Beta Vulgaris Rubra L. (cikla) ​​Ekstrakt metanola s kore smanjuje oksidativni stres i stimuliše proliferaciju ćelija putem povećanja ekspresije VEGF-a u endotelnim ćelijama ljudske pupčane vene izazvane H2O2 izazvanim oksidativnim stresom

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comda saznam više

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 i Amna Abdullah Alotiby 2

sažetak:Antioksidativni kapacitet polifenola iflavonoidiprisutan u dijetalnim agensima pomaže u zaustavljanju razvoja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) i zaštiti ćelija glatkih mišića endotela od oksidativnog stresa/indukovane nekroze. Cvekla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) je povrće koje se obično konzumira i predstavlja bogat izvorantioksidansi. Bioaktivna jedinjenja kore cvekle i njihova uloga u endotelnim ćelijama pupčane vene (HUVEC) još uvek su nedovoljno istraženi. U ovoj studiji pripremljen je metanolni ekstrakt kore cvekle (BPME) i njegov učinak na bioefikasnost, nuklearni integritet, potencijal mitohondrijske membrane, rast vaskularnih ćelija i nivoe ekspresije gena vezanih za imunoregulaciju u HUVEC-ima sa induciranimoksidativnoanaliziran je stres. Rezultati gasne hromatografije-masene spektroskopije (GC-MS) potvrdili su da BPME sadrži 5-hidroksimetilfurfural (32,6 posto), metil piruvat (15,13 posto), furfural (9,98 posto) i 2,3-dihidro{{11} },5-dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-one (12,4 posto). Ekstrakt BPM je efikasno pojačao proliferaciju ćelija i potvrđen je MTT testom; nuklearni integritet je potvrđen testom bojenja propidijum jodidom (PI); potencijal mitohondrijalne membrane (∆ψm) je potvrđen JC-1 testom bojenja. Aneksin V test je potvrdio da HUVEC-ovi tretirani BPME pokazuju 99 posto održivih ćelija, ali samo 39,8 posto održivosti je prikazano u HUVEC-ovima tretiranim samo s H2O2. Osim toga, BPME tretman HUVEC-a u trajanju od 48 sati smanjio je ekspresiju mRNA lipid peroksida (LPO) i povećao NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotelnu sintazu dušikovog oksida (eNOS ), i nivoe ekspresije faktora rasta vaskularnih ćelija (VEGF) mRNA. Otkrili smo da je tretman BPME smanjio proinflamatorne (nuklearni faktor-κ (F-κ), faktor nekroze tkiva- (TNF-), receptor sličan toll-u-4 (TLR-4), interleukin{{37} } (IL-1 ))i vaskularniupala(intracelularni adhezioni molekul (ICAM), adhezioni molekul vaskularnih ćelija (VCAM), EDN1, IL-1) povezane ekspresije mRNA. U zaključku, tretman korom cvekle je efikasno povećao faktore rasta glatkih vaskularnih ćelija i razvoj mikrotubula, dok je smanjio vaskularne inflamatorne regulatore. BPM može biti koristan za regeneraciju glatkih vaskularnih ćelija, popravku tkiva i potencijal protiv starenja.

Ključne riječi:cvekla; oksidativni stres; mitohondrije; angiogeneza; upala

Molimo kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Angiogeneza je fiziološki proces vaskulogeneze iz postojeće krvne žile u tijelu [1]. Neophodan je ne samo za embrionalni razvoj i reprodukciju, već i za ćelijski ciklus i popravku tkiva [2,3]. Međutim, povezan je s patogenezom različitih bolesti, kao što su rast tumora, reumatoidni artritis, te razne ishemijske i upalne bolesti [3–5]. Vaskularni endotel igra važnu ulogu u održavanju vaskularne hemostaze regulacijom tonusa krvnih žila i imunoloških i upalnih reakcija [6,7]. Endotelne ćelije (EC) su tanki monocelularni slojevi koji oblažu sve unutrašnje površine krvnih sudova i proizvode različite molekule koje deluju lokalno ili na udaljenim mestima [7]. Endotel je fundamentalan za homeostazu tijela, a svaka promjena u odgovoru endotelnih stanica dovodi do primarnih događaja upalnih i vaskularnih bolesti, kao što su ateroskleroza i hipertenzija [6,8,9]. Ove bolesti uzrokuju oksidativni stres, koji mijenja EC strukturu i integritet funkcije i dovodi do endotelne disfunkcije [9]. EC-ovi pupčane vene (HUVEC) naširoko su korišteni kao model za studije u vezi sa ljudskim vaskularnim endotelom. Štaviše, oni predstavljaju koristan model za proučavanje glavnih bioloških puteva uključenih u funkciju endotela [10]. Bioaktivni spojevi i fitokemikalije se u izobilju nalaze u voću, povrću, zelenom bilju i mnogim biljkama, koje pokazuju brojne zdravstvene prednosti, kao što su protuupalna, antioksidativna, antikancerogena i angiogena svojstva [11–13]. U tom smislu, crvena cvekla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) pripada porodici Amaranthaceae i klasifikovana je kao jedan od najboljih izvora visokog nivoa antioksidansa [14,15]. Konkretno, sadrži više fitokemikalija koje su biološki aktivne, uključujućibetalains, flavonoidi,polifenoli, terapeutski enzimi, askorbinska kiselina, dehidroaskorbinska kiselina (DHAA) i neorganski nitrat (NO3) [16–18]. Osim toga, osigurava vrijedne esencijalne nutrijente, kao što su kalij, kalcij, magnezij, natrijum, gvožđe, cink, fosfor, bakar i mangan [19]. Nekoliko studija je izvijestilo da ekstrakt crvene cvekle (korijen) ima brojne korisne efekte zbog svojih hipoglikemijskih, snižavajućih lipida, protuupalnih, antihipertenzivnih i antiproliferativnih svojstava [20–22]. Sva ova korisna svojstva mogu se povezati sa sposobnošću bioaktivnih jedinjenja uklanjanja slobodnih radikala. Stoga je konzumacija crvene cvekle povezana s brojnim nutritivnim i zdravstvenim prednostima. Zbog svoje nutritivne vrijednosti, može se koristiti kao funkcionalni izvor hrane protiv oksidativnog stresa koji izaziva kronične metaboličke bolesti, poput dijabetesa tipa 2 i kardiovaskularnih bolesti [23]. Na osnovu pregleda literature, Beta vulgaris ima snažna antioksidativna, imunoregulatorna i angiogena svojstva. Apigenin je pronađen u listovima cvekle; ima antiproliferativne efekte u ćelijama jetre i creva, i može poboljšati komorbiditet gojaznosti izazvan ishranom sa visokim sadržajem masti putem AMPK aktivacije [24,25]. De Silva i saradnici, (2020) [26] su identificirali da Beta vulgaris štiti vaskularne EC od oksidativnog stresa induciranog izvana, što može biti posljedica kombiniranog djelovanja nekoliko bioaktivnih spojeva prisutnih u ovoj biljci. Do sada je mehaničko djelovanje na proliferaciju EC i efekat angiogeneze kore korijena Beta vulgaris bilo nedovoljno istraženo. Stoga smo imali za cilj da sprovedemo ovu studiju kako bismo ispitali proliferaciju vaskularnih ćelija, razvoj mikrotubula, oksidativni stres i kapacitet angiogeneze koji se odnosi na koru korena Beta vulgaris koristeći analizu stanične morfologije i ekspresije gena u HUVEC. Istražuju se angiogeni efekti metanolnog ekstrakta kore crvene cvekle koji su povezani sa integritetom jezgre, razvojem mikrotubula, efikasnošću mitohondrija i stimulacijom ćelijskog ciklusa u ljudskim vaskularnim EC.

2. Materijali i metode

2.1. Priprema cvekle(Beta vulgaris rubra L.) Ekstrakt metanola Uzorci svježe cvekle (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) prvobitno su nabavljeni iz prodavnica povrća, Rijad, Kraljevina Saudijska Arabija (KSA). Svježa cvekla je oprana destilovanom vodom kako bi se uklonile stabljike i zagađivači. Spoljna kora je oguljena da bi se uklonila i izrezala na male komadiće. Uzorci su sušeni u pećnici sa vrućim zrakom na 40 ◦, a zatim mljeveni u prah pomoću elektronskog blendera. Zatim je 5{{10}}0 g praha ekstrahirano u sterilnu bocu koja sadrži 1 L metanola (Sigma, St. Louis, MO, SAD) tokom 24 h na sobnoj temperaturi na šejkerom i ponovljen tri puta. Nakon toga, za filtriranje ekstrakta korišten je Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, SAD). Konačno, smanjenjem pritiska, rastvarač je odvojen od ekstrakta, a ekstrakt je sakupljen kao čvrsta suha supstanca nakon isparavanja metanola. Ekstrahovani uzorak čuvan je u frižideru na 4 ◦C do dalje upotrebe. 2.2. Analiza plinskom hromatografijom i masenom spektroskopijom Ekstrakt metanola od kore cvekle (BPME) je ubrizgan u kapilarnu kolonu silicijum dioksida (30 m × {{60}}.25 mm ID × 0 .25 µm debljine filma) GC-MS instrumenta (Agilent 6890N/5973I, Kalifornija, Kalifornija, SAD) sa masovno selektivnim detektorom za detekciju hemijskih sastava. Temperatura instrumenta je postavljena kao početna 7{{90}} ◦C, držanje 2 min, do 305 ◦C na 20 ◦C/min, nakon čega je uslijedilo držanje 1 min. Ukupno vreme rada GC-a je postavljeno na 45 minuta sa gasom helijumom (99,999 procenata) kao gasom nosačem (stalna brzina od 1,2 mL/min), 250 ◦C kao temperatura injektora i 230 ◦C kao izvor jona temperaturu. Na osnovu GC-MS spektra, izračunat je relativni procenat odgovarajuće komponente, a maseni spektri nepoznate komponente su identifikovani upoređivanjem sa poznatim 62,000 obrascima dostupnim u Nacionalnom institutu za standard i tehnologiju kompjuterska biblioteka (NIST08). 2.3. Materijali i hemikalije za ćelijske kulture HUVEC su kupljeni od Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD). Materijali za ćelijske kulture kao što su Dulbecco-ov modifikovani medij Eagle (DMEM), EDTA, tripsin i drugi dobijeni su od Gibco-a (Paisley, UK). Penicilin-streptomicin (PS) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Hyclone Laboratories, SAD. Hemikalije korištene u eksperimentu molekularne biologije dobijene su od Sigma-Aldrich, posebno MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijum bromid], PI i JC-1 boja. SYBR Green PCR Master Mix i komplet za sintezu cDNK dobijeni su od Qiagena (Hilden, Njemačka). 2.4. HUVEC-ovi HUVEC-ovi su uzgajani u DMEM-u i dopunjeni sa 1 posto PS i 10 posto FBS kompleksa. Ćelije su inkubirane u vlažnoj atmosferi na 37 ◦C, 5 posto CO2, i subkultivirane otprilike svaka 3 dana. 2.5. Vijabilnost ćelija i ćelijska proliferacija pomoću MTT testa HUVEC (1 × 104 ćelije/jažicu) su kultivisane sa medijumom za održavanje i ostavljene da se prianjaju preko noći u 96-pločicu za kulturu u bunariću. Zatim je podloga zamijenjena novom podlogom za kulturu koja je sadržavala rastuće koncentracije BPME (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 i 3,2 µg/mL) prema karti ploče za analizu MTT i inkubirana za 24 i 48 h; Netretirane ćelije su korištene kao kontrole. Nakon perioda inkubacije, eksperimentalne ćelije su tretirane sa 20 µL/jažici od 5 mg/mL MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5-difeniltetrazolijum bromid koji je otopljen u dimetil sulfoksidu (DMSO)) i dodatno inkubiran 4 h na 37 ◦C. Zatim je medij odbačen, a proizvedeni ljubičasti formazan je otopljen u 100 µL 100 posto DMSO. Apsorbancija rastvora je merena pomoću čitača mikroploče (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) na talasnoj dužini od 570 nm. Procenat (postotak) ćelijske proliferacije izračunat je sljedećom jednadžbom: (apsorbanca uzorka/srednja apsorpcija kontrole) × 100. 2.6. Dizajn eksperimenta Prema sadašnjem testu proliferacije ćelija, testirana niža koncentracija BPME (0,1 i 0,2 µg/mL) pokazala je proliferaciju HUVEC-a i morfologiju mikrotubula bez toksičnosti. Zapremine od 0,1 i 0,2 µg/mL doze BPME su odabrane i tretirane normalnim HUVEC-ima i 10 mM H2O2-indukovanim HUVEC-om izazvanim oksidativnim stresom tokom 48 sati kako bi se odredila ćelijska proliferacija, protuupalni, angiogeni potencijal (Slika 1). Kontrola vozila je također održavana 48 h u obje grupe. Kvercetin (10 µM) je korišten kao referentna kontrola u obje eksperimentalne grupe. Nakon inkubacije, neobrađene i eksperimentalne ćelije su analizirane na ćelijsku i nuklearnu morfologiju i potencijal mitohondrijske membrane pomoću BDTM MitoScreen (JC-1) kompleta; apoptoza je određena metodom sortiranja ćelija zasnovanom na Aneksinu V/apoptozi u drugoj citometriji. Ispitivani su nivoi oksidativnog stresa, proinflamatorne i angiogenezne ekspresije gena.

2.7. Test bojenja propidijum jodidom za nuklearna oštećenja Ćelijske morfologije za karakteristična nuklearna oštećenja, piknozu ili apoptotičke morfološke promjene nakon tretmana s 0.1 i 0.2 µg/mL BPME (sa ili bez H2O2) u HUVEC-ima određen je analizom bojenja PI pod inverznom fluorescentnom mikroskopijom, kako su opisali Leite et al. [27].

2.8. Ispitivanje potencijala mitohondrijske membrane (∆ψm) pomoću JC-1 bojenja Potencijal mitohondrijske membrane (∆ψm) određen je JC-1 testom za procjenu efikasnosti mitohondrija u kontroli vozila i {{4} }.1 i 0.2 µg/mL HUVEC-a tretiranih BPME (sa i bez H2O2). Ukratko, rastvor za bojenje JC-1 je pomešan sa sličnom zapreminom medijuma za kulturu, a zatim dodan u eksperimentalne HUVEC i inkubiran u mraku 20 minuta na 37 ◦C. Zatim je nevezana JC{14}} boja nježno isprana dva puta upotrebom 200 µL JC-1 pufera za pranje na 4 ◦C. Nakon toga, akumulacija j-agregiranog prema JC-1 bojenju je uočena pod fluorescentnom mikroskopijom korištenjem fluorescentnog mikroskopa, a slike su snimljene. Pored toga, potencijal mitohondrijalne membrane je mjeren u protočnoj citometriji korištenjem BDTM MitoScreen (JC-1) kompleta.

2.9. Aneksin V/analiza apoptoze korištenjem protočne citometrije. Metoda kompleta za detekciju Aneksina V/PI (Sigma Chemicals, SAD), zasnovana na citometriji, korištena je za kvantifikaciju održivih, proapoptotičkih, ranih apoptotičkih i nekrotičnih ćelija. HUVEC izazvani oksidativnim stresom (1 × 105/jažici) su postavljeni u 24-jažice i inkubirani sa BPME (0.1 i 0,2 µg/mL) ili kontrolom vozila za 48 č. Nakon inkubacije, ćelije su inkubirane u 400 µL 5 µL Aneksin V-fluorescein izotiocijanata (FITC) i 5 µL PI koji sadrži vezivni pufer; nakon toga, ćelije su držane 15 minuta na sobnoj temperaturi (RT) u mraku. Ćelije su analizirane citometrijom (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD) kako bi se identificirale apoptotičke (PI negativne i Aneksin V pozitivne) i kasne apoptotičke (PI-pozitivne i Aneksin V pozitivne) ćelije [28].

2.10. Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu Fastlane® Cell to cDNA komplet (Qiagen, Hilden, Njemačka) korišten je za ekstrakciju ukupne RNK i sintezu cDNK iz kontrole nosača, HUVEC-a tretiranih BPME (sa i bez H2O2) korištenjem kvantitativne PCR (qPCR) poluautomatizirane instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ekspresijski nivoi oksidativnog stresa uključujući (lipidni peroksid, NOS-3), antioksidans (Nrf-2, GSK-3 i GPx), proinflamatorni (nuklearni faktor-κ (NF-κ), faktor tumorske nekroze- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), faktor rasta vaskularnih ćelija (VEGF), receptor sličan toll-u-4 (TLR-4)) , a vaskularna upala (intracelularna adheziona molekula (ICAM), molekula adhezije vaskularnih stanica (VCAM), EDN1 i endotelna sintaza dušikovog oksida (eNOS)) povezani geni i referentni gen, -aktin, analizirani su u HUVEC-ima i kvantificirani metodom od Yuan et al. [29]. Vrijednosti amplifikacije (∆Ct) su izračunate na osnovu razlike između Ct (tretiranog) i Ct (kontrolnog). Ekspresija gena je ucrtana korišćenjem ekspresije 2−∆∆Ct vrednosti.

2.11. Statistička analiza Svi eksperimenti su triplicirani, a rezultirajući podaci izraženi su kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (SD). Statistička analiza razlika među grupama izvršena je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) korištenjem SPSS softvera (Verzija 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Zatim je proveden Tukeyjev test višestrukog poređenja ako su pronađene značajne razlike. Svi rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD za šest ponavljanja u svakoj grupi. P-vrijednost < 0.05="" se="" smatrala="" značajnom="">

Cistanche za poboljšanje imuniteta

3. Rezultati

3.1. Bioaktivni molekuli u BPME Hemijski sastojci BPME su potvrđeni pomoću GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Hemijski sastav ekstrakta kore cvekle određen je poređenjem masenih spektra dostupnih sa spektralnom bazom podataka Nacionalnog instituta za standard i tehnologiju (NIST). Rezultati GC-MS potvrdili su da BPME sadrži hidroksiaceton (8,18 posto), 5-hidroksimetilfurfural (32,6 posto), metil piruvat (15,13 posto), beta-d-alopiranozu (1,48 posto), furfural (9,98 posto), 2-hidroksi-gama-butirolakton (1,32 posto), i 2,3-dihidro-3,5-dihidroksi- 6-metil-4H-piran -4-jedan (12,4 posto; slika 2a, tabela 1). 3.2. Proliferacija ćelija Potencijal proliferacije ćelija in vitro BPME protiv HUVEC-a prikazan je na slici 2b. Nije uočena značajna inhibicija rasta ćelija u eksperimentalnim grupama u poređenju sa kontrolom nosača. Ovom studijom je potvrđeno da je povećanje koncentracije BPME tretiranog HUVEC-ima rezultiralo povećanom proliferacijom i održivošću ćelija nakon 48 h (112 posto) u poređenju sa 24 h (103 posto) tretmana. Osim toga, svjetlosne mikroskopske slike HUVEC-a tretiranih BPME nakon 48 h potvrdile su normalne ćelije sa ujednačenim oblikom morfologije adherentnih ćelija, povećan je broj proliferirajućih (replikacijskih) ćelija bez ikakvih oštećenja (Slika 2c). 3.3. Analiza ćelijske i nuklearne morfologije, formiranja mikrotubula i JC-1 bojenja u HUVEC Slika 3 prikazuje morfologiju razvoja mikrotubula na FL fluorescentnim mikroskopskim slikama. H2O2-indukovane oksidativnim stresom HUVECs su pokazale slabu proliferaciju i nepravilnu morfologiju adherentnih ćelija u poređenju sa kontrolnim HUVECs. Normalni HUVEC tretirani sa 0.2 µg/mL BPME pokazali su proliferaciju ćelija putem replikacije ili neogeneze sa morfologijom mikrotubula. U međuvremenu, 0.1 µg/mL doza ćelija tretiranih BPME pokazala je 100 posto adherentnih ćelija sa ranim stadijumima mikrotubula. HUVEC-i pod oksidativnim stresom tretirani sa 0,2 µg/mL BPME identificirali su proliferirajuće nove stanice s morfologijom mikrotubula i smanjenim oksidativnim oštećenjem ćelija. Osim toga, 0,1 µg/mL BPME je također povećalo normalnu morfologiju vaskularnih stanica s proliferirajućim stanicama.

Slika 4a prikazuje normalnu morfologiju nuklearne strukture, sfernog oblika, u kontrolnim i BPME (0.1 ili 0.2 µg/mL) tretiranim HUVEC. Slika 4b prikazuje slike za PI bojenje normalnih i HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim H2O2. HUVEC-i tretirani H2O{{10}} pokazuju jezgra nepravilnih oblika, pokazujući kondenzaciju i piknozu nakon 30 min. Međutim, 0.2 µg/mL BPME tretmana za HUVEC pod oksidativnim stresom pokazao je kružna jezgra sa normalnom morfologijom. U poređenju sa 0,2 µg/mL ekstrakta BPME, 0,1 µg/mL BPME imalo je manji zaštitni efekat protiv oksidativnog stresa izazvanog H2O2- u HUVEC-ima.

Slika 2. Rezultati GC-MS hromatograma metanolnog ekstrakta kore cikle (a), in vitro proliferacije ćelija (b) i slike svjetlosne mikroskopije za morfologiju stanica (c) u HUVEC-ima, tretiranim povećanjem koncentracije metanolnog ekstrakta kore cikle (BPME) ) (ujednačeni oblik priraslih i proliferirajućih ćelija pominje crvenim vrhom strelice). Sve vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD (n=6). * p Manje ili jednako 0.05 u poređenju sa kontrolom vozila.

Slika 3. Analiza formiranja mikroepruveta na osnovu mikroskopske fluorescencije u kontroli vozila, 0.1 i 0.2 µg/mL doze metanolnog ekstrakta kore cvekle (BPME) tretiranog normalno i H2O{{6} }inducirani HUVEC-i pod oksidativnim stresom nakon 48 h. Nakon 48 h, H2O2-inducirani HUVEC-i pod oksidativnim stresom pokazali su izmijenjenu morfologiju u poređenju sa kontrolom nosača. Zapremine od 0.1 i 0.2 µg/mL HUVEC-a tretiranih ekstraktom kore cvekle metanolom (BPME) su pokazale normalnu morfologiju sa vaskularnim mikrotubulama sa ćelijama koje se razmnožavaju koje liče na uobičajenu morfologiju ponašanja ćelija glatkih mišića.

Slika 4. Analiza bojenja propidijum jodidom (PI) za nuklearnu morfologiju u kontroli vozila, 0.1 i 0.2 µg/mL metanolnog ekstrakta kore cvekle (BPME) tretiranog normalno (3a) i H2O2-indukovane oksidativnim stresom (3b) HUVEC nakon 48 h. Kod PI bojenja, kontrola nosača je pokazala da je jezgro normalno bez znakova skupljenog, piknoze ili apoptotičnog jezgra. Samo u H2O2, tretirane ćelije pokazale su polariziranu nuklearnu membranu nakon 48 h. Tretman sa 0.2 µg/mL BPME normalizirao je H2O2-indukovanu polarizaciju nuklearne membrane u poređenju sa 0.1 µg/mL BPME ili kvercetinom 10 µM.

Slika 5a prikazuje rezultate bojenja JC-1 za HUVEC, uključujući kontrolne ćelije i ćelije tretirane BPME; slika ilustruje zdrave ćelije sa aktivnim mitohondrijama, što je potvrđeno negativno nabijenim mitohondrijskim unosom ekstramitohondrijalnog lipofilnog kationskog JC-1 (zelena boja) i J-agregata pretvorenih u crvenu boju intramitohondrijski. Slika 5b prikazuje rezultate bojenja JC-1 za 0.2 µg/mL BPME primijenjenog na HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim H2O2; rezultati su potvrdili da je skoro 94 posto negativno nabijenih mitohondrija pretvorilo lipofilni kationski JC-1 (zelena boja) u J-agregate crvene boje u poređenju sa tretmanom 0.1 µg/mL BPME (61,4 posto) ili H2O{{20}}indukovani oksidativni stres kod HUVEC (2 procenta). Uočeno je da je potencijal mitohondrijske membrane (MMP) veći u ćelijama tretiranim BPME u poređenju sa referentnim lijekom kvercetinom. 3.4. Potencijal mitohondrijske membrane potpomognut FACS (∆ψm; BD MitoScan) i analiza aneksina V/apoptoze u HUVEC Slika 6 prikazuje potencijal mitohondrijske membrane u BD MitoScan analizi nakon 0.2 µg/mL tretmana normalnog BHUVEC-a i HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim H2O2. Otkrili smo da 0,2 µg/mL tretmana BPME povećava MMP (∆ψm) na 92,7 posto ± 3,7 posto u poređenju sa HUVEC tretiranim samo s H2O2 (27,9 posto ± 7,2 posto). Nasuprot tome, ćelije tretirane kvercetinom pokazale su 41,4 posto ± 1,6 posto povećane MMP (∆ψm) u poređenju sa HUVEC tretiranim samo s BPME i H2O2 ili H2O2.

Slika 5. Analiza potencijala mitohondrijske membrane korištenjem JC-1 bojenja za kontrolu vozila, 0.1 i 0.2 µg/mL metanolnog ekstrakta kore cvekle (BPME) tretiranog normalno (a ) i H2O2-indukovane oksidativnim stresom (b) HUVEC nakon 48 h. JC{{10}}fluorescentne slike koje prikazuju spojene slike crvenog i zelenog signala boje, što odgovara JC-1 u J-agregatima naspram monomernog oblika. Pronašli smo manje J-agregata HUVEC tretiranih samo H2O2. U 0.2 µg/mL HUVEC tretiranim BPME-om koji pokazuju visoke j-agregate koji direktno predstavljaju (visoki MMP, ∆ψm) visok potencijal mitohondrijalne membrane u poređenju sa 0,1 µg/mL BPME ili 10 µM kvercetina.

4. Diskusija

Nakon ekstracelularnog ili intracelularnog stresa, bioraspoloživost reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) nadmašuje antioksidativnu odbranu, a oksidativni stres remeti redoks signalizaciju i kontrolu [31]. Razvoj oksidativnog stresa povezan je s patogenezom kroničnih poremećaja, kao što su neurodegenerativne bolesti, dijabetes i ateroskleroza. Kao što je oksidativni stres inicira endotelnu disfunkciju i potiče sistemsku upalu i regrutaciju makrofaga [32]. Aktivirane imunološke stanice migriraju u vaskulaturu i oslobađaju citokine i hemokine povezane s vazokonstrikcijom i remodeliranjem krvnih sudova stanica glatkih mišića i upalom koja zahvaća vaskularne glatke mišićne stanice i vaskularni zid [33]. Povećani vaskularni oksidativni stres završava vaskularnim oštećenjem, ukočenošću ćelija glatkih mišića i abnormalnostima strukturnog elastina. Osim toga, vaskularni oksidativni stres je stimuliran u drugim patološkim stanjima, kao što su visceralna gojaznost ili ateroskleroza, zbog povećane aktivnosti NADPH oksidaze (NOX-2) u perivaskularnom masnom tkivu [34]. Vaskularni oksidativni stres uzrokuje glavne epigenetske promjene koje se javljaju tijekom starenja, a završava se ranim procesom starenja [35]. Razvoj proizvodnje ROS i oksidativnog stresa u biološkom sistemu u velikoj mjeri zavisi od mitohondrijalne disfunkcije, pored NOX-2, endotelne ksantin oksidaze, nepovezanog eNOS-a i lipoksigenaze [36]. Antioksidativna svojstva dijetetskih agenasa mogu neutralizirati stvaranje ROS preko povećanog antioksidativnog kapaciteta [26]. Ekstrakt Ginkgo Bilobe štiti od razvoja ateroskleroze smanjujući stvaranje ROS i aktivnost lipoksigenaze u endotelnoj disfunkciji izazvanoj OxiLDL [37]. Osim toga, različita fenolna jedinjenja iflavonoidi izjestive biljke i žitarice imaju svojstvo da hvataju ROS i peroksidaciju lipida [38]. Metanolni ekstrakt kore cvekle (Beta vulgaris) ima antioksidativni potencijal zbog dostupnosti visoke količine vlakana, antocijana i flavonoida kao što su viteksin i betanin [39]. U ovoj studiji, BPME je odabran da identifikuje mitohondrijski ovisan mehanistički pristup kako bi se otkrio njegov učinak na potencijal mitohondrijalne membrane, gašenje LPO i inhibiciju nivoa ekspresije mRNA povezane s vaskularnom upalom. MTT test je potvrdio da je BPME značajno povećao proliferaciju ćelija, što je potvrđeno povećanim nuklearnim integritetom u PI bojenju sa efektivnom dozom od 0.2 µg/mL BPME u odnosu na testirani 0.1 µg/mL od BPME. Identifikacija efektivne doze sa niskom koncentracijom i najvećom aktivnošću može se smatrati fiziološki bezbednom. Pronašli smo FL fluorescentno mikroskopsko bojenje JC-1, a potencijal mitohondrijske membrane je obnovljen kako u normalnim tako iu H2O{{1{12}}}} induciranim eksterno stimuliranim HUVEC-ima nakon 0,2 µg/mL BPME tretman. Mitohondrijska disfunkcija mijenja oksidativnu fosforilaciju, koja ne uspijeva transformirati kisik (O2·−) radikale u H2O2 i H2O pomoću glutation peroksidaze. Zbog nedovoljne detoksikacije ROS-a ili nekontrolirane proizvodnje ROS-a, povećani mitohondrijski oksidativni stres je povezan s aterosklerozom [40]. Ekstrakti kore cvekle su efikasno obnovili potencijal mitohondrijalne membrane, što je uspešno povećalo detoksikaciju ROS-a i stvaranje H2O2. Analiza bojenja Aneksinom V/PI potvrdila je da tretman BPME održava postotak živih ćelija i poboljšava stadij proliferacije i kod normalnih HUVEC i HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim H2O2. U tom kontekstu, Choo et al. [41] potvrdili su da nakon stvaranja prekomjernog ROS-a ili egzogenog H2O2 na mjestu ishemije, transplantirane mezenhimalne matične ćelije (MSC) mogu narušiti samoproliferaciju i kapacitet više linija. U regenerativnoj medicini, vaskularne glatke mišićne ćelije su glavni regulatori kontraktilnog tonusa arterija putem održavanja arterijskog perifernog otpora, regulatora krvnog tlaka, krvnog srodstva i popravke arterija [42]. Osim toga, modulacija fenotipa izazvana starenjem povezana je sa smanjenom staničnom kontraktilnošću i povećanim starenjem stanica. Nakon kontinuiranog stresa ili zbog smanjene mehanoosjetljivosti, smanjena adaptacija signala mikrookruženja je identificirana u ostarjelim ćelijama glatkih mišića [43]. Sadašnji rezultati su potvrdili da je tretman BPME održavao održivu ćelijsku populaciju, što je dokazano kapacitetom angiogeneze. Identifikovani kapacitet proliferacije BPME na HUVECs je podržan smanjenjem ekspresije LPO i povećanom ekspresijom antioksidativnih gena. ROS i LPO se inicijalno stvaraju iz mitohondrijalnog kompleksa (I i III) i NOX-4 tokom ćelijske proliferacije ili diferencijacije [44]. Prekomjerni ROS reagiraju i oštećuju biomolekule, posebno mijenjajući integritet genomske DNK, što je kritično za ćelijsku proliferaciju i funkcije [45]. Međutim, potvrđeno je da dijetetski unos antioksidativnih polifenola, kao što su epigalokatehin i tokoferol, štiti stanice od oksidativnog stresa i povećava sposobnost proliferacije [46]. U našoj studiji, nivoi ekspresije mRNA LPO su smanjeni, a otkriveno je da su NOS-3, Nrf-2 i eNOS dvostruko povećani u HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim H2O2. eNOS je dominantna izoforma NOS, odgovorna za većinu NO·proizvoda u glatkim mišićnim ćelijama i vaskularnim tkivima. NO· širi sve vrste vaskularnih sudova i štiti agregaciju trombocita i adheziju leukocita u EC [47]. Do sada je bilo mnogo suprotstavljenih izvještaja o kardiovaskularnim faktorima rizika, a endotelna disfunkcija je bila povezana sa smanjenom ili povećanom ekspresijom eNOS-a [48]. Povišena ekspresija eNOS-a uočena kod vaskularne bolesti, što je vjerovatno posljedica prekomjerne proizvodnje H2O2. O2·−, produkt dismutacije, može povećati ekspresiju eNOS putem transkripcionih i post-transkripcionih mehanizama [49]. Patogeneza vaskularne bolesti je praćena ubrzanom degradacijom NO· nakon reakcije sa O2·− i konačno, ONOO- oblikom, što dovodi do odvajanja eNOS-a i disfunkcije NOX enzima [50]. Oksidativni stres je potisnut antioksidativnim enzimima, a nivoi mRNA GSK-3 i GPX su povećani nakon tretmana BPME. BPME sadrži više fitohemikalija koje su biološki aktivne, uključujući betalaine, flavonoide, polifenole, terapeutske enzime, askorbinsku kiselinu, dehidroaskorbinsku kiselinu (DHAA) i neorganski nitrat (NO3), a oni mogu biti uključeni u povećanje antioksidativnog kapaciteta u HUVEC-ima. U tom kontekstu, Cha et al. (2014) [51] objavili su da hlorogenska kiselina efikasno štiti od oštećenja DNK izazvanog oksidativnim stresom u ljudskim keratinocitima. Endotelin-1 (Edn-1), vazokonstriktor izveden iz endotela, vrši migraciju ćelija glatkih mišića i djeluje kao antiapoptotički faktor u ćelijama sa stresom izazvanim dušičnim oksidom [52,53]. Procesi vaskularnog remodeliranja, migracije, proliferacije i akumulacije ekstracelularnog matriksa stimulirani su i Edn-1 i NO [54,55]. Uočili smo povećanu ekspresiju Edn-1 nakon tretmana BPME u HUVEC-ima sa oksidativnim stresom. Nakon oksidativnog stresa ili akumulacije LPO, rana faza vaskularne upale je adhezija leukocita na endotelne glatke mišićne ćelije, što je istaknuto za kritične događaje ishemije i ateroskleroze [56]. Posreduju ga VCAM i ICAM izrazi; stimulisana je od strane mnogih hemokina i agenasa hemotakse, kao što su ekspresije NF-κB, IL-1 i TNF-a [57]. Inhibicija aktivacije IL-1 praćena ekspresijom adhezionih molekula postignuta je dijetalnim fenolnim jedinjenjem elaginske kiseline [58]. Tretman BPME na eksterno stimulisane HUVEC sa oksidativnim stresom značajno je smanjio proinflamatorne faktore specifične za vaskularne ćelije, kao što su VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 i nivoi ekspresije TNF-a. U tom kontekstu, Crespo et al. [59] su objavili da kempferol i kvercetin inhibiraju proinflamatorne gene, kao što su VCAM, ICAM, NF-κB i IL-1 ekspresije, respektivno. Sve u svemu, inhibicija oksidativnog stresa i potencijal ekspresije gena BPME povezan sa vaskularnom inflamacijom favorizuje ekspresiju faktora rasta vaskularnih ćelija i potencijalno potpomaže proliferaciju i rast vaskularnih ćelija.

5. Zaključci

Sadašnji nalazi potvrđuju da je povećana ekspresija antioksidativnih gena bila povezana sa gašenjem oksidativnog stresa, pomažući da se prevlada oštećenje HUVEC proliferacije i angiogeneze. Crni beli luk koji sadrži hidroksimetilfurfural suzbija upalni efekat TNF-indukovane adhezije ćelija monocita na HUVEC i dalje suzbija generisanje ROS-a, ekspresiju VCAM-1 i aktivaciju NF-κB [60]. Osim toga, He et al. [61] je potvrdio da hidroksimetilfurfural ima potencijal da zaštiti EC od hipoksije. Utvrđeno je da kora cvekle sadrži flavonoide, furan i antioksidativne komponente, kao što su 5-hidroksimetilfurfural, metil piruvat, furfural i 2,3-dihidro-3,5- dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-on; ove komponente su odgovorne za povećani antioksidativni kapacitet i supresiju adhezionih molekula proinflamatornih vaskularnih glatkih mišićnih ćelija. Kora cvekle se koristila kao stimulans za antioksidativne bazene za gašenje spoljašnjeg ili unutrašnjeg patološkog stimulusa peroksidativnog ćelijskog stresa. Naši nalazi su pokazali da komponente cikle pomažu u smanjenju metaboličkog stresa i upale u HUVEC-ima, što može biti korisno za proliferaciju vaskularnih stanica i angiogenezu.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, LNA-H. i S.-BP; metodologija, LNA-H. i S.-BP; softver, GS; validacija, LNA-H. i S.-BP; formalna analiza, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) i GS; istraga, LNA-H., S.-BP i AMA-D.; resursi, LNA-H.; kuriranje podataka,S.-BP i LNA-H.; pisanje—priprema originalnog nacrta, LNA-H. i S.-BP; pisanje—pregled i uređivanje, LNA-H., AMS, GS i AAA (Amna Abdullah Alotiby); vizualizacija, S.-BP i AAA (Ali A Alshatwi); nadzor, LNA-H. i S.-BP; administracija projekta, LNA-H.; nabavka sredstava, LNA-H. Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa. Finansiranje: Autori zahvaljuju Dekanu za naučna istraživanja Univerziteta King Saud za finansiranje ovog rada kroz istraživačku grupu br. RG-1442-432. Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Nije primjenjivo. Izjava o informiranom pristanku: Nije primjenjivo. Izjava o dostupnosti podataka : Podaci predstavljeni u ovoj studiji dostupni su na zahtjev odgovarajućeg autora. Sukob interesa: Ne postoji sukob interesa za ovu studiju.

Reference

1. Abdolmaleki, Z.; Arab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Anti-angiogenski efekti etanolnog ekstrakta Artemisia sieberi u poređenju sa njegovom aktivnom supstancom, artemisininom. Rev. Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angiogeneza i njene terapeutske mogućnosti. Mediat. Inflflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogeneza kod raka, vaskularnih, reumatoidnih i drugih bolesti. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [CrossRef]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Vaskularni endotelni faktor rasta i angiogeneza. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [CrossRef]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Kliničke primjene angiogenih faktora rasta i njihovih inhibitora. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [CrossRef]
6. Kuhinja, HF; Webster, NR Fiziologija endotela. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [CrossRef]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Colombo, PC; Schmidt, AM Ljudske vaskularne endotelne ćelije: model sistema za proučavanje vaskularne inflamacije kod dijabetesa i ateroskleroze. Curr. Diabetes Rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Inflamacija kod ateroskleroze: od vaskularne biologije do otkrivanja biomarkera i predviđanja rizika. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [CrossRef]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Endotelna disfunkcija: sveobuhvatna procjena. Cardiovasc. Diabetol. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudin, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. Protokol za izolaciju i kulturu endotelnih ćelija ljudske umbilikalne vene. Nat. Protoc. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angiogeneza inhibirana pijenjem čaja. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Antioksidativna i prooksidativna svojstva askorbinske i galne kiseline. Food Chem. 2002, 79, 307–313. [CrossRef]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumar, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Bioaktivna jedinjenja jestivog voća sa svojstvima protiv starenja: sveobuhvatan pregled za produženje ljudskog života. Antioksidansi 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Nutritivne, bioaktivne i fizičko-hemijske karakteristike različitih formulacija cvekle. Food Addict. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. O evoluciji ponašanja parenja kod drveća: grabežljivac ili vrijeme? Am. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanin kao modulator višestrukog oksidativnog stresa i upale: Pigment cvekle sa zaštitnim djelovanjem na patogenezu kardiovaskularnih bolesti. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1–16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Izvanredno povrće: Njegov sadržaj nitrata i fitokemijskih tvari može se prilagoditi u novim formulacijama kako bi bio koristan za zdravlje i podržao terapije kardiovaskularnih bolesti. Antioxidants 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yasir, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI-MS/MS analiza listova repe (Beta vulgaris) i njenih korisnih svojstava kod pacova sa dijabetesom tipa 1. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS Hemijski sastav, funkcionalna svojstva i prerada cvekle - pregled. Int. J. Sci. inž. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Nutritivni i funkcionalni potencijal Beta vulgaris cicla i rubra. Fitoterapia 2013, 89, 188–199. [CrossRef]