Benzilovani dihidroflavoni i alkaloidi izvedeni iz izokinolina iz kore Diclinanona Calycina (Annonaceae) i njihova citotoksičnost
Mar 13, 2022
Za više informacija kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com
Abstract: Diclinanona calycina RE Pomfrit popularno poznat kao "enviro", je vrsta porodice Annonaceae endemična za Brazil. U našoj stalnoj potrazi za bioaktivnim spojevima iz biljaka Annonaceae Amazona, kora D.calycina je istraživana klasičnim tehnikama hromatografije koje su dale trinaest spojeva (alkaloida i flavonoida) prvi put opisanih u D. calycina, kao iu rodu Diclinanona. Struktura ovih izolovanih jedinjenja utvrđena je opsežnom analizom korišćenjem 1D/2D-NMR spektroskopije u kombinaciji sa MS. Izolovani alkaloidi su identifikovani kao pripadajući podklasama: jednostavni izohinolin, tali online (1); aporfin, anonain (2); oksoaporfin, liriodenin (3); benziltetrahidroizohinolini, (S)-( plus )-retikulin(4); dehidro-oksonorretikulin (3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izohinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon)(5 );( plus )-1S,2R-retikulinski Ng-oksid (6); i ( plus )-1S,2S-retikulin N-oksid (7); tetrahidro protoberberin, koreksimin(8); i pavine, bisnorargemonine (9). Dok jeflavonoidispadaju u benziliranedihidroflavoni, izorhamnetin (10), dichamanetin (11) i mješavina uvarinola (12) i izouvarinola (13). Spoj 5 je prvi put u literaturi opisan kao prirodni proizvod. Citotoksična aktivnost glavnih izolovanih spojeva je procijenjena protiv raka i nekanceroznih ćelijskih linija. Među ispitivanim jedinjenjima, najperspektivniji rezultati su pronađeni za benzilirane dihidroflavone dichamanetin (10), te mješavinu uvarinola (12) i izouvarinola (13), koji su pokazali umjerenu citotoksičnu aktivnost prema ispitivanimćelija rakalinije (<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). Dichamanetin (11) je pokazao citotoksičnu aktivnost prema HL-60 i HCT116 sa IC50 vrijednostima od 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) i 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, dok je mješavina uvarinola (12) i izouvarinola (13) pokazala citotoksičnu aktivnost protiv HL-60, sa IC5 vrijednošću od 9,74 ugs.mL-1, i HCT116, sa IC50 vrijednost 17,31 ug. mL-I. Ove citotoksične aktivnosti mogu se pripisati prisutnosti jedne ili više hidroksi benzil grupa prisutnih u ovim molekulima, kao i položaju na kojem su te grupe povezane. Citotoksične aktivnosti retikulina, anonaina i liriodenina su prethodno utvrđene, pri čemu je liriodenin najmoćniji spoj.
Ključne riječi: Diclinanona calycina; alkaloidi i benzilirani dihidroflavoni; citotoksična aktivnost
Kliknite da saznate više o proizvodima
1. Uvod
Annonaceae je velika porodica tropskog i suptropskog drveća i grmlja, koja obuhvata oko 112 rodova i 2440 vrsta [1]. Nekoliko vrsta je poznato po jestivim plodovima i ljekovitim svojstvima ]2]. Prethodna fitokemijska istraživanja s nekim vrstama Annonaceae dovela su do izolacije i karakterizacije različitih klasa sekundarnih metabolita, kao što su monoterpeni, diterpeni, triterpeni, lignani,flavonoidi, fenilpropanoidi izvedeni iz asarona, acetogenini i uglavnom tipični alkaloidi izvedeni iz izohinolina [3-7]. Neki od ovih sekundarnih metabolita izolovanih iz vrsta Annonaceae pokazali su važne biološke aktivnosti, kao što su protuupalna svojstva i svojstva inhibicije ureaze [8,9], tripanocidna [10,11], lešmanicidna [11,12], antimalarijska [4,13] , antimikrobno [4,14,15], antioksidativno i antireumatsko djelovanje [9,15] i posebno citotoksično djelovanje protiv različitih humanih tumorskih ćelijskih linija [4,6,11,16-21].
Iako se porodica Annonaceae smatra primitivnom i dobro proučenom porodicom, provedeno je nekoliko fitokemijskih i/ili farmakoloških studija s njenim vrstama[3]. Fitokemijske i/ili farmakološke studije su se uglavnom fokusirale na vrste rodova Annona, Asimina i Cananga, zbog njihovog velikog ekonomskog značaja, te na neke vrste iz rodova Duguetia, Guatteria i Xylopia[5]. Unatoč velikom porastu u posljednjih 20 godina u odnosu na fitokemijske i farmakološke studije, broj istraživanih vrsta je još uvijek vrlo mali u odnosu na veliki broj priznatih vrsta. Trenutno, prema naučnim bazama podataka Web of Science, Scopus i SciFinder, samo oko 15 posto opisanih vrsta Annonaceae ima bilo kakvu odgovarajuću fitokemijsku i/ili farmakološku studiju.
Među malo proučenim vrstama su one koje pripadaju rodu Diclinanona Diels. Ovaj rod pripada plemenu Annoneae, iz potfamilije Annonoideae, i javlja se samo u tropskoj Južnoj Americi (uglavnom u regiji Amazone). To je rod koji se sastoji od samo tri vrste, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas i Diclinanona tessmannii Diels, koji se javljaju kao drveće [22-24].D.calycina (sinonim Xulopia calycina Diels) je 8. 30 m visoko drvo, popularno poznato kao "envireira" i "enviro", rasprostranjeno po amazonskom basenu u Brazilu, Peruu i Venecueli [23]. D.calycina je površno slična Xylopia po svojim cvjetovima sa izduženim i uskim laticama, ali je drugačija po svojim drvenastim, nerazvijenim, loptastim i debelim monokarpsima [23,24].
Prethodne studije sa D. calycina prijavljuju samo farmakološke studije. Prva studija opisuje ispitivanje antimikrobne aktivnosti metanolnih, hloroformskih i vodenih ekstrakata protiv mikroorganizama Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus i Candidagel albicans25 metodom [metodom Candidagel albicans25]. U drugom se izvještava o ispitivanju antimikrobne aktivnosti organskih (dihlorometan: metanol 1:1) i vodenih ekstrakata protiv mikroorganizma Enterococcus faecalis korištenjem mikrodilucionog testa bujona (MDBA) i testa difuzije na disku (DDA)[26]. Stoga, u našoj kontinuiranoj potrazi za novim bioaktivnim prirodnim proizvodima iz Annonaceae iz amazonske prašume, ova studija je imala za cilj istražiti fitokemijska i farmakološka svojstva kore D.calycina. U ovom izvještaju, trinaest jedinjenja (devet alkaloida i četiri benziliranadihidroflavoni) su izolovani i prvi put identifikovani u D.calycina, kao iu rodu Diclinanona. Osim toga, citotoksičnost glavnih jedinjenja je ispitana protiv B16-F10, HepG2, K562 i HL{{ 4}} ćelijske linije tumora koristeći Alamar blue test.
2. Rezultati i diskusija
2.1. Strukturno razjašnjavanje jedinjenja
Nakon što je otkriveno prisustvo spojeva koji sadrže dušik u metanolnom ekstraktu pomoću Dragendorffovog reagensa, podvrgnut je kiselo-baznom tretmanu prema metodologiji Costa et al. [12] što rezultira alkaloidnim i neutralnim frakcijama. U alkaloidnoj frakciji koja je podvrgnuta hromatografskoj analizi uočena je visoka koncentracija spojeva koji sadrže dušik. Sukcesivno hromatografsko razdvajanje, kako je opisano u odjeljku Ekstrakcija i izolacija, dovelo je do izolacije i identifikacije trinaest hemijskih sastojaka (1-13, slika 1), devet alkaloida izvedenih izohinolina 1-9 i četiri benzilirana dihidroflavona 10-13. Strukture ovih izolovanih jedinjenja (Slika 1) utvrđene su opsežnom analizom korišćenjem 1D i 2D NMR spektroskopije u kombinaciji sa MS (dodatni podaci), kao i poređenjem sa podacima iz literature.
Jedinjenje 5 je dobijeno kao smeđi amorfni prah i pozitivno na Dragendorffov reagens. Pokazao je protonirani molekul na m/z328 [M plus H]' u LR-ESI( plus )MS-kompatibilan sa molekulskom formulom C18H1NO5. 'H i 13C-NMR spektri 5 (tabela 1) bili su konzistentni sa onima retikulina (4)[27, osim odsustva metilne grupe vezane za azot (CH3-N) i signala metinsku grupu na poziciji 1, koja je zamijenjena signalom na δc 165.1 u tipičnom 13C-NMR spektru imin grupe konjugirane na karbonilnu grupu na bc 192.8. U 'H-NMR spektru, tri vodonika u donjem polju na δH 6.88 (1H,d, J=8.4 Hz, H-5'), 5H7.57 (1H,d, J{{33} }.0Hz, H-2'）i δH 7.60(1H, dd, J=8.4 i 2.0 Hz, H-6') , otkrio je prisustvo ABX sistema spojnice. Dva singletna signala na 6H 6,90(1H,s, H-8) i 6,71(1H, s, H-5) ukazuju na prisustvo 1,2,4,5-tetrasupstituiranog fenilnog prstena. Osim toga, H-NMR spektar 5 je također pokazao signale za dvije metoksi grupe koje rezonuju na bH 3,93 (3H, s) i 6H 3,95 (3H,s) i signale za dvije metilenske grupe koje rezonuju na δμ 2,79 (2H,t, J=7.8 Hz） i 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), pripisano H-4 i H-3, respektivno (Tabela 1) . Ovi podaci ukazuju da alkaloid 5 ima benziltetrahidroizohinolinski skelet [28-30].
Ove grupe su uspostavljene na osnovu dvo- i trovezne 'H-13 korelacijske karte iz HMBC-NMR eksperimenta (slika 2 i tabela 1). Ova analiza je otkrila da je vodonik na δH 3,89 (H-3) pokazao tropojasnu 'H-13C korelaciju sa ugljikom na 6c130.1(4a) i δc165.{101} {42}}(C-1) i dvovezna lH-13C korelacija sa ugljenikom na δc 25,4(C-4), što potvrđuje prisustvo imin grupe u molekulu. S druge strane, signali na δH 7,57 （H-2'） i δH 7,60（H-6') su pokazali troveznu lH-13C korelaciju sa ugljicima na δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）i δc192.8(C-7), i 5c116.0(C-2'),6c 151.4 (C-4') i c 192.8(C-7'), respektivno, uspostavljajući karbonilnu grupu u molekulu (Slika 2 i Tabela 1). Stoga, na osnovu ovih NMR podataka, spoj 5
ustanovljen je kao benziltetrahidroizohinolin alkaloid 34-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izohinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon, koji je nazvan kao dehidro-oksonorretikulin. Ovaj alkaloid je prvi put u literaturi opisan kao prirodni proizvod. Njegov prvi i jedini zapis opisali su Dörnyei et al. 1982. 【31】kao proizvod sintetičkog porijekla. Samo su 'H-NMR podaci opisani sa nekim neodređenim multiplikitetima. Dakle, kompletni zadaci za sve 1H- i 13C-NMR hemijske pomake su uspostavljeni eksperimentima korelacije s jednom vezom (HSOC) i dvije i tri veze (HMBC)' H-13C-NMR, a opisani su u Tabela 1.
Jedinjenja 6 i 7 su identificirani kao benziltetrahidroizohinolinski alkaloidi ( plus )-1S,2R-retikulin-N-oksid, odnosno ( plus )-1S,2S-retikulin-N-oksid. H-NMR podaci ovih alkaloida su upoređeni sa podacima koje su opisali Lee et al. [28]koristeći isti deuterirani rastvarač (CD3OD) i uočene su neke nedosljednosti (Tabela 1), uglavnom u odnosu na H-1, H-8 i H, C-NO. Nema 13C-NMR podataka opisanih za ove alkaloide u literaturi. Na osnovu ograničenih 1H- i 13C-NMR podataka, kao i nejasnoća uočenih za ove molekule, 'H i 13C 1D i 2D NMR eksperimenti su izvedeni kako bi se utvrdila njihova ispravna dodjela i multiplikatnost.
Tačan položaj vodonika H{{0}} i H-1 oba izomera 6 i 7 utvrđen je na osnovu korelacijske mape sa tri veze 'H-13C iz HMBC-a -NMR eksperiment (slika 2). Za izomer 6 analiza je otkrila da je vodonik na δH 5,78 (H-8) pokazao troveznu korelaciju 'H-13C sa ugljicima na 6c 79,8 (C-1), δc120 .6(4a) i δc 149.4 (C-6), dok je vodonik na δH 4,13 (H-1) pokazao troveznu 'H-13C korelaciju sa ugljicima na c 60.7 (C-3), 6c 115.7 (C-8), δc 120.6 (C-4a) i 131.2 (C-1}), čime se uspostavlja tačne pozicije vodonika H-8 i H-1 za izomer 6. Ova atribucija se može dalje potvrditi analizom vodonika na δH 6,76（H-5) koja je pokazala trostruku vezu H-13C korelacija sa ugljenicima na δc 27.0 (C-4), δc 127.1 (C-8a) i δc 145.7 (C-7) (Slika 2). Za izomer7 analiza je otkrila da je vodonik na δH 6,30 (H-8) pokazao troveznu 'H-13korelaciju sa ugljicima na δc 79,4 (C-1), δc 122,8（ 4a) i δc 148,9 （C-6）, dok je vodonik na δH 4,46 (H-1) pokazao troveznu H-13C korelaciju sa ugljikom na δc 62,9 （C {82}}）,5c 115.5 (C-8), bc 122.8 (C-4a) i 131.4 (C-1'), čime se uspostavljaju tačni položaji vodonika H -8 i H-1 za izomer 7. Ova atribucija je takođe potvrđena analizom vodonika na δH 6,71 (H-5) koja je pokazala troveznu lH-13C korelacije sa ugljikom na δc26.3 (C-4), δc 126.9 (C-8a) i 6c 146.1 (C-7) (Slika 2). Eksperiment NOESY je također izveden kako bi se ustanovila ispravna stereohemija izomera6 i 7. U ovom eksperimentu, jaka NOE korelacija H-1(δH 4.13) i H, CN(5 3.15) ukazuje na -orijentacija kiseonika u izomeru 6. S druge strane, nikakva očigledna NOE korelacija između H-1(6H 4.46) i HAC-N(5H 3.20) nije se mogla naći u 2D-NOESY eksperimentu za 7, što ukazuje na -orijentaciju kiseonika u izomeru 7 (slika 2). Ove male razlike u hemijskim pomacima ovih izomera jasno su uočene zbog stereohemije azota na koju utiču i položaji kiseonika. Poređenja H- i 13C-NMR podataka dobijenih za jedinjenja 6 i 7 sa podacima o molekulima sa bliskim strukturama kao što su heksapetalin A i heksapetalin B [30] podržavaju podatke opisane u Tabeli 1 bez dvosmislenosti.
Jedinjenja 1-4 i 8-13 su identifikovana kao talifolin (1) [32], anonain (2) [33]liriodenin (3)[10,34], (S)-( plus )-retikulin ( 4)[27], koreksimin (8) [34,35], bisnorargemonin (9)[36], izohamanetin (10) [37], dichamanetin (11) [37] i mješavina uvarinola (12) i izouvarinola (13) [37] na osnovu njihovih spektroskopskih profila i poređenja sa vrijednostima u literaturi. lH- i 13C 1D i 2D-NMR spektri, kao i maseni spektri svih izolovanih jedinjenja, dostupni su kao dodatni materijali.
Sa kemofenetičkog (novi termin za biljnu hemosistematiku/kemotaksonomiju biljaka) gledišta, važno je napomenuti da su prisustvo C-benziliranih flavanona i C-benziliranih dihidrohalkona posebna vrsta flavonoida koji su izvedeni iz dobro poznatog flavanon pinocembrina. a posebno su opisani kod vrsta iz roda Uoaria koji pripadaju porodici Annonaceae [3,38-42]. Prisustvo ovih jedinjenja u D. calycina sugeriše bliske hemofenetske veze sa Uoariom. S druge strane, treba sprovesti dalja istraživanja sa drugim delovima biljke, kao i drugim vrstama Diclinanona da bi se potvrdila ova hemofenetska veza. Flavanoni i halkoni su široko rasprostranjeni u višim biljkama, ali dodavanje benzil grupa je prilično rijetko i čini se da je ograničeno u Annonaceae na rod Uoaria [3,39-42], a sada na rod Diclinanona. Benzil grupe vjerovatno nastaju iz C6-C1 puta, ali o-hidroksi funkcionalnost je neobična. Odsustvo supstituenata u B-prstenu u svim ovim flavonoidima Uoaria i Diclinanona može se povezati s prethodnim zapažanjem o flavonoidima Popowia cauliflora [38].
Alkaloidi izvedeni iz izohinolina izolovani i opisani u ovom radu već su registrovani u nekoliko vrsta Annonaceae u različitim rodovima. Neki od njih, kao što su liriodenin i anonain, smatraju se hemofenetskim markerima, a prisustvo ovih alkaloida u D.calycina dodatno pojačava odnos ovih hemofenetskih markera u porodici Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].
Vrijedi napomenuti da su, prema Zidornu [44], kemofenetske studije definirane kao studije koje imaju za cilj da opišu niz specijalizovanih sekundarnih metabolita u datom taksonu, kao što je već primjećeno u nekoliko objavljenih radova [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Dakle, hemofenetske studije doprinose fenetskom opisu svojti, slično anatomskim, morfološkim i kariološkim pristupima, koji su već prepoznati kao od velike važnosti za uspostavljanje "prirodnih" sistema, a koji su i dalje od izuzetnog značaja za opis klasificiranih organizama uz pomoć modernih molekularnih metoda [44].
2.2. Cytotoxic Assay
In vitro citotoksična aktivnost izolovanih jedinjenja (tabela 2), osim jedinjenja 2, 3, 5 i 8 (zbog njihovog niskog prinosa), procenjena je u odnosu naćelija rakalinije HL-60 (ljudska promijelocitna leukemija), MCF-7(ljudski adenokarcinom dojke), HepG2 (humani hepatocelularni karcinom), HCT116 (karcinom debelog crijeva čovjeka) i nekancerozna ćelijska linija MRC{{5} }(fibroblast ljudskih pluća) koristeći Alamar blue test nakon 72 h inkubacije.
Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). Dichamanetin (11) je pokazao citotoksičnu aktivnost protiv HL-60 i HCT116 sa IC50 vrijednostima od 15,78 ug·mL-1(33,70 μmol·L-1) i 18,99 ug·mL-1(40,56 umol.L-1) respektivno. Mješavina uvarinola (12) i izouvarinola (13) pokazala je citotoksičnu aktivnost prema HL-60, sa vrijednošću ICs0 od 9,74ug∶mL-1, i HCT116, sa vrijednošću ICs0 od 17,31 ug∶mL{ {30}}. Među benziliranim dihidroflavonima, samo je izorhamnetin (10) pokazao citotoksičnu aktivnost protiv HepG2 sa IC50 vrijednošću od 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). Prema literaturi, benzilirani dihidroflavoni su opisani sa citotoksičnim svojstvima [39-42]. Među onima koji su opisani u ovom radu, izorhamnetin (10), dichamanetin (11) i uvarinol (12) opisani su u okviru vitro citotoksičnih svojstava protiv humanih tumorskih ćelijskih linija karcinoma nazofarinksa (KB) i P-388 limfocitne leukemije (PS) sa IC50 vrijednostima od 5,3 i 4,1, 4,8 i 1,8, odnosno 5,9 i 9,7, ug.mL-1, respektivno [39,40]. Ove različite aktivnosti mogu se pripisati prisutnosti jedne ili više hidroksi benzil grupa prisutnih u molekulima, kao i poziciji na kojoj su te grupe povezane. Međutim, potrebna je dalja istraga kako bi se potvrdilo ovo zapažanje.
In vitro citotoksičnu aktivnost alkaloida izvedenih izohinolina anonaina (2), liri-adenina (3) i (S)-( plus )-retikulina (4) nedavno su opisali Menezes et al.[2{{16] }}], Souza et al. [6] i Costa et al. [43] s naglaskom na liriodenin, koji je pokazao snažnu citotoksičnu aktivnost protiv ćelijskih linija raka B{{10}}F10(mišji melanom), HepG2 (humani hepatocelularni karcinom), HL{{13 }} (humana promijelocitna leukemija) i K562 (humana kronična mijelocitna leukemija) sa vrijednostima IC5s0 ispod 10,0 μmol.L-1【43】. Anonaine je pokazao umjerenu aktivnost protiv B16-G2, HL60 i K562 sa IC50 vrijednostima niskim od 19,0 umol.L-1[20].(S)-(plus )-Retikulin je pokazao umjerenu aktivnost samo protiv HepG2 sa vrijednostima IC50 od 15,35 μmol L-1【 6,20】.
3. Materijali i metode
3.1. Opće eksperimentalne procedure
Optičke rotacije u metanolu (MeOH) zabilježene su polarimetrom P{{0}} (Jasco, Tokyo, Japan) na 589 nm. 1D i 2D NMR eksperimenti su napravljeni u CDCl. (hloroform-d) ili CDCl plus pad CD, OD (metanol-du, i CD, COCD3(aceton-d6) na 298 K na AVANCE I HD NMR spektrometru (Bruker, Billerica, MA, SAD) koji radi na 11,75 T (Hand 13C na 500 i 125 MHz, respektivno) i na Bruker AVANCE I 600 NMR spektrometru koji radi na 14,1 T('H i 13Cat 60{ {63}} i 150 MHz respektivno). Svi lH- i 13C-NMR hemijski pomaci （δ） su predstavljeni u ppm u odnosu na signal tetrametilsilana na 0.00 ppm kao interna referenca, i Konstante spajanja (D) su date u Hz NMR spektrometar je bio opremljen sa 5-mm multinuklearnom inverznom detekcionom sondom (1D i 2D NMR eksperimenti) sa z-gradijentom. Jednovezna (HSQC) i dva i tri veze (HMBC)1H-13C-NMR korelacijski eksperimenti su optimizirani za prosječnu konstantu spajanja' JcH i LRJ(cH od 140 i 8 Hz, respektivno. Za analizu masene spektrometrije niske rezolucije (LC-MS) uzorci izolovanih jedinjenja su resuspendovani u metanolu (HPLC kvaliteta), stvarajući stoku k rastvora (1 mg·mL-1). Alikvoti (5 uL) matičnih rastvora su dalje razblaženi do 5 ug·mL i analizirani direktnom infuzijom u trostruki kvadrupolni maseni spektrometar, model TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, Kalifornija, SAD), opremljen elektrosprej jonizacijom (ESI) ili izvori hemijske jonizacije atmosferskog pritiska (APCI). ESI-MS uslovi: napon raspršivanja, 5kV; plašt gas, 10 proizvoljna jedinica (arb); pomoćni gas, 5arb;sweep gas,0arb;kapilarna temp, 250 stepeni ; kapilarni napon, 40 V; cevno sočivo, 70 V; opseg mase, m/z 100 do 1000. APCI-MS uslovi: struja pražnjenja, 5 μA; temperatura isparivača, 350 stepeni; tlak plina u omotaču,25 proizvoljna jedinica (arb); pritisak gasa za čišćenje jona,0,0 arb; pritisak pomoćnog gasa, 10 arb; temperatura kapilara, 250 stepeni C; offset cijevnog sočiva,70 V; skimer offset,0 V; raspon mase,m/z 100 do 1000. Argon je korišten kao kolizioni plin, a MS/MS spektri su dobijeni korištenjem energija sudara u rasponu od 25 do 30 eV. Za kolonsku hromatografiju (CC) korišten je silika gel 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, SAD, 70-230 mesh), dok je silika gel 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Njemačka, 0,25 mm, aluminijum) korišćen je za analitičku i preparativnu hromatografiju tanke laver (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, staklo). Jedinjenja su vizualizirana izlaganjem pod UV254/365 svjetlošću, prskanjem sa p-anisaldehidnim reagensom, praćenim zagrijavanjem na vrućoj ploči i prskanjem Dragendorffovog reagensa.
3.2. Biljni materijal
U ovom istraživanju, botanički materijal (kora) D.calycina sakupljen je 27. maja 2017. u rezervatu Adolpho Ducke (geografske koordinate: 02 stepen 53'36.1S i 59 stepen 58'28.9"W), Manaus, država Amazonas , Brazil, a identifikovao ga je prof. dr. pristup (primjerak) je registriran u Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) sa zapisom A70EDCD.
3.3. Ekstrakcija i izolacija
Kora D.calycina je prvobitno sušena na sobnoj temperaturi 24 h, a zatim sušena u peći sa cirkulacijom vazduha 48 h na temperaturi od 40 stepeni, a zatim usitnjena u mlinu sa četiri noža (Marconi, Piracicaba, SP , Brazil) za dobijanje praškastog materijala (1340 g). Zatim je izvršena iscrpna maceracija sa heksanom (8×4 L), a zatim MeOH (8×4 L). Dobijeni ekstraktivni rastvori su koncentrirani u rotacionom isparivaču na sniženom pritisku (40-50 stepen) da bi se dobili ekstrakti heksana (24,85 g) i MeOH (199,43 g), respektivno.
TLC analiza otkrivena sa Dragendorffovim reagensom pokazala je visoko prisustvo alkaloida u MeOH ekstraktu. Stoga je alikvot MeOH ekstrakta (188,30 g) u početku podvrgnut kiselo-baznoj ekstrakciji da bi se dobile alkaloidne (5,46 g) i neutralne (4,47 g) frakcije. Nakon toga, dio alkaloidne frakcije (5.0g) je podvrgnut hromatografskoj koloni na silika gelu (CC) koja je prethodno tretirana 10% otopinom NaHCO3 [12], eluirano heksanom (100%), heksanom-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 posto), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,0/u), EtOAc (100 posto), EtOAc-MeOH(95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80, i 10:90, v/o), i konačno MeOH dajući 250 frakcija (30 mL svaka). Nakon TLC evaluacije korištenjem mješavine CH2Cl2-MeOH u omjerima 95:05, 90:10, 85:15 i 80:20 kao sistem eluiranja (v/o), slični uzorci su spojeni da bi se dobilo 16 frakcija (F1 do F16).
Frakcija F5 (181,2 mg) iz početnog CC eluirana heksanom-CH,Cl2 (50:50 do 10:90,v/o) je podvrgnuta novom silika gelu CC, koristeći istu metodologiju iznad, eluiran heksanom (100 posto), heksanom -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 posto ), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80,i 10:90 ,o/),EtOAc (100 posto), EtOAc-MeOH (85:15,70:30,50:50, 30:70 i 15:85, /o), i MeOH (100 posto) dajući 118 frakcija ( po 15 mL) koje su objedinjene u 12 podfrakcija (F5.1 do F5.12), prema procjeni TLC analize korištenjem mješavine CH2Cl2-MeOH u omjerima 95:05 i 90:10. Subfrakcija F5 .1 (28,9 mg) eluiran heksanom (100 posto) je podvrgnut preparativnoj TLC, celuiran sa CH,Cl-MeOH (95:05, v/v, dva eluiranja) dajući 2 (1,4 mg) i 3 (1,7 mg), respektivno. Subfrakcije F5.4 (21,5 mg) eluirane heksanom-CH,C(80:20,vo), F5,5 (16,7 mg)eluirane heksanom-CH,Cl(80:20,70:30,60;40 i 50:50 ,v/), i F5.6 (15,4 mg) eluiran heksanom-CHCl2 (50:50,40:60 i 30:70, v/o) su spojeni (53,6 mg) i također podvrgnuti preparativnoj TLC eluciji sa CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, dva eluiranja) dajući 3 (8,9 mg).
Frakcija F6(2099,1 mg) iz početnog CC eluiranog sa heksanom-CHCl(10:90,v/)), CH2Cl, (100 procenat ), a CH,Cl2-EtOAc (90:10 do 10:90, o/o) je podvrgnut novom silika gelu CC koristeći istu metodologiju iznad, eluiran sa istim sistemima rastvarača dajući 140 frakcija (30 mL svaki). Nakon TLC evaluacije koristeći mješavinu CH2Cl2-MeOH u omjerima 95:05, 90:10 i 85:15 kao eluentni sistem (o/o), slični uzorci su spojeni da bi se dobilo 13 subfrakcija (F6 .1 do F6.13). Subfrakcija F6.6 (1541,3 mg) je podvrgnuta novom silika gelu CC koristeći istu metodologiju iznad, eluiran sa istim sistemima rastvarača dajući 120 frakcija (30 mL svaka) koje su analizirane TLC (koristeći istu metodologiju iznad) dajući 12 novih podfrakcije (F6.6.1 do F6.6.12). Subfrakcija F6.6.2 (17,0 mg) eluirana sa heksanom-CH,Cl, (60:40 i 50:50, v/v) je podvrgnuta preparativnoj TLCeluciji sa CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o, jedno eluiranje) što rezultira 3 (1,4 mg). Subfrakcija F6.6.3 (643,3 mg) eluirana sa heksanom-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 i 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 posto), i CH2Cl2-EtOAc (90:10 i 80:20,o/o) je podvrgnut preparativnoj TLCeluciji sa CH2Cl2-MeOH (90 :10, vfo, jedno eluiranje) dajući novu subfrakciju F6.6.3.1 (161,8 mg) koja je podvrgnuta novom preparativnom TLC eluiranom sa EtOAc-MeOH (90:10, v/o, jedno eluiranje) dajući 4 (148,2 mg).Subfrakcija F6.6.4 (90,2 mg) eluirana sa CH2Cl2-EtOAc (70:30 i 60:40,o/o) je podvrgnuta preparativnoj TLCeluciji sa CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, jedno eluiranje) dajući 1 (1,4 mg) i 4 (50,1 mg), respektivno. Subfrakcija F6.6.5 (83,4 mg) eluirana sa CH,Cl-EtOAc (60:40 i 50:50, o/o) je takođe podvrgnuta preparativnoj TLCeluciji sa CH,Cl2-MeOH(90:10, ufo, jedno eluiranje) dajući ponovo 1 (1,5 mg) i 4 (45,5 mg), respektivno. Subfrakcija F6.6.6 (101,4 mg) eluirana sa CH,Cl2-EtOAc (50:50 i 40:60, v/)) je podvrgnuta preparativnoj TLC eluiranoj sa CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, jedno eluiranje) dajući 8 (3,4 mg) i drugu podfrakciju F6.6.6.1 (48,8 mg). Ova podfrakcija (F6.6.6.1) je podvrgnuta preparativnoj TLC-eluiranoj u početku sa EtOAc-MeOH (85 :15, vo, jedno eluiranje) i posteriorno CHCl-MeOH (90:10, v/v, jedno eluiranje) što opet rezultira 4 (37,4 mg). Za ovu proceduru, hromatografska ploča je inicijalno eluirana sa mobilnom fazom EtOAc-MeOH (85:15, v/o, jedno eluiranje). Nakon ovog eluiranja, hromatografska ploča je osušena da bi se uklonio rastvarač i potom podvrgnuta novom eluiranju sa mobilnom fazom CH,Cl,-MeOH (90:10,vf, jedno eluiranje) dajući 4.Subfrakcija F6.6.7 ( 109,0 mg)eluirano sa CH,Cl2-EtOAc(40:60,30:70,20:80 i 10:90,vfo) je podvrgnuto preparativnoj TLC eluirano sa CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, jedno eluiranje) dajući drugu subfrakciju F6.6.7.1 (24,8 mg) koja je podvrgnuta novom preparativnom TLC eluiranom u početku sa EtOAc-MeOH (85:15, v/o, jedno eluiranje) i naknadno CH2Cl2-MeOH (90:10,vfo, jedno eluiranje) što rezultira 9 (11,1 mg). Procedura izolacije korišćena za 9 je ista kao što je prethodno opisano za 4. Subfrakcija F6.6.10 (92,0 mg) eluirana sa EtOAc-MeOH (60:40 i 50:50, v/o) je podvrgnuta preparativnoj TLCceluciji sa CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, jedno eluiranje) dajući 5 (1,7 mg) i 6 (7,8 mg), respektivno. Subfrakcija F6.6.11 (326,0 mg) eluirana sa EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,v/o) je podvrgnuta preparativnoj TLCeluciji sa CHCl- MeOH (90:10, v/o, jedno eluiranje) sa 1 (2,4 mg) i 7 (12,5 mg), respektivno.
Frakcija F7 (692,4 mg) iz početnog CCelutira sa EtOAc (100 posto ) i CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 i 75:25,ofo) je podvrgnuta novom silika gelu CC Koristeći istu metodologiju kao što je opisano za početni CC sa istim sistemima rastvarača koji daje 110 frakcija (po 30 mL). Nakon TLC evaluacije korištenjem mješavine CH2Cl2-MeOH u omjerima 95:05, 90:10 i 85 :15 kao eluentni sistem (o/o), slični uzorci su spojeni da bi se dobilo 12 subfrakcija (F7.1 do F7.12).F7.8 (147,4 mg) eluiranih sa CH,Cl2- EtOAc (50:50,40:60, i 30:70,v/o posto) je podvrgnut preparativnoj TLC eluiran sa CHCl-MeOH (95:05, vfo, jedno eluiranje) dajući 10 (5,4 mg) i 11( 120,6 mg). F7.9 (144,2 mg) eluiran sa CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 i 10:90, v/o posto) je također podvrgnut preparativnoj TLCeluciji sa CH,Cl,-MeOH( 95:05,vo, jedno eluiranje) dajući 11 (91,2 mg) i mešavinu 12 i 13 (39,4 mg), respektivno.
Talifolin (1): Smeđi amorfni prah;' H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [32]; LR-ESI( plus )-MS [M plus H]* plus m/z 208.
Anonaine (2): Smeđi amorfni prah; 1H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [33]; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 266.
Liriodenin (3): Žuti kristali (CH,Cl-MeOH 3:1); 1H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [10,34]; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 276.
(S)-( plus )-Retikulin(4): Smeđi amorfni prah; [ ]p25 plus 71,60(c 0,05 g/100 mL, MeOH); 1H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [27;LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 30.
3,4-Dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izohinolinil)(3-hidroksi-4-metoksifenil)-metanon (Dehidro-oksonorretikulin)(5 ): Smeđi amorfni prah; 'H i 13C-NMR podaci, vidi tabelu 1; LR-ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.
( plus ){{0}}S,2R-retikulin N-oksid(6): Smeđi amorfni prah; [lp25 plus 136,4 (c0,146g/100 mL, MeOH); 1Hand 13C-NMR podaci, vidi tabelu 1; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/2346
( plus ){{0}}S,2S-retikulin N.-oksid (7): Smeđi amorfni prah; [ ]p25 plus 394,5 (c 0,03g/100 mL, MeOH);'H i 13C-NMR podaci, vidi tabelu 1;LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z346.
Koreksimin (8): Svijetlo žuti amorfni prah;[ ]p25 plus 201.1(c 0,08g/100mL, MeOH)'H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom[34,35];LR- ESI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.
Bisnorargemonin (9): Smeđi amorfni prah; 1H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [36]; LR-APCI( plus )-MS [M plus H] plus m/z 328.
Isochamanetin (10): Svijetlo žuti amorfni prah; [ p25-12.4(c 0,5 g/100 mL, MeOH)'H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.
Dichamanetin (11): Žuti amorfni prah;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.
Mešavina uvarinola(12) i izouvarinola(13): Žuti amorfni prah; H-NMR i 13C-NMR u skladu sa literaturom [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.
3.4. In vitro citotoksični test
3.4.1.Ćelije
HL-60 (humana promijelocitna leukemija), MCF-7 (adenokarcinom dojke kod ljudi), HepG2 (humani hepatocelularni karcinom), HCT116 (karcinom debelog crijeva čovjeka) i MRC-5 (ljudski fibroblast pluća) ćelijske linije su dobijene iz American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SAD) i uzgajane su prema preporuci ATCC vodiča za kulturu životinjskih stanica. Sve ćelijske linije su testirane na mikoplazmu korištenjem kompleta za bojenje mikoplazme (Sigma-Aldrich) kako bi se potvrdila upotreba ćelija bez kontaminacije.
3.4.2. Cytotoxicity Assay
Za test citotoksičnosti, vitalnost ćelija je kvantifikovana metodom Alamar blue, kao što je prethodno opisano [{{0}}]. Za sve eksperimente, ćelije su postavljene u 96-ploče sa jažicom. Hemijski sastojci su otopljeni u dimetil sulfoksidu (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazil) i dodani u svaku jažicu i inkubirani 72 h. Doksorubicin (doksorubicin hidrohlorid, čistoća veća ili jednaka 95 posto, Laboratorija IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) korišten je kao pozitivna kontrola. Na kraju tretmana, 20 μL matične otopine (0,312 mg/mL) resazurina (Sigma-Aldrich Co.) je dodan u svaku jažicu. Apsorbancije na 570 nm i 600 nm su izmjerene korištenjem SpectraMax190 Microplate Reader-a (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Poluinhibicijska koncentracija (IC50) je dobijena nelinearnom regresijom sa 95 posto intervala pouzdanosti (CI95 posto) koristeći softver GraphPad Prism (Intuitivni softver za nauku; San Diego, CA, SAD).
4. Zaključak
Fitokemijsko ispitivanje kore D.calycina dovelo je do izolacije i identifikacije trinaest jedinjenja (1-13); devet alkaloida izvedenih izohinolina (1-9) i četiriflavonoidi(10-13). Alkaloidi pripadaju sljedećim podklasama: jednostavni izohinolin, thali online(1);aporfin, anonain (2); oksoaporfin, liriodenin (3); benzil-tetrahidroizohinolini, ( plus )-retikulin(4), de hidro-oksonorretikulin(3,4-dihidro-7-hidroksi-6-metoksi-1-izohinolinil)({{13} }hidroksi-4-metoksifenil)-metanon)(5), 1S,2R-retikulin Ng-oksid(6) i 1S,2S-retikulin N.-oksid (7); tetrahidro protoberberin, koreksimin (8) i pavin, bisnorargemonin (9). Dok flavonoidi pripadaju benziliranim dihidroflavonima, izorhamnetin (10), dichamanetin (11) i mješavina uvarinola (12) i izouvarinola (13). Izolovana jedinjenja su prvi put opisana u D.calycina kao iu rodu Diclinanona.
Citotoksična aktivnost izolovanih jedinjenja (osim anonaina, liriodenina, 1,2-dihidro-oksonorretikulina i koreksimina) procijenjena je protiv raka (HL-60, MCF-7, HepG2 i HCT116) i nekancerozne (MRC-5) ćelijske linije. Među njima, rezultati koji najviše obećavaju uočeni su za benzilirane dihidroflavone dichamanetin (10), a
mješavina uvarinola (12) i izouvarinola (13) koja je pokazala umjerenu citotoksičnu aktivnost protiv testiranih ćelijskih linija raka (<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). Dichamanetin (11) je pokazao citotoksičnu aktivnost protiv HL-60 i HCT116 sa IC50 vrijednostima od 15,78 ug·mL-1 (33,70 μmol-L-1}) i 18,99 ug·mL-I (40mol). .L-1) dok je mješavina uvarinola （12） i izouvarinola (13) pokazala citotoksičnu aktivnost protiv HL-60, sa IC50 vrijednošću od 9,74 ug∶mL-I, i HCT116, sa IC50 vrijednost od 17,31 ug·mL-1. Ovi rezultati na ćelijskim linijama tumora su također po prvi put opisani za benzilirane dihidroflavone. Prethodno su utvrđene citotoksične aktivnosti retikulina, anonaina i liriodenina, u kojima je liriodenin najmoćniji spoj.
Rezultati dobijeni u ovom radu ukazuju na to da su vrste iz porodice Annonaceae obećavajući izvor biološki aktivnih jedinjenja sa citotoksičnim svojstvima i sugerišu nastavak njihovog istraživanja na drugim modelima bioloških testova.
Reference
1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Rana evolucijska istorija porodice cvjetnica Annonaceae: Stalna diverzifikacija i boreotropska geodisperzija. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]
2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brazil, 1984.
3. Leboeuf, M.; Cave, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. The phytochemistry of the Annonaceae. Phytochemistry 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]
4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: A review. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237–278. [CrossRef]
5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Alkaloidi Annonaceae: Pojava i kompilacija njihovih bioloških aktivnosti. U Alkaloidima; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Holandija, 2015; Poglavlje 5; Sveska 74, str. 233–409. [CrossRef]
6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Čaar, JS; Koolen, HHF; et al. Fenilpropanoidi izvedeni iz azarona i alkaloidi izvedeni iz izokinolina iz kore Duguetia pycnastera (Annonaceae) i njihova citotoksičnost. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]
7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Alkaloidi izvedeni iz izokinolina iz kore Guatteria olivacea (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]
8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Happi, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Prirodni proizvodi od ljekovite biljke Duguetia staudtii (Annonaceae). Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]
9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Antioksidativno, antireumatsko i protuupalno ispitivanje ekstrakta i dicentrinona iz Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Hook. f. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]
10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Tripanocidna aktivnost oksoaporfina i pirimidin{2}}karbolinskih alkaloida iz grana Annona foetida Mart. (Anonaceae). Molecules 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]
11. Silva, DB; Tulli, EKO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Antitumorska, tripanocidna i antilešmanijalna aktivnost ekstrakta i alkaloida izoliranih iz Duguetia furacea. Phytomedicine 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]
12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. Pirimidin{1}}karbolin i drugi alkaloidi iz Annona foetida sa antilešmanskim djelovanjem. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]
