Biotest za praćenje efekta tretmana krvi pupčane vrpce protiv starenja

Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Odsjek za biotehnologiju, College of Life Science, CHA University, Gyeonggi-do 13488, Republika Koreja

2. Centar za sistemsku biologiju, Opšta bolnica Massachusetts, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, SAD

3. Odsjek za sistemsku biologiju, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, SAD *Ovi autori su podjednako doprinijeli.

Autor za kontakt: Hakho Lee, PhD. Centar za sistemsku biologiju, Opća bolnica Massachusettsa, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, SAD. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, dr. Odsjek za biotehnologiju, College of Life Science, CHA Univerzitet, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Republika Koreja. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod uslovima licence Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Pogledajte http://ivyspring.com/terms za pune uslove.

Primljeno: 04.10.2018; Prihvaćeno: 2018. 11. 18.; Objavljeno: 01.01.2019

Cistanche ima efekat protiv starenja

Abstract

Pozadina: Tretiranje ostarjelih životinja plazmom u ranoj fazi razvoja (npr. plazmom iz pupčane vrpce) pokazalo je impresivan potencijal za usporavanje degradacije neuronskih i kognitivnih funkcija povezane sa starenjem. Prevođenje takvih nalaza u kliničku stvarnost, međutim, zahtijeva efikasne načine za procjenu efikasnosti liječenja; idealne metode treba da budu minimalno invazivne, pogodne za serijske analize, isplative i kvantitativne.

Metode: Razvili smo novi pristup biosenzora za praćenjeprotiv starenjaterapija. Unaprijedili smo dvije ključne komponente senzora: i) metabolit koji se prenosi krvlju identificiran je kao zamjenski marker starenja; i ii) razvijen je kompaktan i isplativ sistem analize za primjenu na licu mjesta. Tretirali smo ostarjele miševe bilo ljudskom plazmom pupčane vrpce ili fiziološkom otopinom; nepristrano profiliranje metabolita u plazmi miša otkrilo je arahidonsku kiselinu (AA) kao moćan indikator povezan sprotiv starenjaefekat. Zatim smo implementirali konkurentni magneto-elektrohemijski senzor (cMES) optimizovan za detekciju AA direktno iz plazme. Razvijena platforma je mogla detektovati AA direktno iz malih količina plazme (0.5 µL) u roku od 1,5 sata.

Rezultati: cMES testovi su potvrdili jaku korelaciju između nivoa AA iefekat protiv starenja: Nivoi AA, iako se smanjuju sa starenjem, povećavaju se kod ostarjelih miševa tretiranih plazmom, što je također pokazalo poboljšane performanse učenja i pamćenja.

Zaključci: cMES platforma će osnažiti i pre i kliničkeprotiv starenjaistraživanje omogućavanjem minimalno invazivnog, longitudinalnog nadzora liječenja; ovi kapaciteti će ubrzati razvojprotiv starenjaterapije, poboljšavajući kvalitet života pojedinca.

Ključne riječi: protiv starenja, arahidonska kiselina, profiliranje metabolita, magnetno-elektrohemijski senzor, biosenzor

Uvod

Starenje se sve više prepoznaje kao klinički faktor rizika za kognitivne degeneracije (npr. neurodegeneracija, demencija) i druge kronične bolesti (npr. rak, kardiovaskularne bolesti, mišićna degeneracija) [1]. Uz produženje ljudskog životnog vijeka i rastuću stariju populaciju, ulažu se značajni napori na rasvjetljavanju mehanizama starenja [1–3] i pronalaženju terapijskih strategija za usporavanje ili čak preokretanje procesa starenja [4]. Zaista, objavljeni su obećavajući rezultati studija na životinjama; odrasli miševi koji su primili transfuziju plazme od mladih miševa povratili su kognitivne funkcije, sinaptičku plastičnost i neuronsku aktivnost [5]. Brzi razvoj uprotiv starenjaOčekuju se tretmani i njihovo prevođenje u ispitivanja na ljudima [6]. Trenutne metrike za praćenje efekata liječenja, međutim, imaju ograničenu praktičnost, jer je metode često teško primijeniti kod ljudi (npr. invazivno snimanje mozga, kontrolirano promatranje ponašanja) i subjektivne (npr. upitnici o iskustvima pacijenata). Jedan od ključnih uslova za napredovanjeprotiv starenjaterapija stoga leži u razvoju kvantitativnih, minimalno invazivnih testova za praćenje tretmana.

Smatrali smo da će metaboliti biti moćan izvor zaprotiv starenjabiomarkeri. Metaboliti su esencijalni fenotip u organizmu i proučavaju se kao dijagnostički biomarkeri za druge bolesti [7]. Posebno, starenje je obično povezano s metaboličkim promjenama ili disfunkcijom, što utječe na ukupne profile metabolita u organizmima. Kao takvo, moguće je da bi praćenje sastava i/ili nivoa metabolita informisalo o efikasnostiprotiv starenjatretman. Nadalje, analize metabolita, posebno u obliku krvnih testova, mogu biti kvantitativne i minimalno invazivne; ove prednosti bi olakšale utvrđivanje različitih režima liječenja ili grupa pacijenata i praćenje dinamike (protiv) starenja kroz serijsko uzorkovanje.

Ovdje opisujemo novu strategiju biosenzora za praćenjeprotiv starenjatretman. Unaprijeđena su dva ključna elementa: i) metabolit koji se prenosi krvlju identificiran je kao zamjenski marker starenja; i ii) razvijen je brz, isplativ sistem analize za primjenu u rutinskim kliničkim okruženjima. Konkretno, tretirali smo kohortu ostarjelih miševa (starih oko 2 godine) plazmom iz ljudske krvi pupčanika. Sveobuhvatne metabolomičke analize na krvi miševa su otkrile da se arahidonska kiselina (AA), čiji se nivo značajno smanjivao sa starenjem, obrnuto povećao u tretiranoj grupi. Ovo zapažanje nas je dovelo do osmišljavanja magneto-elektrokemijskog senzora za male molekularne mete: optimizirali smo kompetitivnu elektrokemijsku reakciju u kojoj je AA bio uhvaćen na magnetnim kuglicama i koncentriran za veću osjetljivost. Razvijena platforma bi mogla detektovati AA direktno iz malih količina plazme (0.5 µL) u roku od 1,5 sata. Koristeći ovu platformu, mogli bismo dalje uspostaviti pozitivnu korelaciju između nivoa AA u krvi i boljeg učinka životinja u motoričkom zadatku.

Rezultati

Tretiranje odraslih miševa plazmom iz pupčane vrpce Slika 1a prikazuje ukupnu shemu eksperimenta.

Kao sredstvo koristili smo plazmu dobijenu iz uzoraka krvi iz pupčane vrpce. Prethodne studije su pokazale da su stari miševi kojima je ubrizgana plazma mladih miševa oporavili funkciju prostorne memorije, a sistemska primjena plazme iz krvi pupčanika poboljšala je kogniciju ovisnu o hipokampu kod starijih miševa [5, 8]. Injektiranje plazme, koja je lišena ćelijskih komponenti, minimiziralo je rizik od imunološkog odbacivanja zbog nepodudaranja vrsta. Ostarjeli miševi (početna dob, 18 mjeseci) su randomizirani i primili su ili plazmu (grupa za tretman) ili slani pufer (lažna grupa) putem rep-isprazne injekcije (130 µL; vidi sliku S1 za detalje). Kao pozitivna kontrola korišteni su mladi miševi (stari 3 mjeseca). Plazma izvedena iz krvi iz pupčane vrpce nije sakupljena i svakom mišu je više puta infundirana plazma od istog donora (slika S1). Nakon 4-sedmičnog tretmana, miševi su podvrgnuti testu ponašanja (tj. rotarod), a krv je uzeta za analize.

Slika 1. Eksperimentalni dizajn. Ljudska krvna plazma je davana mladim (3-mjesečni), starim (20- i 23-mjesečnim) i starim grupama tretiranim plazmom (20- i 23-mjesečni). Tri grupe su podvrgnute 2-probnim Rotarod testovima za mjerenje motoričke koordinacije i učenja. Neciljano profilisanje metabolita urađeno je na krvi iz tri grupe, i to najvišeprotiv starenja- bioinformatičkim pristupom određen je relevantan put. Biosenzor je razvijen za otkrivanje najvažnijeg metabolita puta.

Slika 2. Određivanje biomarkera metabolita povezanih s liječenjem plazmom iz krvi pupčanika. (A) Globalni profil perturbacije metabolita. Redovi odgovaraju karakteristikama (jedinstvena kombinacija m/z vrijednosti i vremena zadržavanja) od LC/MS i kolona do uzoraka. Redovi su hijerarhijski grupirani. (B) Prikaz rezultata PCA za smanjenje dimenzija. Uzorci su prikazani u odnosu na glavnu komponentu (PC) 1 i 2. Vrijednosti u zagradama legendi osa su proporcije varijanse objašnjene tim komponentama. PC1 najvjerovatnije objašnjava efekte protiv starenja, s obzirom da je grupa tretirana plazmom bila mnogo bliža mladoj nego lažnoj grupi. (C) Analiza obogaćivanja puta. Metaboliti su identifikovani upoređivanjem izmerenih m/z vrednosti sa informacijama o molekularnoj masi. Svaki krug predstavlja određeni put pronađen. Za dati put, x lokacija ili veličina kruga odgovara centralnosti relativne između (mjera utjecaja na put) metabolita, a y lokacija ili boja (niže p vrijednosti za crvenu, a veće za plavu) u mjeri u kojoj koji su metaboliti previše zastupljeni. Dominantni putevi imaju veće x i y vrijednosti. U skladu s tim, metabolizam arahidonske kiseline (AA) identificiran je kao najvjerovatniji put za objašnjenjeefekti protiv starenjaplazme krvi pupčanika.

Metaboličke analize na uzorcima krvi miševa

Prvo smo izvršili nepristrasno profiliranje metabolita malih molekula u plazmi miša. Uzorci krvi iz sve tri grupe miševa podvrgnuti su tečnoj hromatografiji i masenoj spektrometriji (LC/MS) analizama. Obradili smo m/z podatke pomoću MAIT-a (alata za automatsku identifikaciju metabolita) i identifikovali statistički značajne karakteristike putem ANOVA (8572 jedinstvene kombinacije m/z i vremena zadržavanja) (slika 2a). Analiza hijerarhijskog grupisanja (HCA) metabolita otkrila je dva ključna obrasca: i) profili metabolita su se izrazito razlikovali između starijih (neliječenih) i mladih miševa; i ii) profil ostarjelih miševa tretiranih plazmom bio je bliži profilu mladih miševa.

Analiza glavnih komponenti (PCA) otkrila je inherentne strukture metabolomskih podataka (slika 2b). Oko 50 posto ukupnih varijacija bilo je objašnjeno prvom (PC1) i drugom glavnom komponentom (PC2). Sve tri kohorte (tj. mlade, grupe tretirane plazmom i lažne grupe) smjestile su se na diskretne pozicije, što ukazuje da su identificirane biološki relevantne karakteristike za razlikovanje grupnih klasa. Zanimljivo je da se starija grupa tretirana plazmom udaljila od lažne prema mladoj grupi. Da bismo kvantifikovali razdvajanje grupa, izračunali smo hijerarhijsko grupisanje na dve glavne komponente. U dendrogramu, mlade grupe i grupe koje su tretirane plazmom bile su grupisane na nižem nivou različitosti (ili višem nivou sličnosti, 1120,9) od netretirane grupe (3162,5) (slika S2). Ovi rezultati pokazuju da se odabrane karakteristike (varijable ili redovi na slici 2a) mogu koristiti za zaključivanje biomarkera metabolita relevantnog za starenje iprotiv starenja. Obilježili smo karakteristike poznatim metabolitima koristeći bazu podataka u javnom domenu [9].

Dalje smo procijenili funkcije i međusobnu povezanost identificiranih metabolita, primjenom KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10] mapiranja. Za dati put, izmjerili smo i) preveliku zastupljenost metabolita kandidata i ii) njegovu važnost (tj. centralnost međusobne povezanosti) [11] kao ključnog međučvora između parova drugih metabolita (pogledajte Metode za detalje). Otkrili smo da je metabolizam arahidonske kiseline (AA) bio najzastupljeniji put (najviša y-vrijednost na slici 2c), a metaboliti na tom putu su se locirali na komunikacijskim putevima (više x-vrijednosti na slici 2c) i upravljaju protokom informacija. Među mnogim metabolitima u metabolizmu AA, odabrali smo samu AA kao biomarker; kao početni ulazak u put, samo AA može biti predstavnik drugih poremećenih metabolita.

Konkurentni magneto-elektrohemijski senzor (cMES) za detekciju AA u plazmi

Zatim smo krenuli da unapredimo brzi sistem za analizu na licu mesta za detekciju AA. Odlučili smo se za korištenje magneto-elektrohemijske senzorske tehnologije [12–17]. Kombinira obogaćivanje i detekciju meta u jednu platformu: magnetne perle (MB) se koriste za hvatanje i označavanje molekularnih ciljeva, a mete vezane za kuglice se detektuju putem elektrohemijskog sensinga. Ovaj pristup ima mnoge praktične prednosti: i) prirodni uzorci (plazma ili krv) mogu se direktno koristiti bez potrebe za pročišćavanjem uzorka; ii) test postiže visoku osetljivost detekcije putem magnetnog obogaćivanja i enzimskog pojačavanja signala; iii) na osnovu šeme električne detekcije, senzori se mogu lako minijaturizirati kao prenosivi uređaj (slika 3a).

Međutim, otkrivanje AA putem magneto-elektrohemijskog senzora predstavljalo je tehnički izazov; budući da je AA mali molekul (~304,5 Da), teško je primijeniti imunotestiranje pomoću para AA-antitijela. Stoga smo istražili kompetitivni format analize (cMES; kompetitivni magneto-elektrohemijski senzor) koji je zahtijevao samo jedno AA antitijelo (slika 3b). Za hvatanje cilja, obložili smo MB s AA-antitijelima (MBAb). Pripremili smo i konkurentsko sredstvo (AA-HRP) konjugacijom AA sa oksidirajućim enzimom (peroksidaza hrena, HRP). Konkretno, koristili smo oblik haptena; AA je konjugirana na albuminu goveđeg seruma (BSA) i dalje konjugirana s HRP na BSA nosač (slika S3). Za cMES test, uzorci krvi su pomešani sa MBAb i AA-HRP. Količina AA-HRP bila je dovoljna da zasiti AA-vezujuća mjesta u MBAb (Metode). To bi dovelo do različitog opterećenja HRP-a na MB, ovisno o endogenim količinama AA u uzorcima. Uzastopno dodavanje hromogenog elektronskog medijatora (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin, TMB) generisalo je električnu struju koja je očitana planarnom elektrodom. Vrijeme reakcije za hvatanje AA i TMB inkubaciju je optimizirano kako bi se maksimizirao nivo signala (slika S4).

Slika 3. Konkurentni magneto-elektrohemijski senzor (cMES) za AA test. (A) Šema uređaja. cMES uređaj ima mali otisak i omogućava

operacije na licu mesta. (B) Osmislili smo kompetitivni elektrohemijski test za detekciju AA. Magnetne kuglice (MBAb) su konjugirane s antitijelima protiv AA.

Kontrolni uzorci su sadržavali samo AA-HRP i pomiješani su sa magnetnim perlama. Ispitni uzorci su pomešani sa magnetnim perlama i AA-HRP. (C) Električne struje

mjereno prenosivim cMES čitačem. U cMES testu, veličina struje opada sa povećanjem koncentracije AA [AA]. Signal iz kontrole

uzorak je postavio osnovnu liniju za [AA]=0 ng/mL. Kao analitička metrika korištena je strujna razlika (∆I) između kontrolnog i ciljanog uzorka plazme. (D)

Poznate količine AA su dodane u serumu i izmjerene pomoću cMES. Granica detekcije bila je ~ 126 ng/mL. (E) cMES i ELISA su upoređeni za

podudarnost. Rezultati oba modaliteta su pokazali dobro slaganje (R2=0.959). Podaci se prikazuju kao srednja vrijednost ± SEM iz trostrukih mjerenja.

Slika 4. AA mjerenja u uzorcima plazme. (A) Analiza vremenskog toka nivoa mišjeg AA nakon injekcije plazme. Ubrizgali smo 13{{10}} μL plazme (koncentracija AA=7.2 µg/mL) u miševe (n=6) i sakupili krv miševa nakon 3, 7 i 14 dana. Zatim su praćeni nivoi AA u krvi miševa. Nivoi AA su se značajno povećali trećeg dana i vratili se na normalni nivo nakon 7 dana. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" analizirani="" su="" uzorci="" mišje="" plazme.="" u="" kontrolnoj="" grupi="" (n="5)," mladi="" miševi="" (starosti,="" 5="" i="" 8="" mjeseci)="" imali="" su="" viši="" nivo="" aa="" od="" lažno="" tretiranih="" starih="" miševa="" (starosti="" 20="" i="" 23="" mjeseca;="" n="8)." za="" grupu="" tretiranu="" plazmom="" (n="5)," uočeno="" je="" trajno="" povećanje="" aa.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (c)="" uzorci="" plazme="" iz="" istih="" kohorti="" kao="" u="" (b)="" analizirani="" su="" masenom="" spektrometrijom.="" nivoi="" aa="" pokazali="" su="" sličan="" trend="" kao="" što="" je="" izmjereno="" pomoću="" cmes-a.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" podaci="" se="" prikazuju="" kao="" srednja="" vrijednost="" ±="">

Kao rezultat kompetitivnog testa, veličina električne struje se smanjila sa višim koncentracijama AA u plazmi ([AA]). Stoga smo pripremili kontrolni uzorak inkubacijom MBAb samo sa AA-HRP. Kontrolni uzorak je korišten za postavljanje gornje osnovne linije (tj. [AA]=0 ng/mL) za izračunavanje razlika signala; izmjerene su električne struje iz kontrolnog i uzorka plazme, a neto razlika |∆I |=|Icontrol - Iplasma|je dobijeno (slika 3c). Takve

diferencijalna mjerenja su također kompenzirala uobičajeni pozadinski signal.

Eksperiment titracije (Slika 3d) koristeći uzorke sa različitim količinama AA otkrio je granicu detekcije (LOD) od ~125,9 ng/mL. LOD testa bio je ~300- puta niži od tipične koncentracije AA od (38 µg/ml) u plazmi mladih miševa (5 mjeseci, n=2). Na osnovu ovih rezultata, razrijedili smo početne uzorke plazme (100- puta) dodavanjem puferske otopine (vidi Metode). Signal nespecifičnog vezivanja bio je blizu intrinzičnog pozadinskog nivoa (~43 nA), potencijalno je imao koristi od visokog faktora razblaženja. Također smo potvrdili da se rezultati testa poklapaju sa onima iz konvencionalne ELISA (R2=0.961, slika 3e). cMES test je, međutim, bio brži (1 sat) od ELISA (4 sata), uglavnom zbog kinetike brzog vezivanja; u cMES-u, MB-ovi hvataju AA u cijeloj zapremini uzorka (3-dimenzionalna difuzija), dok se AA hvatanje oslanja na 1-dimenzionalnu difuziju u ELISA-i zasnovanoj na ploči.

Praćenje AA kod miševa tretiranih plazmom

Primijenili smo cMES za analizu nivoa AA kod miševa nakon jednog tretmana plazmom. Pošto je AA prirodno prisutan u ljudskoj krvi pupčanika, injekcija plazme bi dodatno povećala nivoe AA kod miša. Prosječna koncentracija AA iz šest različitih ljudskih plazmi krvi pupčanika bila je 7,2 ± 0,5 µg/mL (srednja vrijednost ± SEM). Ubrizgali smo 130 µL ljudske plazme iz krvi pupčanika miševima (n=6) i pratili njihove nivoe AA (slika 4a). Injekcija plazme je odmah povećala nivoe AA u krvi (3. dan; p < 0,01,="" u="" poređenju="" sa="" svim="" drugim="" vremenskim="" tačkama),="" ali="" je="" efekat="" bio="" privremen;="" nivoi="" aa="" su="" se="" vratili="" na="" normalu="" 7="" dana="" nakon="" tretmana="" (p="0.34," u="" poređenju="" sa="" vremenskom="" tačkom="" prije="" injekcije="">

Zatim pratimo nivoe AA u plazmi nakon potpunog rasporeda tretmana (slika S1). Korištene su tri različite kohorte miševa: plazma tretirana (n=8) i lažna (n=8) starosna grupa (20-23 mjeseci) i mlada kontrolna grupa (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Tretman plazmom koji dovodi do poboljšanja kognitivnih sposobnosti i ponašanja kod starijih miševa

Dalje smo procjenjivali fenotipove ponašanja životinjskih kohorti, posebno evaluirajući njihovo motoričko učenje i funkcije pamćenja. Izvršili smo {{0}}probne testove na rotarodu 1 i 4 mjeseca nakon tretmana plazmom ili lažnog tretmana (slika 5a); latencija (vrijeme rada) miša prije nego što padne na rotirajući štap korištena je za procjenu motoričkih performansi životinje. 1 mjesec nakon tretmana (20-mjesečni), latencija i lažne i grupe tretirane plazmom bila je značajno niža (p < 0,0001)="" nego="" kod="" mladih="" (5-mjesečni="" )="" grupa="" (slika="" 5b).="" grupa="" koja="" je="" tretirana="" plazmom,="" međutim,="" pokazala="" je="" postepeno="" poboljšanje="" u="" motoričkom="" učenju="" i="" pamćenju,="" dok="" je="" isti="" fakultet="" opao="" u="" lažnoj="" grupi.="" promjene="" u="" nivou="" aa="" su="" nastavile="" sa="" promjenama="" ponašanja,="" što="" bi="" moglo="" poslužiti="" kao="" rani="">protiv starenjaefekat tretmana (slika 5c).

Analize moždanog tkiva (slike 5d, 5e) pokazale su da stariji miševi (lažna grupa) imaju manju površinu DCX-pozitivnih ćelija u subventrikularnoj zoni od mladih miševa. Suprotno tome, površina DCX-pozitivnih ćelija se povećala kod životinje tretirane plazmom i ostala nepromijenjena (p=0.04) što ukazuje da je ubrizgana plazma krvi pupčanika stimulirala neurogenezu starog mozga. Rezultati sugeriraju potencijalnu korist liječenja plazmom na trajnu neurogenezu koja je rezultirala poboljšanom motoričkom funkcijom u liječenoj grupi.

Diskusija

Napredak u terapijama podmlađivanja istovremeno povećava potrebu za objektivnom i kvantitativnom mjerom za očitavanje efikasnosti tretmana. Stoga smo osmislili našu studiju kako bismo identificirali molekularne biomarkere koji najbolje mogu objasniti fenotipske karakteristike starenja iprotiv starenjatretman. Naši eksperimenti na životinjama doveli su do sljedećih zapažanja: i) profili metabolita mladih i odraslih kohorti miševa su očigledno različiti; i ii) injektiranje plazme ljudske pupčane vrpce u ostarjele miševe mijenja njihove metabolitske obrasce bliže onima kod mladih miševa. Zanimljivo je da smo pronašli arahidonsku kiselinu (AA) kao najefikasniji surogat biomarker zaprotiv starenjatretman; Metabolizam AA bio je vrlo nereguliran kako kod mladih tako i kod miševa tretiranih plazmom, te je utvrđeno da igra ključnu ulogu u interakciji s drugim metaboličkim putevima kao što je metabolizam linolne kiseline [10, 18].

Dalje smo razvili brzi, prenosivi senzorski sistem (cMES) kako bismo olakšali otkrivanje AA u rutinskim istraživanjima i kliničkim okruženjima. Posebno smo integrisali kompetitivnu šemu ispitivanja sa imunomagnetnim obogaćivanjem u pokušaju da detektujemo male molekularne mete (tj. metabolite) direktno iz uzoraka plazme. Ova kombinacija donosi sljedeće prednosti. (i) Test ima koristi od brze kinetike vezivanja, budući da magnetne kuglice hvataju AA u cijeloj zapremini uzorka (3-dimenzionalna difuzija). (ii) Procesi analize (npr. koraci ispiranja) su pojednostavljeni sa spoljnim magnetima koji se koriste za sakupljanje kuglica. (iii) Magnetskim koncentriranjem AA vezanih perli u blizini elektrode za detekciju, ukupni analitički signal se može poboljšati (~72 posto) [12]. Zaista, pokazali smo da cMES test koristi<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Slika 5. Bihevioralni i molekularni testovi. (A) 2-probni Rotarod testovi su sprovedeni 1 i 4 mjeseca nakon injekcije plazme. (B) Grupa tretirana plazmom

pokazao progresivno poboljšanje motoričke koordinacije; učinak je na kraju bio blizak onome kod mlade grupe (drugo ispitivanje nakon 3 mjeseca). Vrijeme rada lažne grupe smanjivalo se sa starenjem. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" za="" grupu="" tretiranu="" plazmom,="" povećanje="" nivoa="" aa="" prethodilo="" je="" poboljšanju="" motoričke="" funkcije.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (d)="" ćelije="" mozga="" u="" subventrikularnoj="" zoni="" su="" imuno="" obojene="" na="" marker="" neurogeneze,="" dvostruki="" kortin="">

Skalirana traka je 50 µm. Imajte na umu da je lažna grupa imala značajno manju površinu DCX-pozitivnih ćelija u subventrikularnoj zoni od mladih miševa, dok se površina povećala kod životinja tretiranih plazmom i ostala nepromijenjena. (E) Izmjerena je površina DCX-pozitivnih ćelija na slici (D). *p < 0.05;="" ***p=""><>

Pokazalo se da AA potiče rast mišića i razvoj mozga [19, 20]. Drugi izvještaji su također istakli potencijalne prednosti AA uprotiv starenja[21, 22]. Trenutna studija je u skladu sa ovim nalazima, ali je njen opseg bio ograničen na uspostavljanje korelativne relacije između nivoa AA iprotiv starenjafenotipovi. Serijski monitoring AA je, međutim, pokazao da je povećanje AA kod miševa tretiranih plazmom vjerovatno iz endogenih izvora, a ne iz transfuzirane plazme. Štaviše, održivoprotiv starenjaefekti su uočeni kod miševa primatelja čak 4 mjeseca nakon završetka tretmana plazmom. Poboljšano je motoričko učenje i funkcije pamćenja; a broj neuronskih prekursorskih stanica se povećao u mozgu. Ova zapažanja snažno ukazuju na fiziološke promjene kod miševa tretiranih plazmom; tačan mehanizam tek treba da se razjasni.

Nekoliko drugih ograničenja ove studije trebalo bi da se pozabave budućim istraživanjima. Prvo, cMES test treba poboljšati radi veće preciznosti. Konkretno, s nedostatkom pravih negativnih uzoraka (tj. uzoraka krvi bez ikakvog endogenog AA), bilo je teško objasniti signale iz nespecifičnog vezivanja. Moguće je da bi efekat krvnih matrica mogao biti zanemarljiv jer smo uzorke razrijedili 100-put. Takvu pretpostavku, međutim, treba potvrditi korištenjem AA-deletiranih uzoraka plazme koji bi mogli biti pripremljeni iz mišjeg modela s nedostatkom AA [23] ili putem imunodeplecije AA. Drugo, fokusirali smo se na otkrivanje jednog metabolita u metabolizmu AA radi jednostavnosti, ali ovaj pristup može zanemariti biološki kontekst kao što su interakcije između metabolita na datom putu. Uključivanje panela metabolita bi bolje uhvatilo metaboličke perturbacije i povećalo dijagnostičku točnost. cMES se može lako skalirati da detektuje različite markere uz trošenje malih količina uzoraka. Treće, interpolacija trenutnih nalaza ljudima bi bila izazovna. Iako miševi i ljudi dijele slične metaboličke puteve, miševi imaju 7- puta veću brzinu metabolizma od ljudi [24]. Neophodna su ispitivanja na ljudima kako bi se odredile optimalne doze plazme za infuziju i postavile osnovne linije za biomarkere; na osnovu studija na životinjama, planiramo takve studije na ljudima. Ovi napori će ubrzati razvojprotiv starenjaterapije, poboljšanje kvaliteta života pojedinca kao i smanjenje društvenog opterećenja.

Metode

Eksperimentalni dizajn

Plazma je odvojena od ljudske krvi iz pupčane vrpce prikupljene prilikom porođaja. Plazma krvi iz pupkovine davana je intravenskom infuzijom starim miševima (18-mjesečni), i lažnom kontrolom (18-mjesečni) i mladim miševima (3-mjesečni kao pozitivni kontrola) je ubrizgan fiziološki rastvor. 1 i 4 mjeseca nakon transplantacije, 2-probni rotarod testovi su provedeni za procjenu motoričke koordinacije i dugoročne memorije (slika S1). Urađeno je neciljano profilisanje metabolita na krvi iz tri grupe i bioinformatičkom analizom utvrđeno jeprotiv starenjarelevantni put (metabolizam arahidonske kiseline). Biosenzor je razvijen za lako i efikasno otkrivanje arahidonske kiseline koja cirkuliše krvlju.

Priprema uzorka krvi iz pupkovine

Ljudska krv iz pupčane vrpce je prikupljena u okviru Institucionalnog odbora za pregled Opće bolnice CHA (Seul, Koreja, IRB br. CHAMC-2015- 08-130-009). Krv iz pupčane vrpce donirana je od 4 donatora i tretirana citrat-fasfat-dekstrozom sa adenin (CPDA-1) antikoagulansom. Ljudska krv iz pupčanika je izolovana centrifugiranjem na 2,000 g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Izolovani uzorci plazme su pohranjeni na -80 stepeni i korišćeni sa jednim ciklusom zamrzavanja-odmrzavanja na sobnoj temperaturi.

Eksperimenti na životinjama

Protokole za životinje odobrio je CHA univerzitetski institucionalni komitet za negu i upotrebu životinja (IACUC). Koristili smo 18-mjesečne ženke C57BL/6 miševa za procjenu metaboličkih poremećaja i fenotipova ponašanja koji su u korelaciji sa starenjem iprotiv starenja. Pozitivne kontrole bile su 3-mjesečne ženke C57BL/6 miševa. Svi miševi su uzgajani na sobnoj temperaturi u standardnom ciklusu od 12 sati svjetlo-mrak. Za odrasle miševe, plazma iz krvi pupčanika ili fiziološki rastvor (130 µL) je ubrizgan intravenozno 12 puta tokom 4 nedelje. Izolirana ljudska plazma krvi pupčanika nije sakupljena, a određena životinja je primila plazmu krvi iz pupčanika od istog donora. Broj životinja korištenih u svakom eksperimentu opisan je u odgovarajućim odjeljcima metoda. Plazma je sakupljena centrifugiranjem (3,000 g, 15 min na sobnoj temperaturi).

Akvizicija metabolita i analiza podataka

Za profilisanje metabolita koji se prenose krvlju, krv je sakupljena od miševa punkcijom srca u određenim vremenskim tačkama: mlada grupa (3-mjesečni, n=10), lažna grupa ({{ 4}}mjesečni, n=10; 23-mjesečni, n=12), grupa tretirana plazmom (20-mjesečna, n {{13 }}; 23-mjesečni, n=5). Uzorci krvi su analizirani pomoću sistema tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS) (Agilent). Konvertovali smo LC/MS datoteke u standardni mzXML format (ProteoWizard) [25], a zatim ih obrađivali pomoću MAIT-a (alata za automatsku identifikaciju metabolita) [26] za detekciju karakteristika, statističku analizu i identifikaciju metabolita. Statistički značajne karakteristike (tj. ionizirani i/ili fragmentirani metaboliti) su identificirani analizom varijanse (ANOVA). Ove karakteristike su uparene sa svim mogućim metabolitima u bazi metaboloma [9] na osnovu omjera masa/naboj jona masenog spektra (m/z tolerancija od 0.005). Okarakterizirali smo globalne promjene metabolita putem analize hijerarhijske klasterizacije i inherentne strukture metabolomskih podataka putem analize glavnih komponenti (PCA). Dvije ili tri tehničke replike (osiguravajući da je tehnička varijacija mnogo manja od biološke varijacije) po mišu uključena su u nenadgledano učenje kao što je PCA i hijerarhijsko grupiranje. Hijerarhijsko grupisanje na glavnim komponentama (HCPC) izvedeno je od strane FactoMineR, R paketa [27]. Za funkcionalnu analizu, najvjerovatniji metabolički putevi koji će biti poremećeni starenjem i tretmanom plazmom određeni su KEGG analizom puteva (MetaboAnalyst 3.0) [28]. Hipergeometrijska distribucija je korištena za mjerenje prevelike zastupljenosti odgovarajućih metabolita u specifičnim KEGG putevima.

Priprema imunomagnetnih kuglica

Magnetne kuglice (5 mg) obložene epoksi grupama (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) suspendovane su u 100 µL 0,1 M rastvora natrijum fosfata. Dodato je 100 mikrograma antitela protiv arahidonske kiseline (Biomatik) i dobro promešano. Dodano je 100 mikrolitara 3 M rastvora amonijum sulfata, i smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 2 sata, a zatim dalje inkubirana na 4 stepena preko noći uz sporu rotaciju. Reakcija konjugacije je izvedena na pH=7.4. Ovi procesi indukuju formiranje kovalentne veze između epoksi (perla) i amin (antitijela) grupa, što smo prethodno potvrdili podvrgavanjem konjugata antitijelo-zrna pH izazovima [29]. U prosjeku je imobilizirano 2,4×104 antitijela po kuglici. Magnetne kuglice konjugirane s antitijelima odvojene su trajnim magnetom, isprane dvaput otopinom PBS-a i resuspendirane u 200 µL PBS-a sa 1 posto BSA. Perle su čuvane na 4 stepena do mjesec dana.

HRP konjugacija sa arahidonskom kiselinom

HRP je zatim konjugiran sa BSA putem reduktivne aminacione hemije. Konkretno, 100 µg BSA-konjugovanog AA (RPU51089, Biomatik) je otopljen u 0,5 mL 0,2 M karbonatno-biokarbonatnog pufera (pH 9,4), dodat u jedan miligram liofiliziranog EZ-linka Plus aktivirana peroksidaza (Thermo Scientific) i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodano 10 µL natrijum cijanoborhidrida (Thermo Scientific) i smjesa je inkubirana 15 minuta na sobnoj temperaturi. Na kraju je dodano 20 µL pufera za gašenje (Thermo Scientific), nakon čega je uslijedila inkubacija od 15 minuta na sobnoj temperaturi. Gel elektroforeza i analiza proteinskih traka potvrdile su konjugaciju HPR sa BSA-AA (slika S3a). HRP-konjugirani AA su sakupljeni i koncentrirani sa Amicon Ultra 100K centrifugalnim filterom (Millipore). Preostala peroksidaza i BSA-AA su isprani sa PBS četiri puta.

Elektrohemijska detekcija AA u uzorcima plazme

Za elektrohemijsku detekciju AA, krv je sakupljena od mladih (n {{0}}), lažnih (n=8) i grupa tretiranih plazmom (n=5 tokom 1 mjeseca i n=5 3 mjeseca). Uzorci mišje plazme (0.5 µL) razrijeđeni su u 50 µL 1 posto BSA u PBS-u (x100- puta razrjeđenje) i pomiješani sa rastvorom imunomagnetnih kuglica (50 µL) i HRP-konjugiranim AA otopinom (50 µL). Količina AA-HRP bila je dovoljno velika da zasiti mjesta vezivanja u magnetnim kuglicama. Koristili smo oko 8,4×107 perli po testu, što je učinilo dostupnim 2,0×1012 AA-vezujućih mjesta. Količina AA-HRP bila je ~1,7×1013; omjer između AA-HRP i mjesta vezivanja bio je ~8:1. Smjesa je inkubirana na sobnoj temperaturi 1 sat uz sporu rotaciju. Kontrolna kuglica je pripremljena miješanjem 1 posto BSA u PBS (50 µL) sa rastvorom imunomagnetnih kuglica (50 µL) i HRP-konjugovanim AA rastvorom (50 µL). Sve reagovane kuglice su odvojene trajnim magnetom i isprane dva puta sa 80 µL PBS (1 procenat BSA). Na kraju, kuglice su resuspendovane u 7 µL PBS-a. Pripremljeni rastvor kuglica i 20 µL rastvora TMB (Biomatik) stavljeni su na vrh elektrode. Nakon 6 minuta započelo je kronoamperometrijsko mjerenje. Koristili smo minijaturni elektrohemijski senzor (prototip sistema koji je razvio AcurreHealth Inc.). Trenutni nivoi u rasponu od 40-45 s su u prosjeku. Koristili smo faktor konverzije (×100) da prijavimo procijenjene originalne koncentracije AA u plazmi.

Enzimski imunosorbentni test (ELISA)

ELISA eksperimenti su izvedeni korištenjem mišje arahidonske kiseline (AA) ELISA kompleta (Biomatik) prema proizvodnim smjernicama. Serijski razblažen AA je dodat u svaku jažicu i inkubiran sa HRP-konjugovanim AA na 37 stepeni tokom 40 minuta. Nakon četiri puta ispiranja puferom za ispiranje, dodan je rastvor TMB i inkubiran 20 min. Razvoj boje je zaustavljen dodavanjem stop rastvora. Apsorbanca je očitana na 450 nm pomoću čitača mikroploča (Tecan).

Rotarod test

Modificirali smo Rotarod test Konga et al. [30] za procjenu lokomotorne koordinacije. Rotarod sa štapom prečnika 3-cm počinjao je pri 4 o/min i ubrzavao za 4 o/min u 30 sekundi u trajanju od 5 min. Miševi su stavljeni na štap i mjereno je vrijeme potrebno da miševi padnu sa štapa. Svaki miš je dobio 3 pokušaja dnevno, a vrijeme rada svakog dana izračunato je kao prosjek vremena treninga. Prvi rotarod test je obavljen 1-mjesec nakon tretmana plazmom: mlada grupa (n=29), lažna grupa (n=17), grupa tretirana plazmom (n {{ 11}}). Sesija ponovne obuke je započela 4-mjeseci nakon tretmana plazmom. Kako bi se izbjeglo pretreniranje, preobuka je provedena 2 dana. Druga procedura je bila ista kao i na prvoj sjednici.

Snimanje moždanog tkiva

1 mjesec (n=4) i 4 mjeseca (n=3) nakon injekcije plazme iz krvi pupčanika ili injekcije fiziološke otopine, životinje su eutanazirane i zatim perfuzirane sa 4 posto paraformaldehida (PFA) i PBS kroz leva komora. Mlade (n=5) i lažne grupe (n=4) su korištene kao kontrole. Njihov mozak je bio

ekstrahovan i kriozaštićen. Svaki mozak je isječen na kriotomu debljine 30 μm. To

izvršite imunohistohemiju, nespecifično vezivanje je blokirano sa 5 posto normalnog kozjeg seruma u 0.3 posto Triton X-100 tokom 40 min. Primarno antitelo protiv Doublecortina (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) je primenjeno preko noći na 4 stepena, a zatim je korišćen PBS za ispiranje [31]. Sekundarna antitijela Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) korištena su za detekciju DCX-a. Slike su snimljene pomoću fluorescentnog mikroskopa (Nikon Eclipse 80i) i analizirane pomoću Image J [32].

Statistička analiza

Statistička analiza je izvršena korištenjem R osnovnih funkcija i lme4, R paketa za bilo koji linear

Modeli mješovitih efekata ili generalizirani linearni model

(GLM) nakon čega slijedi LSD post-hoc test [33]. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna greška i ap vrijednost < 0.05="" se="" smatra="">

Dodatni materijal

Dodatne brojke.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Priznanja

Zahvaljujemo AccureHealth Inc. za pružanje minijaturnog elektrohemijskog senzora. Ova studija je dijelom podržana grantom Instituta za promociju informacijske i komunikacijske tehnologije (IITP) koji je finansirala Vlada Koreje (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Konkurentni interesi

Autori su izjavili da ne postoji konkurentski interes.