaj profil pruža efikasnu i naučnu osnovu za rigoroznu kontrolu kvaliteta granula formule C. deserticola.
Eksperimentalno od cistanche
1.1 Instrumenti i reagensi
Agilent 1100 HPLC sa UV-Vis detektorom i ChemStation (Agilent, SAD)
Agilent 1290 Infinity HPLC i Agilent 6530 Q‑TOF MS sa ESI izvorom (Agilent, SAD)
Sartorius elektronska vaga (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Kina)
Elmasonic P ultrazvučni čistač (Elma, Njemačka)
Referentni decokcioni komadi Cistanche deserticola i referentne supstance ehinakozida i verbaskozida (akteozida) kupljene su od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (serija br.. 121101-201603, 111670-201907, 111530-914). Cistanozid A, tubulozid A i izoverbaskozid su dobijeni od Shanghai Tauto Biotech (serija br.. 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitril (HPLC grade) je iz Mercka; ostali reagensi su bili analitičke čistoće (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Deset serija granula formule C. deserticola (PFKL1–PFKL10), tri serije decokcija C. deserticola (YP1–YP3) i tri serije standardnih dekocija C. deserticola (BZTJ1–BZTJ3) isporučio je Shanghai Wanshicheng Co., Ltd.
1.2 Priprema rastvora
1.2.1 Referentna rješenja
Referentna biljna otopina: Izvagati 1 g autentificiranih komada dekocije C. deserticola u začepljenu konusnu tikvicu, dodati 25 mL 50% metanola, sonikati (250 W, 35 kHz) 30 minuta, ohladiti, promiješati i centrifugirati. Koristite supernatant kao referentni biljni rastvor.
Rastvor referentne supstance: Pripremite ehinakozid u količini od 0,2 mg/mL u 50% metanolu.
1.2.2 Test rješenje
Samljeti uzorak; tačno izmeriti oko 1 g u odmernu tikvicu od 100 mL jantara. Dodajte 50 mL 50% metanola, začepite, protresite, izvažite, potopite 30 minuta i obradite sonikacijom 40 minuta (250 W, 35 kHz). Ostavite da se ohladi, ponovo izvagajte i nadoknadite izgubljenu težinu sa 50% metanola. Promiješajte, ostavite, filtrirajte i sakupite naknadni filtrat za analizu.
1.3 Instrumentalni uslovi
Uslovi hromatografije: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilna faza A: acetonitril; mobilna faza B: 0,1% mravlje kiseline u vodi; gradijent eluiranja: 0–5 min, 12% A; 5–15 min, 12%→20% A; 15–30 min, 20%→30% A. Brzina protoka 1,0 mL/min; talasna dužina detekcije 330 nm; temperatura kolone 30 stepeni; zapremina injekcije 10 μL. Teorijske ploče, izračunate na vrhuncu ehinakozida, trebaju biti veće ili jednake 5000.
Napomena: Originalni tekst navodi "15–30 min, 20%→30% A" dva puta; ovo se tumači kao jedan korak.
Uslovi masene spektrometrije: ESI u modu pozitivnih jona; opseg skeniranja m/z 50–1200. Postavke izvora: nebulizator (N2) 35 psi; gas za sušenje (N2) 15 L/min na 200 stepeni; plašt gas (N2) 12 L/min na 350 stepeni; kapilarni 3,5 kV; fragmentor 125 V; MS/MS energije sudara (CID) na 10, 20 i 40 eV.
Rezultati i diskusija
2.1 Predtretman uzorka i talasna dužina detekcije
Upoređivani su rastvarači za ekstrakciju (metanol, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol), načini ekstrakcije (ultrazvuk, refluks) i vremena (10, 20, 40, 60 min). Optimalni predtretman bio je 50% metanola uz ultrazvučnu obradu od 40 minuta. Kako PhG u C. deserticola pokazuju maksimalnu UV apsorpciju na 330 nm, za detekciju je odabrano 330 nm.
2.2 Izbor hromatografskih uslova
2.2.1 Kolone
Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) i Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) pružili su adekvatan sistem separacije; Relativna vremena retencije (RRT) karakterističnih pikova bila su unutar ±10% specificiranih vrijednosti. Laboratorije mogu birati između ovih.
2.2.2 Mobilna faza
Metanol–0,1% mravlja kiselina je dala loše razdvajanje za većinu pikova osim ehinakozida; stoga je acetonitril–0,1% mravlja kiselina usvojena i optimizirana za gradijent u Odjeljku 1.3, dajući optimalnu rezoluciju, brojeve ploča i stabilnu osnovnu liniju. Pošto nakon 30 minuta nije bilo eluiranja daljnjih pikova, započeta je ponovna ekvilibracija na početnoj kompoziciji.
2.3 Preciznost, ponovljivost i stabilnost
Koristeći serijski PFKL1, testni rastvor pripremljen prema Odjeljku 1.2.2 je ubrizgan šest puta pod uvjetima iz Odjeljka 1.3. RSD RRT i relativne površine pikova za devet karakterističnih pikova su bile sve<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4. Uspostavljanje karakterističnog hromatograma i tehničkih parametara
2.4.1 Referentni karakteristični hromatogram
Deset serija granula formule C. deserticola dosljedno je pokazivalo devet karakterističnih pikova koji su u vremenu zadržavanja odgovarali devet vrhova u referentnom biljnom rastvoru (Slike 1-2). Standardima je dodijeljeno pet pikova kao ehinakozid, cistanozid A, tubulozid A, verbaskozid (akteozid) i izoverbaskozid. Vrh ehinakozida je doprinio velikom i stabilnom udjelu ukupne površine pika i odabran je kao referentna supstanca. Kromatografsko ponašanje u deset serija je u suštini bilo konzistentno.
A.Blanksolution;B.Echinacoside;C.Testsolution;D.Cistanchedeserticola;E.Referentna karakteristika hromatograma.
Lista specifikacija Cistanche Tubulosa
2.4.2 Identifikacija vrha
Ispitna rješenja (Odjeljak 1.2.2) analizirana su pomoću LC–MS u pozitivnim i negativnim ESI modovima; pozitivni mod je davao bogatije informacije o vrhuncu i korišten je (Slika 3). Ukupno je identifikovano devet jedinjenja; pet je potvrđeno tačnom masom, vremenom zadržavanja i MS/MS fragmentima korištenjem standarda (Tabela 1). S obzirom da su PhGs glavni aktivni sastojci u C. deserticola i da se granule formule pripremaju vodenom ekstrakcijom, LC/Q-TOF-MS je potvrdio da su PhG glavni sastojci. U skladu s tim, devet karakterističnih pikova je katalogizirano, a pet pikova sa relativno jakim odgovorima je označeno u referentnom hromatogramu.
Slika 2 HPLCreferentna karakteristika hromatograma 3(S):Ehinakozid;4:CistanozidA;5:TubulozidA; 6: Akteozid; 7: Izoakteozid.
Slika 3 Trenutni hromatogram ekstrakcije ispitnog rastvora 3(S):Ehinakozid;4:CistanozidA;5:TubulozidA;6:Akteozid;7:Izoakteozid.
2.4.3 Specificirana relativna vremena zadržavanja
Na osnovu deset serija, srednji RRT (u odnosu na S vrh, tj. ehinakozid) bio je: 0,77 (Vrh 1), 0,86 (Vrhunac 2), 1,00 (Vrh 3, S), 1,17 (Vrh 4), 1,27 (Vrh 5), 1,62 (Peak 5), 1,32 (Peak 5), 1,32 (Peak 4). 1,67 (vrh 8) i 1,81 (vrh 9). RRT svakog vrha treba da padne unutar ±10% svoje specificirane vrijednosti.
Tabela 1. Parametri hromatografske vršne masene spektrometrije koji se odnose naCistanche deserticolaFormula Granule
| Peak | Ime | Molecular Formula | m/z | Vrijeme zadržavanja (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Nepoznato | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Nepoznato | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Echinacoside | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanozid A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubulozid A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Acteoside | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Izoakteozid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Nepoznato | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Nepoznato | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Procjena sličnosti
Kromatogrami iz deset serija su uvezeni u "Sistem za procjenu sličnosti za hromatografski otisak prsta TCM-a (2012A)." Koristeći uzorak S1 kao referencu, metoda medijana, vremenski okvir od 0,5 min, kalibracija u više tačaka i uparivanje podataka generirali su referentni otisak prsta (slika 4) sa devet uobičajenih vrhova. Vrijednosti sličnosti za svih deset serija bile su veće ili jednake 0,981 (0,981–0,999), što ukazuje na visoku sličnost među serijama.
2.6 Prenos količine i kvaliteta sa komada dekokcije na standardne granule dekokcije i formule
Podudaranje vrhova pokazalo je da komadi dekokcije C. deserticola, standardne dekokcije i granule formule imaju devet karakterističnih pikova, uključujući pet dodijeljenih pikova (ehinakozid, cistanozid A, tubulozid A, verbaskozid i izoverbaskozid) (Slika 5). Karakteristični profili su bili u velikoj korelaciji, a pravila prijenosa iz komada dekokcije → standardne dekokcije → granula formule bila su jasna. Od komada dekokcije do standardne dekokcije, površina vrha 6 (verbaskozid) se značajno smanjila, u skladu sa toplinskom labilnošću verbaskozida.
Slika 4 Prekrivanje HPLC karakterističnog hromatograma Formulagranula Cistanche deserticola
2.7 Poređenje karakterističnih hromatograma između granula formule C. deserticola i C. tubulosa
I C. deserticola i C. tubulosa sadrže ehinakozid, cistanozid A, verbaskozid, izoverbaskozid i tubulozid A. Međutim, ove dvije vrste se značajno razlikuju u sadržaju ehinakozida, a cistanozid A je prisutan samo u tragovima u C. tubulosa. Stoga, ehinakozid i cistanozid A mogu poslužiti kao diskriminatorni markeri za razlikovanje botaničkog porijekla (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Slika 5 Poređenje karakterističnih hromatograma Cistanchedeserticoladecoction-komada (A), standardne dekokcije (B) i granula (C) 3(S):Ehinakozid;4:CistanozidA;5:TubulozidA;6:Akteozid;7:Izoakteozid.
Zaključak (izmijenjeno prema zahtjevu: koja vrsta ima "bolji" sadržaj)
U okviru utvrđenog HPLC–MS karakterističnog profila zaCistanche deserticolaformule granula, a s obzirom na poređenje među vrstama,C. deserticolapokazuje bogatiji i uravnoteženiji profil feniletanoidnih glikozida: cistanozid A se lako otkriva u C. deserticola, ali je samo u tragovima uC. tubulosa, dokechinacosidepokazuje izražene razlike među vrstama. Stoga, za formulacije koje imaju za cilj veće agregatne nivoe ključnih PhG i jače ukupne prednosti cistanchea, preporučuje se Cistanche deserticola kao bolja vrsta u smislu sadržaja. Ako proizvod posebno ciljamaksimalni ehinakozid, odabrane serije C. tubulosa ćeuzeti u obzir ovisno o nabavci i testiranju serije. U praksi, "najbolji cistanche za prodaju" treba da se odredi kvantitativnim ispitivanjem ehinakozida, verbaskozida (akteozida) i cistanozida A, specifičnim za seriju, prema validiranoj metodi koja je ovde opisana.
Reference
[1] Tang SW. Classified Materia Medica. Peking: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Kineska farmakopejska komisija. Farmakopeja Narodne Republike Kine (Vol. 1). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Kineske tradicionalne i biljne droge, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et al. Moderna tradicionalna kineska medicina, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et al. Moderna kineska medicina, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et al. Časopis kineskih medicinskih materijala, 2017, 40(2):295.
Bilješke
Nazivi jedinjenja: ehinakozid; cistanozid A; tubulozid A; verbaskozid (akteozid); izoverbaskozid.
Očigledne tipografske greške koje se odnose na "muškatni oraščić" u izvoru su prevedene kao "Cistanche" u prijevodu na osnovu konteksta.
