Odgovarajući nivo vježbanja smanjuje crijevnu disbiozu i povećanje valerinske kiseline kako bi se poboljšala neuroplastičnost i kognitivne funkcije nakon operacije kod miševa, dio 3

MATERIJALI I METODE

Eksperimentalne protokole i procedure odobrio je Institucionalni komitet za brigu o životinjama i upotrebu Univerziteta u Virginiji (Charlottesville, VA, SAD; broj protokola: 3114).

Pamćenje je jedna od sposobnosti koje često trebamo koristiti u svakodnevnom životu. Može ljude učiniti pametnijima, osjetljivijima i pogodnijima za karijeru i međuljudske odnose. Stoga mnogi ljudi žele poboljšati svoje pamćenje. Postoji veza između eksperimentalnih protokola i memorije. Istražimo ovo pitanje dalje.

Prvo, eksperimentalni protokoli mogu pomoći ljudima da poboljšaju svoje pamćenje. U eksperimentu ljudi moraju slijediti određene korake kako bi dovršili eksperimentalnu operaciju. Ova aktivnost korak po korak može dovesti ljudski mozak u stanje visoke pažnje i koncentracije, čime se pospješuje izvođenje moždanih funkcija. Istovremeno, morate zapamtiti neke eksperimentalne podatke i eksperimentalne korake tokom eksperimenta, što će također vježbati memorijsku funkciju mozga. Višekratnim vježbanjem na ovaj način, vaše pamćenje će se postepeno poboljšavati.

Drugo, senzorno iskustvo tokom procesa pamćenja je takođe usko povezano sa dizajnom eksperimentalnog plana. U eksperimentima, dizajneri često postavljaju određene specifične zadatke tokom eksperimenta, tako da učesnici moraju da ponove istu operaciju više puta, kao što je pamćenje i pisanje brojeva, pamćenje i prepoznavanje blokova boja, itd. Ovo iskustvo koje se ponavlja može ojačati ljude sposobnosti pažnje i pamćenja, što ljudima olakšava procesiranje ovih informacija u dugoročno pamćenje.

Osim toga, u eksperimentima, korištenje reprezentativnih stimulativnih materijala (kao što su slike, zvukovi, mirisi, itd.) također može dati dobre rezultate. Budući da ovi podražaji mogu pokrenuti moždano uzbuđenje i procese pamćenja, čime se poboljšava sposobnost pamćenja ljudi. U isto vrijeme, ovi stimulansi se također mogu povezati s okolinom i situacijama u životu, čime se smanjuje pojava razdvajanja i čine informacije lakšim za pamćenje i kohezivnijim.

Ukratko, eksperimentalni plan igra ključnu ulogu u poboljšanju ljudskog pamćenja. Provođenjem eksperimenata ljudi mogu vježbati svoje kognitivne sposobnosti, poboljšati nivo pamćenja i istovremeno promovirati funkciju mozga. Stoga bismo trebali nastaviti učiti nove eksperimentalne metode i sudjelovati u više eksperimenata kako bismo poboljšali nivo pamćenja i dali veći doprinos našoj karijeri, odnosima i zdravlju. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola djeluje antioksidativno, protuupalno i protiv starenja, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime se štiti zdravlje nervnog sistema. Osim toga, Cistanche deserticola također može promovirati rast i popravak nervnih ćelija, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronskih mreža. Ovi efekti mogu pomoći u poboljšanju pamćenja, sposobnosti učenja i brzine razmišljanja, a također mogu spriječiti razvoj kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

Kliknite na Znaj kratkoročno pamćenje kako poboljšati

Sve eksperimente na životinjama izveo je vodič Nacionalnog instituta za zdravlje za brigu i upotrebu laboratorijskih životinja (NIH publikacije broj 80–23) revidiran 2011. Izvori ključnih materijala navedeni su u Tabeli ključnih resursa u Dodatnim materijalima.

Životinje i eksperimentalni dizajn

Osmonedeljni mužjaci C57BL/6 J miša težine 19-22 g bili su smešteni u prostoriji koja je održavana u konstantnim uslovima okoline (temperatura 22-24 stepena, ciklus svetlosti/mraka od 12 sati i 50 ± 10% vlažnosti) sa slobodnim pristupom hrani i vodu.

Svima je bilo dozvoljeno da se aklimatiziraju jednu sedmicu prije eksperimenata. Oni su nasumično raspoređeni u sljedeće grupe u prvom eksperimentu: (1) kontrolna grupa (nije bila izložena anesteziji i operaciji), (2) grupa za vježbanje (vježbala se pri 35-40% maksimalnog kapaciteta, ali nije bila izložena anesteziji i operaciji) , (3) kirurška grupa (izloženost lijevoj karotidnoj arteriji 15 min pod anestezijom izofluranom 2 h), i (4) do (6) Exe-l+Sur, Exe-m+Sur i Exe-h+Sur grupe: vježba se na 35 –40%, 55–60% i 75–80% maksimalnog kapaciteta, respektivno, i bili su podvrgnuti anesteziji i operaciji.

Životinje su korištene za učenje i testove pamćenja počevši od 4 dana nakon operacije (n=20) ili im je mozak uzet za biohemijske analize 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h i 7 dana nakon operacije (n=9 ili 14), za imunofluorescentno bojenje 48h i 19 dana nakon operacije (n=6), i za Golgijevo bojenje 19 dana nakon operacije (n=8).

Krv i izmet od miševa prve 4 grupe sakupljeni su za mjerenje SCFA 7 dana nakon operacije (n=7) i za 16 S analize 3 i 7 dana nakon operacije (n=8) ili u na kraju 4-sedmičnog protokola vježbanja (n=8) ​​ili u odgovarajuće vrijeme u prve 2 grupe (n=16). Miševi za prikupljanje tkiva bili su različite kohorte miševa koji su korišteni za testove učenja i pamćenja. U drugom eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u (1) Transcontrol+Sur grupu i (2) Trans-exe+Sur grupu.

Miševi u prvoj grupi primali su 500 ul fekalne otopine od kontrolne grupe želučanom gavažom i 600 ul klistirom jednom dnevno tokom 7 uzastopnih dana nakon antibiotske terapije kako bi se eliminirala nativna crijevna mikrobiota kod primatelja. Miševi u drugoj grupi primali su 500 ul fekalne otopine od miševa za vježbanje putem želučane sonde i 600 ul klistirom jednom dnevno 7 uzastopnih dana nakon tretmana antibiotikom. Izmet od primaoca je sakupljen 14 dana nakon fekalne transplantacije za 16 S analizu. Miševi su tada podvrgnuti operaciji.

Učenje i pamćenje su procijenjeni 4 dana nakon operacije (n=15). Mozak je sakupljen za biohemijske studije kao u prvom eksperimentu (n=10). U trećem eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u (1) Transcontrol grupu i (2) Trans-control+Sur grupu. Miševi u obje grupe su primili transplantaciju fecesa kontrolnih miševa. Druga grupa je operisana 14 dana nakon fekalne transplantacije. Hipokampus je sakupljen 2 dana nakon operacije radi mjerenja GDNF (n=10). U četvrtom eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u (1) kontrolnu grupu (naivni miševi koji nisu bili izloženi nijednim eksperimentalnim uslovima opisanim u ovoj studiji), (2) antibiotska grupa koja je primala antibiotike 7 dana i (3) trans-kontrolna grupa koja je primila transplantaciju fecesa kontrolnih miševa.

Učenje i pamćenje su procijenjeni 19 dana nakon završetka fekalne transplantacije (26 dana nakon završetka tretmana antibioticima u grupi antibiotika) (n=12). U petom eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u (1) kontrolnu grupu, (2) Trans-kontrolna grupa koja je primila transplantaciju fecesa od kontrolnih miševa i (3) Trans-kirurška grupa koja je primila ordinacije za transplantaciju od operativnih miševa. 

Transplantacija fekalija izvedena je kako je opisano u drugom eksperimentu. Izmet od primalaca je sakupljen 14 dana nakon fekalne transplantacije za 16 S analizu (n=10). Učenje i pamćenje su procijenjeni 4 dana nakon što je uzorak fekalije uzet (n=17). U šestom eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u (1) operaciju plus normalnu fiziološku grupu koja je primila 200 µl normalne fiziološke otopine (NS) jednom intraperitonealnom injekcijom sedmično 4 sedmice, a zatim operacija, (2) vježba plus normalna fiziološka otopina plus operacija grupa koja je primila 200 µl NS intraperitonealnom injekcijom jednom sedmično tokom 4-tjedne vježbe sa 35-40% maksimalnog kapaciteta i zatim operacijom, (3 ) vježba plus valerinska kiselina plus hirurška grupa koja je primila valerinsku kiselinu (200 mg/kg u 200 µl) intraperitonealnom injekcijom jednom sedmično tokom 4-tjedne vježbe sa 35-40% maksimalnog kapaciteta, a zatim operacijom.

Injekcija je data ujutro prvog dana vježbanja u sedmici. Jedna dodatna injekcija je urađena na dan operacije. Bihejvioralni (n=13) i biohemijski (n=10) ishodi su procijenjeni kao u ovom drugom eksperimentu. U sedmom eksperimentu, 13-nedeljni (težine 23-27 g) mužjak C57BL/ 6 J miševa nasumično je raspoređeno u (1) kontrolnu grupu, (2) NS grupu koja je primala 4 µl NS intracerebroventrikularnim injekcijama jednom dnevno tokom 4 uzastopna dana, i (3) grupu valerinske kiseline koja je primala 4 mg/kg u 4 µl intracerebroventrikularno injekcija jednom dnevno tokom 4 uzastopna dana. Lijevi i desni cerebroventrikul su ubrizgani naizmjeničnim rasporedom. Učenje i pamćenje su procijenjeni 4 dana nakon injekcije (n=15).

U osmom eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u grupu (1) operacija plus dimetil sulfoksid (DMSO) koja je primala DMSO intracerebroventrikularnom injekcijom jednom dnevno tokom 4 uzastopna dana počevši od dana operacije, (2) operaciju plus grupu C3ar antagonista koja je primila antagonist C3ar2901577 ( ) intracerebroventrikularnom injekcijom jednom dnevno tokom 4 dana počevši od dana operacije, (3) grupa vježba plus DMSO plus operacija koja je primala DMSO intracerebroventrikularnom injekcijom jednom dnevno 4 uzastopna dana počevši od dana operacije nakon 4-tjedne vježbe u 35. –40% maksimalnog kapaciteta i(4) vježba plus C3ar agonist plus operacija grupa koja je primila C3aragonist intracerebroventrikularnom injekcijom jednom dnevno tokom 4 uzastopna dana počevši od dana operacije nakon 4-tjedne vježbe pri 35–40% maksimalnog kapaciteta . Testovi ponašanja su započeti nakon 4 dana nakon operacije kao što je gore navedeno (n=15).

U devetom eksperimentu, miševi su nasumično raspoređeni u (1) kontrolnu grupu, (2) operacijsku grupu, (3) operaciju plus GDNF grupu koja je primila GDNF intracerebroventrikularnom injekcijom kada su imali operaciju, i (4) operaciju plus toplinski inaktivirani GDNF grupa koja je primila toplotno inaktivirani GDNF intracerebroventrikularnom injekcijom kada su imali operaciju. Hipokampi su sakupljeni 48 h nakon operacije za ELISA studiju (n=12). Nakon jedne sedmice aklimatizacije, stari miševi (18-mjesečni mužjak C57BL/6 Jmice) težine 30-36 g korišćeni su u tri studije. U prvom eksperimentu, stari miševi su nasumično raspoređeni u (1) kontrolnu grupu, (2) grupu za vježbanje u kojoj su miševi imali 4-tjednu vježbu sa 35-40% maksimalnog kapaciteta, (3) grupu za operaciju i (4) Exe+Sur grupa u kojoj su miševi imali 4-sedmično vježbanje sa 35-40% maksimalnog kapaciteta prije operacije. Životinje su korištene za učenje i testove pamćenja počevši od 4 dana nakon operacije (n=12) ili su im mozgovi sakupljeni za biohemijske analize 48 h nakon operacije (n=10 ili 12), za imunofluorescentno bojenje 48 h i 19 dana nakon operacije (n=6), a za Golgistaining 19 dana nakon operacije (n=8).

Krv i izmet miševa iz 4 grupe su sakupljeni za mjerenje SCFA 7 dana nakon operacije (n=7) i za 16 S analize 3 i 7 dana nakon operacije (n=8) ili na kraju od 4-sedmičnog protokola vježbanja ili u odgovarajuće vrijeme u prve 2 grupe (n=16). Miševi za prikupljanje tkiva bili su različite kohorte koje su korištene za učenje i testove pamćenja. U drugom eksperimentu, stari miševi su nasumično raspoređeni u (1) Trans-Old Control+Sur grupu i (2) Trans-Old Exe+Sur grupu. Ovi miševi su podvrgnuti operaciji 14 dana nakon fekalne transplantacije kako je opisano u drugi eksperiment na mladim odraslim miševima. Učenje i pamćenje su procijenjeni 4 dana nakon operacije (n =10).

U trećem eksperimentu, stari miševi su nasumično raspoređeni u (1) operaciju plus NS grupu; (2) grupa vježba plus NS plus operacija; i (3) vježba plus valerijanska kiselina plus grupa operacija. Ovi miševi su primili kondicioniranje i valerinsku kiselinu kako je opisano u šestom eksperimentu s mladim odraslim miševima. Ishodi ponašanja su testirani počevši od 4 dana nakon operacije (n=11). Gore opisane veličine uzorka (n) predstavljaju broj životinja koje su randomizirane u svaku grupu/stanje. Ovi brojevi životinja bili su zbir najmanje 3 ponavljanja svakog eksperimenta. Životinje su nasumično raspoređene u grupe na osnovu kompjuterski generisanih tabela randomizacije u svakom eksperimentu.

Određivanje maksimalnog kapaciteta vježbanja i vježbanje

Prije operacije, {{0}}sedmični i 18-mjesečni miševi bili su izloženi 4-nedeljnoj aerobnoj vježbi na traci za trčanje nakon određivanja maksimalnog kapaciteta vježbanja pojedinačnih miševa. Ovo određivanje je izvršeno na način sličan onima opisanim prije [47, 48]. Ukratko, miševi su aklimatizovani na traku za trčanje prvog dana sa početnim postavkama šok mreže na 25 V, 0,3 mA i 2 Hz i brzinom i nagibom na nuli tokom 10 min. Brzina trake za trčanje je zatim povećana na 10 cm/s sa nagibom postavljenim na 50 za 10 min. Zatim su brzina i nagib trake za trčanje povećani na 15 cm/pesak 100 za 5 min.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% vremena na mreži; i/ili (3) nedostatak motivacije za ručno podsticanje. Miš je odmah uklonjen iz odgovarajuće trake kada se ispuni jedan ili više kriterijuma. Sljedećeg dana, miševi su trčali na istoj traci za trčanje polovinom prosječne maksimalne brzine (35 cm/s kod mladih miševa ili 30 cm/s kod starih miševa) i 100 nagiba dok ponovo nisu dostigli jedan od kriterija iscrpljenosti i trajanje kontinuirano vježbanje je zabilježeno kao maksimalni kapacitet vježbanja svakog miša. Nakon ova dva protokola, miševi su smješteni odvojeno na 30 minuta kako bi se izbjeglo primjetno agresivno ponašanje nakon vježbe.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3% ukupnog vremena u 3 uzastopna dana bi bilo isključeno.

Grupe koje nisu vježbale u istom skupu eksperimenata kao i grupe za vježbanje stavljane su na pokretnu traku za trčanje dnevno oko 30-40 minuta. Dobili su 10 šokova u trajanju od ukupno 5 s, što je prosječna količina šokova koju su miševi u grupi za vježbanje primili svaki dan, tokom boravka na pokretnoj traci za trčanje. Ako skup eksperimenata nije imao grupu za vježbanje, nijedan miševi u setu eksperimenata nije dobio šokove.

Liječenje antibioticima

Kako bi se olakšala kolonizacija transplantirane mikrobiote, miševima primateljima je davan antibiotski tretman jednom dnevno tokom 7 uzastopnih dana kako bi se eliminirala njihova izvorna crijevna mikrobiota kako smo opisali mi i drugi [11, 36]. Ukratko, nakon pražnjenja sa 10% magnezijum sulfata (200 ul/10 g, dva puta u intervalima od 3 sata) gagavažom prvog dana, miševi C57BL/6 J primali su amoksicilin/klavulansku kiselinu (200 mg/kg), metronidazol ( 200 mg/kg) i cefazolin (2 g/kg) putem želučane sonde andenema (u 300 ul za želučanu gavažu i 400 ul NS za klistir) ujutro jednom dnevno 7 uzastopnih dana i amoksicilin/klavulanska kiselina (20 mg/kg ), metronidazol (20 mg/kg) i cefazolin (300 mg/kg) u 200 ul NS dnevno intraperitonealnom injekcijom istih 7 dana (od 16 do 17 sati). Kako bi se spriječila bakterijska unakrsna kontaminacija, rukovanje mišem i svakodnevnu promjenu kaveza i boca za vodu vršili su tehničari koji su nosili čistu haljinu i rukavice u ventiliranoj kapuljači. Izmet ovih miševa je sakupljen 24 h nakon posljednjeg tretmana za 16 S analize da bi se odredio učinak.

Transplantacija fekalija

Svježe fekalne pelete sakupljene u roku od 30 minuta nakon pražnjenja crijeva od kontrolnog miša, miševa odmah nakon završetka 4-sedmične vježbe, ili miševa 2 do 8 dana nakon operacije razrijeđene su sa 100 mg/ml sterilne fiziološke otopine. Sve fekalne pelete od 7 –10 donora sa svakim eksperimentalnim stanjem pomiješano je i ponovo suspendirano zajedno u fiziološkom rastvoru. Ukratko, fekalna tvar se miješala vorteksom 5 minuta, a zatim je prošla kroz najlonsko ćelijsko cjedilo od 70 μm kako bi se uklonila neprobavljena hrana i čestice. Primalac je primio 500 ul odgovarajuće fekalne otopine gastričnom gavažom ujutro i 600 ul klistirom popodne od 24 sata nakon posljednje doze antibiotika tokom 7 uzastopnih dana. Transplantirani miševi su održavani 2 sedmice nakon fekalne transplantacije prije nego što su podvrgnuti prikupljanju fekalija za 16 S analize i operaciju.

Anestezija i operacija

Operacija je bila izložena karotidnoj arteriji kao što smo opisali prije [6]. Ukratko, miševi su anestezirani sa 2% izoflurana i održavali spontano disanje sa maskom za lice opskrbljenom 100% kisika tokom procedure. Rektalna temperatura je praćena i održavana na 37 stepeni uz pomoć grejnog pokrivača. Rez na sredini vrata 2-cm i disekcija mekog tkiva sa 1-cm dugom ekspozicijom zajedničke arterije izvedeni su bez ikakvog oštećenja vagusnog živca nakon što je miš anesteziran izofluranom u trajanju od najmanje 20 minuta. Rana je zatim irigirana i zatvorena hirurškim šavom 4–0. Hirurška procedura je izvedena u podsterilnim uslovima i trajala je oko 15 minuta kod mladih miševa i 12 minuta kod starih miševa. Ukupno trajanje opće anestezije bilo je 2 sata. Nakon operacije, sve životinje su primile subkutanu injekciju od 3 mg/kgbupivakaina. Nije uočen odgovor na štipanje prstiju tokom anestezije.

Intracerebroventrikularne injekcije

Kao što je gore opisano, neke grupe miševa su primile intracerebroventrikularnu injekciju. Ukratko, ovi miševi su postavljeni u stereotaktički okvir glave u ležećem položaju. Mjesto injekcije je locirano kao: 1.00 mm mediolateralno, −0.3 mm anteroposteriorno od Bregme, i −2,5 mm dorsoventralna dubina. Miševi u operaciji plus GDNF grupa dobili su intracerebroventrikularnu injekciju od 1{{ 20}} ug/kg rekombinantnog mišjeg GDNF-a u 3 ul fosfatnog pufera fiziološke otopine (PBS) kao što je opisano u prethodnim studijama [6, 26], a miševi u grupi GDNF inaktivirani plus toplinom dobili su injekciju toplotno denaturiranog (5 min 1000C) ) GDNF rješenje. Miševi u operaciji plus grupa C3ar antagonista primili su 10 ug/kg SB290157 u 3 ul PBS-a koji sadrži 5% DMSO u 0 h, 24 h, 48 h i 72 h nakon operacije. Miševi u vježbi plus C3ar agonist i kirurška grupa primili su 1 ug/kg C3ar agonista u 3 ul PBS-a koji sadrži 5% DMSO u isto vrijeme kao i za SB290157. Miševi u grupi sa valerinskom kiselinom u šestom eksperimentu primali su 4 mg/kg valerinske kiseline u 4 µl tokom 4 uzastopna dana.

Testiranje ponašanja

Učenje i pamćenje ocjenjivani su prepoznavanjem novih objekata i Barnesovim testom lavirinta. Svi testovi ponašanja su obavljeni u 10:00 am−5:00pm u zvučno izolovanoj prostoriji. Miševi korišteni u testovima učenja i pamćenja nisu korišteni za bilo kakve biohemijske studije kako bi se izbjegli efekti ovih testova.

Test za prepoznavanje novih objekata

Kao što smo mi i drugi opisali ranije [20, 49, 50], miševi su stavljeni u otvorenu komoru na 5 minuta radi navikavanja 4 dana nakon operacije. Test je izveden na sljedeći način. Dva ista predmeta postavljena su pod susjednim uglovima komore na dan učenja. Miševi su stavljeni u komoru leđima okrenuti prema objektima i ostavljeni su da slobodno istražuju komoru 5 minuta. Životinja je eliminirana ako je ukupno vrijeme istraživanja na dva objekta bilo<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Barnes lavirint

Sedam dana nakon operacije, životinje su podvrgnute Barnesovom lavirintu kako bi se testiralo njihovo prostorno učenje i pamćenje kao što smo prethodno opisali [6, 49]. Barnesov lavirint je kružna platforma sa 20 jednako raspoređenih rupa (SDInstruments, San Diego, CA). Jedna od rupa bila je povezana sa mračnom komorom koja se zvala kutija za mete. Test je započeo postavljanjem životinja u sredinu Barnesovog lavirinta. Averzivna buka (85 dB) i jaka svjetlost (200 W) koja je prosuta na platformu korišćeni su da ohrabre miševe da pronađu ovu kutiju. Nakon treninga od 4 dana, njihova referentna memorija je testirana 5. i 12. dana. Nijedan test nije obavljen tokom perioda od 5. do 12. dana. Latencija za ulazak u ciljnu kutiju tokom svakog ispitivanja je zabilježena pomoću ANYMaze sistema za video praćenje (SD Instruments).

For more information:1950477648nn@gmail.com