Očigledno odsustvo BMAL1-zavisnog skeletnog mišića-bubrega unakrsnog govora kod miševa Ⅱ

3. Rezultati

3.1. Verifikacija iMS-BMAL1 KO modela

Thenokaut za mišamodel u ovoj studiji induciran je tamoksifenom; stoga je efikasnost ove injekcije procijenjena za sve miševe. Rekombinacijski PCR za BMAL1 na muškom skeletnom mišićnom tkivu iz iMS-BMAL1 KO dao je dvije trake za potvrdu rekombinacije injekcijom tamoksifena, jednu traku od 431 bp koja predstavlja floksirani alel Bmal1 i traku od 572 bp koja predstavlja proizvod rekombinacije [12] (Slika ). Jedna traka od 431 bp ukazuje na nedostatak rekombinacije kao što se vidi kod miševa tretiranih nosačem. Nokaut je potvrđen kod svih miševa rekombinacijskim PCR-om nakon eutanazije. U ovom modelu miša, BMAL1 bi trebao biti nokautiran samo unutar skeletnih mišića. Ekspresija BMAL1 proteina je procijenjena u sekcijama bubrega kako bi se osiguralo da nema efekta. Analiza imunološki označenog BMAL1 (smeđa mrlja) pokazala je da ekspresija BMAL1 ububreg nije zahvaćenkod iMS-BMAL1 KO miševa (Slika 1B). Smeđe BMAL1 nuklearno bojenje pronađeno je u svim bubrežnim stanicama u obje grupe.

Slika 1. Ekspresija BMAL1 nije promijenjena u bubrezima iMS-BMAL1 KO. (A) Rekombinacioni PCR test u tkivu skeletnih mišića. Prednji i reverzni prajmeri za floksirani alel Bmal1 dali su traku od 431 bp, što je viđeno kod iMS-BMAL1 KO i kontrolnih miševa. Drugi prajmer je detektovao rekombinovani proizvod sa trakom od 572 bp, što je viđeno samo u iMS-BMAL1 KO. ArroWindicates traka pronađena u nokaut miševima. (B) Reprezentativne slike sekcija bubrega koje pokazuju ekspresiju proteina BMAL1 kod kontrolnih i iMS-BMAL1 KO miševa. Na slici je prikazan korteks bubrega. Markeri ukazuju na pozitivne BMAL{14}}obojene ćelije. Linija skale predstavlja 0.05 mm. Miševi prikazani na slici su iz kohorte napredovanja faze. S=standardne lestvice, CL=kontrolni miševi, KO=iMS-BMAL1KO miševi.

3.2. Tečnost i rastvor

Rukovanje u bazalnim uslovima i nakon iscrpljivanja kalijuma Budući da je bubreg toliko otporan na fiziološke poremećaje, posebno kod C57Bl/6 miševa [15], izazvali smo kohortu miševa koji su koristili deprivaciju kalijuma iz hrane. Ranije smo pokazali da BMAL1 muški KO miševi specifični za bubrege pokazuju fenotip koji rukuje natrijem kao odgovor na dijetu bez K [10]. I kontrolni i iMS-BMAL1 KO miševi su izlučili 34% manje natrijuma nakon dijete osiromašene kalijem u odnosu na početnu vrijednost; međutim, nije bilo razlike u izlučivanju natrijuma između dvije grupe iz urina prikupljenog tokom aktivnih ili neaktivnih perioda (Slika 2A, B). Kao što se očekivalo, izlučivanje kalijuma je palo na minimalne nivoe u roku od 24 h nakon iscrpljivanja kalijuma tokom aktivnog i neaktivnog perioda (Slika 2C, D). Nije bilo razlike između kontrolnih i iMS-BMAL1 KO miševa u izlučivanju kalija. Ukupna količina vode u tijelu porasla je za 6% nakon iscrpljivanja kalija u obje grupe (Slika 2E). Dodatno, postojao je trend da iMS-BMAL1 KO miševi imaju više ukupne tjelesne vode od kontrolne kod miševa iMS-BMAL1 KO sa 2-3% višim nivoima od kontrola, iako to nije bilo značajno (p=0.06 ).

Slika 2. Nije bilo razlike u rukovanju natrijem između grupa koje su pratile depleciju kalijuma Izlučivanje natrijuma tokom (A) noću i (B) dnevno od muške kontrolne grupe i iMS-BMAL1 KOMice liječenih normalnom i petodnevnom ishranom sa osiromašenim kalijem. Izlučivanje kalijuma tokom (C) noću i (D) dana kod istih miševa. Sakupljanje urina vršeno je svakih 12 h(E). Ukupna tjelesna voda je normalizirana na tjelesnu težinu miševa prije i nakon petodnevnog tretmana dijetom sa osiromašenim kalijem. (F) Statistička analiza za svaki panel na slici 2. n=4-5. Vrijednosti su srednje vrijednosti + SEM. Dvosmjerna ANOVA je korištena za poređenje grupa. Sidakov test višestrukih poređenja korišten je za poređenje između kontrolne i KO unutar tretiranih grupa. *=p < 0.05, **=p < 0,001UNaV=izlučivanje natrijuma u urinu; UKV{18}} izlučivanje kalija u urinu; Normalna=normalna prehrana; LowK= dan dijetetskog tretmana sa osiromašenim kalijem.

3.3. Procjena mitohondrijske funkcije

Ranije je metabolička neefikasnost bila povezana sa brisanjem BMAL1 [7,12,16,17. Da bismo utvrdili da li je efekat nokauta BMAL1 skeletnih mišića utjecao na bubrežne mitohondrije, prvo smo procijenili ekspresiju mitohondrijalnog odspojnog proteina 1 (UCP1) u bubrežnom korteksu iMS-BMAL1 KO miševa u poređenju sa kontrolom. Ekspresija bazalnog kortikalnog UCP1 proteina bubrega imala je tendenciju da bude veća kod miševa iMS-BMAL1 KO u poređenju sa kontrolama, ali nije dostigla značajnost (Slika 3A, B; p=0.058). Zbog suptilnih razlika u kortikalnom UCP1, rigorozniji pristup za procjenu učinka iMS-BMAL1 KO na bubrežnu mitohondrijalnu funkciju proveden je izvođenjem respirometrijskih testova visoke rezolucije na izolovanim mitohondrijama izkortikalne regije bubrega. Respiratorna funkcija kortikalne mitohondrije bubrega u bilo kojem izmjerenom respiratornom stanju (L, PCI, PCI+II, ECI+II, ECII, ECIV) kao i omjeri kontrole fluksa bili su slični između grupa (Slika 3C, D). Odnos respiratorne kontrole, indikator spregnutog disanja (PCI/L), u prosjeku je bio 3,4 i 3,3 za kontrolne miševe i iMS-BMAL1 KO, respektivno. Rezervni (ili rezervni) kapacitet, razlika između maksimalnog OXPHOS (PCI+II) i maksimalnog ETS kapaciteta (ECI+II), bila je 22% i 19% ECI+II za kontrolne i iMS-BMAL1 KO miševe, respektivno, i nije ne razlikuju se bitno.

3.4. Inflamatorni markeri u bubrezima

Ranije je dokazano da skeletni mišići uzrokuju povećanje upale u bubrezima oslobađanjem metaboličkog otpada. Paneli markera upale i ozljede mjereni su u korteksu bubrega i meduli iMS-BMAL1 KO i kontrolnih miševa. Nivoi kortikalnog interleukina (lL) 6 bili su preko 7 puta veći kod iMS-BMAL1 KO miševa u poređenju sa kontrolama (Tabela 1). Slično, postojao je trend da nivoi IL-6 budu viši u medularnom tkivu iMS-BMAL1 KO miševa u odnosu na kontrole, ali to nije dostiglo značajnost (p= 0.07). Nivoi inhibitora metaloproteinaze 1 (TlMP-1) u medularnom tkivu su također bili viši kod iMS-BMAL1 KO miševa, skoro 2 puta više od kontrolnih (Tabela 1). Nije bilo razlike u nivoima faktora rasta fibroblasta 23, IL-10, renina ili molekula oštećenja bubrega u kortikalnom ili medularnom tkivu kod iMS-BMAL1 KO u odnosu na kontrolnih miševa. Osim toga, nije pronađena razlika u nivoima kortikalnog IL-5, IL-17 ili TIMP-1 između dvije grupe (Tabela 1).

3.5. Povreda i funkcija bubrega

Cirkadijalni stres ponašanja, kao što je jet lag, dovodi do štetnih efekata na sveukupno zdravlje [18,19]. Budući da se činilo da nedostatak kalija u ishrani nije različito utjecao na iMS-BMAL1 KO miševe u smislu funkcije izlučivanja bubrega, pretpostavili smo da bi poremećaj u ponašanju mogao promijeniti funkciju bubrega kod iMS-BMAL1 KO u usporedbi s kontrolnim miševima. Napredovanje faze je uobičajena metoda za izazivanje cirkadijalnog poremećaja [20,21]. Miševi su prošli 2-sedmičnu, 14-h fazu unapred protokola kako bi se pomaknuli vremenski periodi noć/dan. GFR je bio sličan između iMS-BMAL1 KO i kontrolnih miševa prije i nakon napredovanja faze (Slika 4A). Uočena je minimalna tubularna povreda kod iMS-BMAL1 KO miševa i kontrola nakon histološke procene preseka bubrega sakupljenih nakon napredovanja faze (Slika 4B).

3.6. Ekstrarenalni efekti iMS-BMAL1 KO

S obzirom na nedostatak fenotipa u bubrezima iMS-BMAL1 KO miševa, testirali smo pluća kako bismo utvrdili da li gubitak BMAL1 specifičan za skeletni mišić negativno utječe na drugo tkivo. Pluća su sakupljena od miševa slijedeći protokol za napredovanje faze za protočnu citometriju za procjenu inflamatornih markera [14]. Otkrili smo da je profil uklapanja imunomodulatornih monocitnih i neutrofilnih supresorskih ćelija izvedenih iz koštane srži (Mo-MDSC i PMN-MDSC) povećana u plućima iMS-BMAL1 KO miševa u odnosu na kontrolu (Slika 5. ). Ovi nalazi ukazuju na potencijalno reprogramiranje populacije imunoloških ćelija s poremećajem BMAL1 signalizacije u skeletnim mišićima.

Slika 4. Poremećaj sata u skeletnim mišićima ne utječe na funkciju bubrega niti uzrokuje ozljedu tubula. (A) Brzina glomerularne filtracije izmjerena preko potkožnog monitora prije i nakon napredovanja faze kod kontrolnih i iMS-BMAL1 KO miševa. n=5. (B) Reprezentativne slike preseka bubrega obojenih hematoksilinom i eozinom kontrolnih i iMS-BMAL1 KO miševa nakon napredovanja faze. Prikazana je kortikalna regija. Skalirana traka predstavlja 0.05 mm. (C) Procenat tubula koji pokazuju znakove povrede uočeni u obojenim presecima bubrega kod obe grupe miševa. n=4–5. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Dvosmjerna ANOVA je korištena za poređenje podataka o brzini glomerularne filtracije grupa. Studentov t-test je korišten za poređenje grupa iz podataka o procjeni ozljeda tubulara. GFR=brzina glomerularne filtracije; NS=nije značajan

srednja vrijednost ± SEM. Za poređenje između grupa korišten je Studentov t-test. Mo-MDSC=monocitne mijeloidne supresorske ćelije; PMN-MDSC=polimorfonuklearni

4. Diskusija

Glavni nalaz iz ove studije je da delecija BMAL1 u skeletnim mišićima nije doprinijela promjenama u funkciji bubrega ili dovela do vidljive povrede bubrega u testiranim uvjetima. Postoje različiti načini na koje skeletni mišići mogu negativno utjecati na funkciju bubrega, uključujući oslobađanje metaboličkog otpada i doprinos insulinskoj rezistenciji [22,23]. Nadalje, poremećaj sata u skeletnim mišićima proizvodi fenotip starenja kod miševa (još jedna karakteristika razvoja bolesti bubrega) [6,16]. Unatoč tome što su miševi iMS-BMAL1 KO pokazivali karakteristike starenja i znakove pojačane upale bubrega, nije otkriveno oštećenje bubrega ili smanjenje bubrežne funkcije.

Patološke promjene bubrega uzrokovane starenjem uključuju razvoj glomeruloskula. roza, intersticijska fibroza i gubitak tubula [24,. Ove progresije u ozljedi bubrega dovode do pada GFR i disfunkcije u rukovanju otopljenim tvarima i vodom. U ovoj studiji, GFR i rukovanje rastvorom su procenjeni da bi se odredila funkcija bubrega. Miševi su bili izazvani (1) promjenom kalijuma u ishrani kako bi se promijenilo rukovanje otopljenim tvarima ili (2) promjenom noćnog/dnevnog rasporeda kako bi se otkrile potencijalne abnormalnosti u funkciji bubrega. Studije na miševima i ljudima dosljedno pokazuju da nedostatak kalija u ishrani dovodi do povećanja zadržavanja natrijuma [25-28]. Obje grupe miševa u ovoj studiji pokazale su zadržavanje natrijuma nakon dijete osiromašene kalijem, kao što se i očekivalo, ali nije bilo razlike u rukovanju otopljenim tvarima između grupa prije ili nakon dijetetske manipulacije. GFR je također bio sličan između grupa prije i poslije faze napredovanja. Nismo uočili nikakve znakove oštećenja bubrega, nije zabilježena razlika u hranjenju ili aktivnosti između ovih grupa miševa iz prethodnih studija [7,12]. Sve u svemu, nije bilo promjena bubrežne funkcije sličnih onim što se vidi kod fenotipa starije dobi.

Postoji velika količina mitohondrija upovezan sa bubrezimasa velikom potrošnjom kiseonika, što je drugo posle srca [29]. Opskrba ATP-om je izuzetno važna za bubrežnu funkciju, a oštećenje mitohondrija je povezano s progresijom bolesti bubrega [22,30]. Na osnovu prethodnih izvještaja o metaboličkoj neefikasnosti kod miševa specifičnih za skeletne mišiće i globalnih BMAL1-KO miševa [7,12,16,17], procijenili smo mitohondrijalnu funkciju bubrega. Odsustvo BMAL1 u skeletnim mišićima i povezane promjene na ovom mišjem modelu nisu utjecale na respiratornu funkciju mitohondrija u bubrezima.

Homeostaza elektrolita je pod velikim uticajemradnje skeletnih mišića, posebno kao odgovor na nedostatak kalija [31]. Potencijalna uloga BMAL1 skeletnih mišića u intracelularnom pomaku ravnoteže kalija kao odgovor na nedostatak kalija ovdje nije procijenjena. Ova studija se fokusirala na bubrege, koji su konačni regulator ravnoteže elektrolita. Zanimljivo je da su iMS-BMAL1 KO miševi pokazali niže izlučivanje kalija tokom faze odmora pod normalnom ishranom u poređenju sa kontrolnim miševima. Treba napomenuti da nije uočena razlika tokom aktivne faze, kada se odvija većina izlučivanja. Dodatno, kada se kombinuju podaci aktivne i neaktivne faze, nema razlike u 24-satnom izlučivanju. Ograničenje ove studije je to što nismo bili u mogućnosti da procijenimo kalij u serumu na kraju studije smanjenja kalija u ishrani. Ovo je važan parametar koji treba uzeti u obzir prilikom procjene unakrsnog razgovora između skeletnih mišića i bubrega.

Miševi iMS-BMAL1 KO su pokazali mnoge karakteristike nezdravog i ostarjelog fenotipa, uključujući izmijenjen hod, smanjenu pokretljivost, slabost mišića i poremećeno uzimanje glukoze [6,7,12,16]. Pokazatelji negativnog uticaja delecije BMAL1 u skeletnim mišićima na druge organe su bili očigledni. Ova studija je ispitivala uticaj na bubrege. Iako su povišeni nivoi TIMP-1 i IL-6 povezani sa razvojembolest bubrega[32,33], podaci u ovoj studiji ukazuju da funkcija bubrega nije pogođena uprkos značajnom povećanju ovih markera. Kao što je pokazano povećanjem infiltracije monocita i neutrofila u plućnom tkivu kod iMS-BMAL1 KO miševa, dodatni organi uključujući pluća mogu pokazati izmijenjenu funkciju.

Dokazano je da primjena tamoksifena uzrokuje neželjene nuspojave. Pokazalo se da tamoksifen izaziva razvoj kile kod mužjaka miševa [34]. S druge strane, tamoksifen je pokazao antifibrotične karakteristike u abolest bubregamodel [35]. U ovoj studiji, liječenje niskim dozama tamoksifena bilo je potrebno samo pet dana da bi se dovoljno izazvalo izbacivanje BMAL1 iz skeletnih mišića. Miševi nisu dugo držani tamoksifenom. Osim toga, eksperimenti nisu provedeni na miševima do pet sedmica nakon tretmana tamoksifenom. Malo je vjerovatno da je tamoksifen utjecao na rezultate ove studije.

5. Zaključci

U zaključku, mužjaci miševa s delecijom BMAL1 skeletnih mišića nisu pokazali promijenjenu funkciju bubrega ilipovreda bubregapod testiranim uslovima. Nalaz upale u plućima ukazuje na to da poremećaji sata u skeletnim mišićima mogu biti zahvaćeni izvanbubrežnim organima, neovisno o promjenama u bubrezima. Sve u svemu, bubreg pokazuje otpornost na fenotip starenja koji pokazuju iMS-BMAL1 KO miševi.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, GRC, SEW, AJB, KAE i MLG; Kuriranje podataka, SEW, CAW, MAG-M., CMD, EE, K.-YC, SHM i DB; Formalna analiza, GRC, CMD, EE, K.-YC, SHM, DB, AJB, KAE i MLG; Pribavljanje sredstava, KAE i MLG; Istraga, GRC; Metodologija, GRC, CAW, AJB i MLG; Administracija projekta, MLU; Resursi, MLG; Pisanje-originalni nacrt, GRC, KAE i MLG; Pisanje-recenzija i uređivanje, GRC, SEW, CAW, MAG-M., CMD, EE, K.-YC, AJB, KAE i MLG Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

Reference

1. Yoo, SH; Yamazaki, S.; Lowrey, PL; Shimomura, K.; Ko, CH; Buhr, ED; Siepka, SM; Hong, HK; Oh, WJ; Yoo, OJ; et al. Period 2: Izvještavanje o cirkadijalnoj dinamici u realnom vremenu Luciferaze otkriva uporne cirkadijalne oscilacije u perifernim tkivima miša. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2004, 101, 5339–5346. [CrossRef] [PubMed]

2. Partch, CL; Green, CB; Takahashi, JS Molekularna arhitektura cirkadijalnog sata sisara. Trends Cell Biol. 2014, 24, 90–99. [CrossRef] [PubMed]

3. Gumz, ML Molekularne osnove cirkadijalne ritmičnosti u fiziologiji i patofiziologiji bubrega. Exp. Physiol. 2016, 101, 1025–1029. [CrossRef]

4. Richards, J.; Gumz, ML Mehanizam cirkadijalnog sata u fiziologiji. Am. J. Physiol. Regular. Integr. Comp. Physiol. 2013, 304, R1053–R1064. [CrossRef] [PubMed]

5. Egstrand, S.; Mace, ML; Olgaard, K.; Lewin, E. Vaskularni cirkadijalni sat kod hronične bolesti bubrega. Cells 2021, 10, 1769. [CrossRef] [PubMed]

6. Schroder, EA; Harfmann, BD; Zhang, X.; Srikuea, R.; Engleska, JH; Hodge, BA; Wen, Y.; Riley, LA; Yu, Q.; Christie, A.; et al. Unutrašnji mišićni sat je neophodan za zdravlje mišićno-koštanog sistema. J. Physiol. 2015, 593, 5387–5404. [CrossRef]

7. Harfmann, BD; Schroder, EA; Kachman, MT; Hodge, BA; Zhang, X.; Esser, KA Gubitak bmal1 specifičan za mišiće dovodi do poremećenog metabolizma glukoze u tkivu i sistemske homeostaze glukoze. Skelet. Muscle 2016, 6, 12. [CrossRef]

8. O'Sullivan, ED; Hughes, J.; Ferenbach, DA Starenje bubrega: uzroci i posljedice. J. Am. Soc. Nefrol. 2017, 28, 407–420. [CrossRef]

9. Xie, Z.; Su, W.; Liu, S.; Zhao, G.; Esser, K.; Schroder, EA; Lefta, M.; Stauss, HM; Guo, Z.; Gong, MC Glatki mišić bmal1 učestvuje u regulaciji cirkadijalnog ritma krvnog pritiska. J. Clin. Investig. 2015, 125, 324–336. [CrossRef] 10. Crislip, GR; Douma, LG; Masten, SH; Cheng, KY; Lynch, IJ; Johnston, JG; Barral, D.; Glasford, KB; Holzworth, MR; Verlander, JW; et al. Razlike u bubrežnom doprinosu bmal1 na. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F1463–F1477. [CrossRef]

11. Morla, L.; Shore, O.; Lynch, IJ; Merritt, ME; Wingo, CS Neinvazivna metoda za proučavanje evolucije volumena ekstracelularne tečnosti kod miševa koristeći nuklearnu magnetnu rezonancu u vremenskom domenu. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 319, F115–F124. [CrossRef] [PubMed]

12. Hodge, BA; Wen, Y.; Riley, LA; Zhang, X.; Engleska, JH; Harfmann, BD; Schroder, EA; Esser, KA Endogeni molekularni sat orkestrira vremensko odvajanje metabolizma supstrata u skeletnim mišićima. Skelet. Muscle 2015, 5, 17. [CrossRef] [PubMed]

13. Harrison, DK; Fasching, M.; Fontana-Ayoub, M.; Gnaiger, E. Redox stanja citokroma i respiratorna kontrola u mitohondrijama srca miša i goveđeg mesa u stabilnom stanju hipoksije. J. Appl. Physiol. (1985) 2015, 119, 1210–1218. [CrossRef] [PubMed]

14. Oliveira, AC; Fu, C.; Lu, Y.; Williams, MA; Pi, L.; Brantly, ML; Ventetuolo, CE; Raizada, MK; Merad, B.; Scott, EW; et al. Hemokinska signalna osovina između endotelnih i mijeloidnih stanica regulira razvoj plućne hipertenzije povezane s plućnom fibrozom i hipoksijom. Am. J. Physiol. Mol ćelija pluća. Physiol. 2019, 317, L434–L444. [CrossRef]

15. Rabe, M.; Schaefer, F. Netransgeni mišji modeli bolesti bubrega. Nefron 2016, 133, 53–61. [CrossRef]