Aristolohična kiselina izaziva bubrežnu fibrozu i starenje kod miševa
Mar 23, 2022
sažetak:Bubrezi su jedan od organa koji su najosjetljiviji na oštećenja uzrokovana starenjem. Općenito, starenje bubrega je praćeno renalnom fibrozom, koja je posljednji uobičajeni put kroničnebolesti bubrega. Aristolohična kiselina (AA), nefrotoksično sredstvo, uzrokuje AA nefropatiju (AAN), koju karakterizira progresivna renalna fifibroza i funkcionalni pad. Iako je fibroza bubrega povezana sa starenjem bubrega, ostaje nejasno da li AA izaziva starenje bubrega. Cilj ove studije je istražiti potencijalnu upotrebu AAN-a kao modela starenja bubrega. Ovdje smo ispitali faktore povezane sa starenjem u AAN modelima kroničnom primjenom AA miševima C57BL/6. U poređenju sa kontrolama, AA grupa je pokazala starenjebubregfenotipovi, kao što su atrofija bubrega, smanjenje funkcije bubrega i tubulointersticijska fifibroza. Osim toga, AA je promovirao ćelijsko starenje posebno ububrezii povećana ekspresija bubrežne p16 mRNA i aktivnost galaktozidaze povezane sa starenjem. Nadalje, miševi tretirani AA pokazali su abnormalnosti proksimalnih tubularnih mitohondrija, kao i akumulaciju reaktivnih vrsta kisika. Klotho, gen protiv starenja, također je značajno smanjen ububrezimiševa tretiranih AA. Zajedno, rezultati ove studije pokazuju da AA mijenja faktore vezane za starenje i da je fibroza bubrega usko povezana sa starenjem bubrega.
Ključne riječi:hronična bolest bubrega; renalna fifibroza; aristolohična kiselina; starenje; ćelijsko starenje
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLESTI BUBREGA/BUBREGA
UvodUz kontinuirano produžavanje životnog vijeka ljudi, sve više pojedinaca pati od oštećenja povezanih sa starenjem.Bubrezisu tipično zahvaćeni oštećenjem tkiva vezanim za starenje i učestalošću kroničnogbolest bubregapovećava se sa godinama [1]. Starenje bubrega ubrzava sveukupno starenje, što rezultira kraćim životnim vijekom. Stoga su istraživanja o starenju bubrega neophodna, iako odgovarajući životinjski modeli nisu u potpunosti razvijeni. Starenje bubrega je praćeno različitim patološkim promjenama, uključujući atrofiju bubrega, glomerulosklerozu i tubulointersticijsku fifibrozu [2]. Bubrežna tubulointersticijska fifibroza je posljednji uobičajeni put u većini oblika progresivne bubrežne bolesti, što sugerira da je fibroza bubrega usko povezana sa starimbubreg. U istraživanju starenja, miševi su pouzdan alat zbog svoje genetske blizine ljudima, sposobnosti da genetski manipulišu svojim genomom i činjenice da predstavljaju slične fenotipove povezane sa starenjem kao i ljudi tokom njihovog životnog vijeka [3]. Longitudinalna promatranja pomoću inbred miševa idealna su kao model starenja, iako je dugotrajno praćenje miševa do njihovog punog životnog vijeka. Osim toga, postoji nekoliko genetski modificiranih mišjih modela starenja. Miš s nedostatkom Klotho je model preranog starenja koji se koristi u istraživanju starenja. Međutim, u ovom modelu bubrežna funkcija je nepromijenjena, a oštećeno je i nekoliko drugih organa osim bubrega [4]. Stoga, ovaj model miša može biti neprikladan za istraživanje starenja bubrega.Primjena aristolohične kiseline (AA) uzrokuje specifičan tip oštećenja bubrega poznat kao AA nefropatija (AAN), koju karakterizira ekstenzivna intersticijska fibroza [5,6]. AA je toksičan za bubrežni tubularni epitel jer potiče stvaranje DNK adukata u bubrežnim tkivima [7]. Malo je vjerovatno da će AA utjecati na druge organe osim urinarnog sistema i može biti korisna za procjenububreg-specifične izmjene. Stoga se AA obično koristi za uspostavljanje modela renalne fifibroze kod miševa [8,9]. Međutim, ostaje nejasno da li su promjene izazvane AA povezane sa starenjem ububrezi. U ovoj studiji ispitali smo fenotipove vezane za starost i molekularne faktore u AAN kod miševa
Rezultati 2.1. Davanje AA izazvalo je značajan gubitak težine, atrofiju bubrega i pad bubrežne funkcijeOsnovna tjelesna težina (BW) i sistolički krvni pritisak (BP) bili su identični između kontrolne grupe i grupe AA. BW u kontrolnoj grupi vozila se konstantno povećavao tokom 8 sedmica. Međutim, povećanje tjelesne težine je inhibirano primjenom AA, a AA grupa je imala značajno niži BW 4 i 8 sedmica nakon početka primjene AA (Slika 1A). Nije bilo značajne razlike u sistoličkom BP ili srčanom ritmu između kontrolne grupe i grupe AA (Slika 1B,C). Omjer srčane težine/TW nije pokazao razliku između grupa 8 sedmica nakon početka primjene AA (slika 1D), dokbubregOdnos težina/TW bio je značajno niži u grupi sa AA 8 nedelja nakon početka primene AA (slika 1E). Zatim smo ispitali bubrežnu funkciju u grupama za kontrolu vozila i AA. Koncentracije kreatinina i azota ureje (UN) u plazmi bile su značajno veće u grupi koja je primala AA nego u kontrolnoj grupi sa vehikulumom 8 nedelja nakon početka primene AA. Pored toga, tretman AA značajno je smanjio klirens kreatinina u poređenju sa kontrolnom grupom vehikuluma 8 nedelja nakon početka primene AA (Slika 1F-H).
2.2. AA administracija izazvala je otvorenu tubulointersticijsku fibrozu i značajnu regulaciju ekspresije gena povezane s fibrozom u bubrezimaHistološki pregled pomoću bojenja periodičnom kiselinom po Schiffu (PAS) otkrio je da je glomerularno područje značajno smanjeno u AA grupi u poređenju sa kontrolnom grupom sa vehikulumom (Slika 2A). Ekstenzivna tubulointersticijska fifibroza, procijenjena pomoću Massonovog trihroma (MT) bojenja, uočena je u AA grupi (slika 2B), kao i uz povećanje nivoa mRNA gena povezanih s fifibrozom bubrega, kolagena I i III i transformirajućeg faktora rasta ( TGF)- (Slika 2C–E).
2.3. AA primjena ubrzala ćelijsko starenje, mitohondrijalnu disfunkciju i akumulaciju reakcionih vrsta kisika/gena (ROS) u bubrezimaDa bismo procijenili ćelijsku senescenciju, ispitali smo ekspresiju mRNA u bubrezima p53, p21, p16 i glutaminaze (GLS). Grupa AA pokazala je značajno više razine mRNA ovih gena povezanih sa starenjem ububrezi(Slika 3A-D). Nadalje, intenzitet bojenja -galaktozidaze (SA- -gal) povezan sa starenjem ububrezibio je povećan u AA grupi i gotovo izostao u kontrolnoj grupi sa nosačem (slika 3E). U AA grupi, elektronska mikroskopija je otkrila nestanak mitohondrijalnih krista, fragmentaciju mitohondrija, citoplazmatsku vakuolizaciju i autolizozome u proksimalnim tubularnim stanicama, istovremeno sa smanjenje regulacije BCL2/adenovirusa E1B 19-kDa interakcijskog proteina 3 (Bnip3), gena povezanog sa mitohondrijama (Slika 3FG). Bubrežna mRNA ekspresija Nox2. komponenta nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaze, značajno je povećana u AA grupi u poređenju sa kontrolnom grupom vehikuluma (Slika 3H). Nadalje, Western blot analiza je otkrila da je bubrežni 4-hidroksi-2-nominalni (4-HNE) nivo značajno povećan u AA grupi (Slika 3I). Ovi rezultati su pokazali da je primjena AA izazvala ćelijsko starenje, mitohondrijalnu disfunkciju i akumulaciju ROS ububrezi.
2.4. AA smanjena ekspresija bubrežnog Klotho proteinaIspitivali smo bubrežnu ekspresiju proteina protiv starenja u kontrolnoj grupi i AA grupama. Klotho ekspresija je bila značajno smanjena u AA grupi u poređenju sa kontrolnom grupom vehikuluma (Slika 4A), dok je bubrežna ekspresija nikotinamid fosforiboziltransferaze (NAMPT) i sirtuina1 (SIRT1) bila slična između grupa (Slika 4B,C).
3. DiskusijaPrema našim saznanjima, ova studija je prva koja se fokusira na evaluaciju bubrežnih promjena povezanih sa starenjem u AAN koristeći markere starenja, kao što su p16 i SA- -gal aktivnost. Liječenje AA je potaknulo atrofiju bubrega, tubulointersticijalnu fibrozu i opadanje bubrežne funkcije, koji su bili praćeni pojačanom regulacijom renalne p16 mRNA i SA- -gal-pozitivnim bojenjem. Nadalje, AA grupa je pokazala karakteristike bubrežnih mehanizama vezanih za starenje, kao što su abnormalnosti mitohondrija, povećan oksidativni stres i smanjena regulacija gena protiv starenja, Klotho. Uzeto zajedno, naša zapažanja sugeriraju da kronična primjena AA djelomično oponaša starenje bubrega.
Ćelijsko starenje je trajno zaustavljanje ćelijske proliferacije kao odgovor na različite stresore, kao što je oštećenje DNK, i doprinosi starenju i bolestima povezanim sa starenjem. Ekspresija p16, inhibitora kinaze zavisnog od ciklina, povezana je sa starenjem u različitim organima, uključujući bubrege. Ograničenje kalorija produžava životni vijek inhibicijom pl6 ekspresije [10]. Dodatno, eliminacija p16-ekspresirajućih stanica starenja kod INK-ATTAC miševa putem injekcije AP20187, FK506-vezujućeg proteinskog dimerizera [11], uzrokuje slabljenje fenotipova starenja bubrega, kao što su glomerularna skleroza i renalna funkcionalni pad. Stoga je p16 jedan od najvažnijih faktora vezanih za starenje. Stareće ćelije se mogu detektovati korišćenjem SA- -gal bojenja, koje pokazuje povećanu aktivnost -galaktozidaze na pH 6,0 [12], i široko je korišćen biomarker starih i ostarelih ćelija. Bubrežna mRNA ekspresija pl16 se povećava kod starijih pacovabubrezii praćen je povećanom aktivnošću SA- -gala u bubrežnom epitelu [13I. U ovoj studiji, pokazali smo povećanu ekspresiju mRNK p16 u bubrezima i bojenje SA- -galom, što ukazuje da AA indukuje bubrežno starenje. Nedavno je objavljeno da je GLS neophodan za preživljavanje starih ćelija putem pojačane glutaminolize i intracelularne pH neutralizacije [14]. Pokazalo se da inhibicija glutaminolize zavisne od GLS-a kod ostarjelih miševa eliminira stare ćelije i poboljšava disfunkciju organa koja je povezana sa starenjem. U ovoj studiji, povećana regulacija bubrežne GLS mRNA je ukazala na bubrežnu akumulaciju senescentnih ćelija u grupi. Stoga je kronična primjena AA uzrokovala ćelijsko starenje u bubrezima.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Pored ćelijskog starenja, mitohondrijska disfunkcija je esencijalni mehanizam u osnovi oštećenja tkiva uzrokovanog starenjem i praćena je akumulacijom ROS-a [15,16. Mitohondrijska disfunkcija pokreće i održava ćelijsko starenje [17] dok ćelijsko starenje direktno doprinosi disfunkciji mitohondrija [18]. Bnip3, koji se prvenstveno nalazi u vanjskoj mitohondrijalnoj membrani, može igrati ulogu u regulaciji mitofagije u kultiviranim bubrežnim proksimalnim tubularnim stanicama kao odgovor na oksidativni stres i hipoksiju. Kod ostarjelih miševa, ograničenje kalorija povećava autofagiju u tubularnim stanicama, putem regulacije Bnip3, i poboljšava degeneraciju bubrežne funkcije uzrokovanu starenjem [19]. U ovoj studiji, elektronska mikroskopija je otkrila karakteristike mitohondrijalnih abnormalnosti na koje može uticati smanjena ekspresija bubrežnog Bnip3 ili ćelijsko starenje. Mitohondrije su glavni intracelularni izvor ROS. Da bismo procijenili efekte mitohondrijalnih abnormalnosti na bubrežni ROS, ispitali smo bubrežnu akumulaciju 4-HINE i demonstrirali akumulaciju ROS-a izazvanu AA ububrezi.NADPH oksidaze su glavni izvor ROS. Tokom akutne faze AAN kod miševa, ekspresija Nox2 u bubrežnoj mRNK je bila povišena, a dostupnost dušikovog oksida smanjena, što je dovelo do trajne hipoksije i ishemije [20. Kod ostarjelih pacovabubrezi, akumulacija ROS je praćena povećanom ekspresijom Nox2 [21]. Ovi nalazi sugeriraju da AA može inducirati fenotipove vezane za starenje putem akumulacije ROS uzrokovane mitohondrijalnom disfunkcijom i povećanjem NADPH oksidaza.
Ekspresija bubrežnog Klotho gena je smanjena u AA grupi, dok je ekspresija NAMPT i SIRTl bila slična između grupa. Klotho je gen protiv starenja koji kodira jednoprolazni transmembranski protein koji djeluje kao supresor starenja. Proces starenja kod miševa s nedostatkom Klotho-a sličan je onom kod ljudi, uključujući kraći životni vijek, neplodnost, arteriosklerozu, atrofiju kože, osteoporozu i emfizem [22]. Hipomorfni mutantni Klotho miševi su također pokazali fenotip ubrzanog starenja, koji je obnovljen ablacijom p16 [23]. Budući da je Klotho važan faktor starenja, Klotho genski modificirani miševi su naširoko korišteni u istraživanju starenja. Međutim, miševi modifikovani Klotho genom mogu biti neprikladni za istraživanje bubrežnog starenja zbog sistemskih oštećenja ovih miševa povezanih sa starenjem i činjenice da bubrežna funkcija nije potvrđena (tj. nivoi kreatinina). Nasuprot tome, model miša AAN može se koristiti kao model bubrežnog starenja izazvanog lijekovima u istraživačke svrhe, jer ima nekoliko prednosti, kao što su relativna lakoća implementacije i mogućnost procjene učinaka intervencija na smanjenje bubrežne funkcije. .
Ova studija je imala neka ograničenja. Procijenili smo bubrežno starenje, fokusirajući se uglavnom na ćelijsko starenje, mitohondrijalnu morfologiju i ekspresiju gena povezanu sa starenjem. Međutim, mehanizmi starenja su složeni i nedovoljno shvaćeni. Osim toga, iako je ekspresija Klotho gena smanjena kao odgovor na AA, nismo mogli pokazati uzročnu vezu s patološkim promjenama u AAN. Potrebne su daljnje studije kako bi se utvrdile uloge različitih molekula uključenih u razvoj AAN-a. Ipak, ova studija pruža nove uvide u upotrebu Avana kao modela starenja bubrega. Važno je napomenuti da su fenotipske promjene ububregsnažno su povezani sa životnim vijekom. Iako jebubreglako podliježu promjenama povezanim sa starenjem, inhibicija bubrežnog starenja može produžiti cjelokupni životni vijek. Stoga, dalja istraživanja o starenju bubrega korištenjem modela AAN-a mogu dovesti do produženja dugovječnosti u budućnosti.
4. Materijali i metode4.1. ŽivotinjeOva studija je provedena u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za korištenje eksperimentalnih životinja. Svi eksperimenti na životinjama odobreni su od strane Komiteta za studije na životinjama Univerziteta Yokohama City (broj odobrenja: FA20-027) i provedeni su u skladu sa smjernicama ARRIVE. Uloženi su napori da se smanji broj korištenih životinja i njihova patnja. Miševi su smješteni u kontroliranom okruženju pod ciklusom 12-h svjetlo/12-h tama na temperaturi od 25 stepeni C. Miševi su imali slobodan pristup hrani i vodi.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI INFEKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Osmonedeljni mužjaci miša C57BL/6 kupljeni su od Charles River Laboratories (Wilmington, MA, SAD) i raspoređeni u kontrolne grupe vozila ili AA grupe nakon 1 nedelje aklimatizacije, miševima je intraperitonealno davan vehikulum ili AA (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, SAD), koji je otopljen u maloj količini dimetil sulfoksida. Prije ove studije, proveli smo preliminarnu studiju koristeći nekoliko protokola. Prvi protokol je uključivao davanje AA (3 mg/kg) miševima C57BL/6 intraperitonealno dva puta sedmično tokom 4 sedmice bez vremena remodeliranja; u ovom protokolu, AA je uzrokovao očigledne akutne lezije bubrega, kao što su prošireni proksimalni tubuli s gubitkom ruba četkice (dodatna slika S1). U drugom protokolu, miševima C57BL/6 je davan AA (2,5 mg/kg) intraperitonealno jednom sedmično tokom 4 sedmice, nakon čega je uslijedilo vrijeme remodeliranja tokom 4 sedmice; Kreatinin u plazmi kod ovih miševa bio je 0,19 ± {{20}}.080 mg/dL naspram 0,18 ± 0,010 mg/dL (kontrola vozila naspram AA, respektivno; srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti (SEM), p=0.86, neupareni Studentov t-test, n=4 po grupi) i UN plazme je bio 31,3 ± 5,95 mg/dL u odnosu na 30,4 ± 3,87 mg/dL (kontrola vozila naspram AA, respektivno; srednja vrijednost ± SEM, p=0,90, neupareni Studentov t-test, n=4 po grupi). Stoga smo utvrdili da ovaj protokol nije prikladan za model ozljede bubrega jer AA nije izazvao značajno smanjenje bubrežne funkcije. U trećem protokolu, miševima C57BL/6 je davan AA (3 mg/kg) intraperitonealno dva puta sedmično tokom 10 sedmica bez vremena remodeliranja; kod ovih miševa, stopa smrtnosti u AA grupi bila je 83 posto (n=6), dok nijedan od miševa u kontrolnoj grupi nije uginuo (n=4). U ovom protokolu nismo mogli statistički procijeniti bubrežni fenotip izazvan AA zbog visokog mortaliteta. U četvrtom protokolu, miševima C57BL/6 je davan AA (3 mg/kg) intraperitonealno dva puta nedeljno tokom 4 nedelje, nakon čega je usledilo vreme remodeliranja tokom 4 nedelje; kronične lezije bubrega, kao što je tubulointersticijska fifibroza, i smanjenje bubrežne funkcije uočene su kod ovih miševa [9]. Stoga smo, na osnovu rezultata ovih preliminarnih istraživanja, usvojili četvrti protokol za izvođenje eksperimenata u ovoj studiji.
4.2.Mjerenje krvnog tlakaSistolički krvni pritisak i broj otkucaja srca mereni su prethodno opisanom metodom repne manžetne (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokio, Japan)[24,25]. Sva mjerenja su obavljena između 9:00 i 14:00. Obavljeno je najmanje 10 mjerenja kod svakog miša, a za analizu je korištena srednja vrijednost.
4.3. PCR analiza kvantitativne reverzne transkripcije u realnom vremenu Ukupna RNK je ekstrahovana iz bubrežnog tkiva korišćenjem ISOGEN-a (Nippon Gene, Tokio, Japan), a komplementarna DNK (cDNK) je sintetizovana korišćenjem SuperScript IⅢFirst-Strand sistema (Invitrogen, Waltham, MA, SAD). Kvantitativna PCR analiza reverzne transkripcije u realnom vremenu izvedena je pomoću CFX96 Touch sistema za detekciju PCR u realnom vremenu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD), a proizvodi reverzne transkripcije su inkubirani sa TaqMan PCR Master Mixom i prilagođenim TaqMan sonda (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD), kao što je prethodno opisano [26]. Korištene su TaqMan sonde protiv sljedećih gena: kolagen I(Mm00801666_g1), kolagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) i Nox2 (Mm00627011_m1). Nivoi mRNA su normalizovani na nivoe 18S ribosomalna RNA.
4.4. Western blot analiza Ekspresija proteina je analizirana Western blot analizom homogenata tkiva koristeći prethodno opisanu metodu [27,28]. Ekstrakti ukupnih proteina pripremljeni su iz tkiva korišćenjem pufera za uzorke koji sadrži natrijum dodecil sulfat. Koncentracija proteina u svakom uzorku je izmjerena korištenjem kompleta za testiranje proteina kompatibilnog s deterdžentom (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD) i NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD), s goveđim serumskim albuminom kao standard. Jednake količine proteinskih ekstrakata iz uzoraka tkiva frakcionisane su na 5-20 posto poliakrilamidnih gelova (ATTO Corp., Tokio, Japan). Odvojeni proteini su zatim prebačeni na poliviniliden difluoridne membrane koristeći Semi-Dry Transfer System (ATTO Corp., Tokio, Japan). Membrane su blokirane 1 h na sobnoj temperaturi fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom koja sadrži 5 posto obranog mlijeka u prahu. Membrane su inkubirane sa primarnim antitelima protiv Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT(sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma , Burlington, MA, SAD), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japan), i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD). Membrane su isprane i inkubirane sa sekundarnim antitelima 60 minuta na sobnoj temperaturi. Lokacije za reakcije antitijelo-antigen vizualizirane su korištenjem supstrata poboljšane hemiluminiscencije (Merck, Kenilworth, NJ, USA). GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. Slike su kvantitativno analizirane pomoću ChemiDoc Touch-a (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD).
4.5. Histološka analiza je izveden kao što je prethodno opisano [29]. Bubrežna tkiva miševa su fiksirana sa 4 procenta paraformaldehida i potom stavljena u parafin. Presjeci (debljine 4 um) su obojeni PAS i MT bojama. Za procjenu glomerularnog područja, 50 glomerula po mišu je izmjereno i prosječno. Sve slike su dobijene pomoću mikroskopa BZ-9000 (Keyence Corp., Osaka, Japan).
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREZNU DIJALIZU
4.6. SA{2}}al bojenje Bubrežna tkiva miševa su brzo zamrznuta i postavljena u spoj s optimalnom temperaturom rezanja (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokio, Japan). Sekcije (debljine 4 μm) su pripremljene korištenjem kriostata (HM550-VPD); Thermo Fisher Scientific) i montira se na staklene dijapozitive. Aktivnost SA- -a mjerena je pomoću kompleta za detekciju starenja (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, SAD) prema protokolima proizvođača. Uzorci su posmatrani pod svijetlim poljem pri uvećanju ×100 korištenjem BZ-9000mikroskopa (Keyence Corp.. 4.7.Elektronska mikroskopijaElektronska mikroskopska analiza je izvršena kao što je prethodno opisano [30]. Miševi su anestezirani izofluranom i perfuzirani kroz desni luk aorte sa hepariniziranom (5 U/mL) fiziološkom otopinom i 2,5 posto glutaraldehida u 0,1 mol/L fosfatnog pufera pri pH 7,4. Uzorci za transmisijsku elektronsku mikroskopiju uronjeni su u 1 posto osmijum tetroksida na 2 h, serijski dehidrirani u etanolu i ugrađeni u smjesu Epon. UlItrathin rezovi su obojeni uranil acetatom i olovnim citratom i pregledani pomoću Hitachi H-7500 transmisionog elektronskog mikroskopa na 80 kV (Hitachi, Ltd., Tokio, Japan). Sekcije su posmatrane pri uvećanju ×5000 i fotografisane pomoću kamere uređaja sa spojenim punjenjem.
4.8.Biohemijska analizaUzorci krvi su uzeti punkcijom srca u nahranjenom stanju. Uzorci pune krvi su centrifugirani na 3000 rpm (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japan) 10 minuta na 4 stepena da bi se odvojila plazma. Dobijeni uzorci plazme su pohranjeni na -80 stepeni. Nivoi kreatinina u plazmi, UN i kreatinina u urinu mjereni su pomoću Hitachi 7180 autoanalizera (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan).
4.9. Statistička analiza Statističke analize su obavljene korišćenjem softvera GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Neupareni Studentov f-test je korišten za poređenje razlika između grupa za kontrolu vozila i AA grupa.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. ZaključciAA administracija uzrokujebubregstarenje, zajedno sa tubulointersticijskom fibrozom i atrofijom bubrega. Rezultati sugeriraju da je fibroza bubrega usko povezana sa starenjem bubrega i da AAN može biti koristan kaobubreg-specifičan model starenja.
