Antioksidativni, protuupalni i anti-aging potencijal ekstrakta Kalmia Angustifolia i identifikacija nekih glavnih spojeva 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Starenje kože je najvidljiviji element procesa starenja, što izaziva veliku zabrinutost kod mnogih ljudi. Biljke iz porodice Ericaceae općenito imaju antioksidativna i protuupalna svojstva, što ih čini potencijalnim aktivnim sastojcima protiv starenja. Ova studija imala je za cilj procijeniti sigurnost i djelotvornost protiv starenja ekstrakta Kalmia angustifolia koristeći rekonstruirane zamjene za kožu. Procjena sigurnosti je obavljena pomoću 3-(4,5-dimetil tiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolijum bromida (MTT) testa, dok je efikasnost bila utvrđuje se procjenom antioksidativnog i antiinflamatornog djelovanja i analizom kožnih nadomjestaka rekonstruiranih po metodi samomontaže histološkim i imunofluorescentnim bojenjem (elastin, kolagen-1, kolagen-3, akvaporin-3) . Test vitalnosti ćelija utvrdio je sigurnost ekstrakta pri koncentraciji do 200 ug/mL. Test kapaciteta apsorpcije radikala kisika (ORAC) i test baziran na ćelijama korištenjem 2',7'-diklorofluorescein-diacetata (DCFH-DA) otkrili su jaku antioksidativnu aktivnost s ORAC vrijednošću od 16 μmol Trolox ekvivalenta/mg i pola-mg maksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) od 0,37±0,02 ug/mL, dok je zanimljiva antiinflamatorna aktivnost pronađena u inhibiciji proizvodnje NO, sa procentom inhibicije proizvodnje NO od 49±2 procenta pri 80 ug/mL. Izolacija i karakterizacija ekstrakta omogućila je identifikaciju jedinjenja koja bi mogla biti odgovorna za ove biološke aktivnosti, a dva su prvi put identifikovana u K.cistanche stemAngustifolia: avicularia i epicatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epicatechin. Histološke analize kožnih nadomjestaka tretiranih ekstraktom su pokazale povećanje debljine kože u odnosu na kontrolne skupine. Ekstrakt K. Angustifolia pojačao je ekspresiju elastina i kolagena-1, koji se obično smanjuju starenjem kože. Ovi rezultati sugeriraju da K. Angustifolia ima obećavajuću antioksidativnu efikasnost i potencijal protiv starenja.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Ključne riječi: zamjene za kožu; starenje kože; prirodni proizvodi; aktivni sastojci; Sheep Laurel; antioksidativna aktivnost; protuupalno djelovanje; tkivno inženjerstvo

1. Uvod

Starenje kože je prirodan fiziološki proces koji brine mnoge ljude. To je prvi "vidljivi znak starenja i degeneracije kože. Tako je formulacija anti-aging: kozmetičkih proizvoda dobila na značaju u posljednjih nekoliko godina zbog želje da se ograniči ova pojava starenja. Starenje kože karakterizira višestruke promjene na biološkoj razini, koje uključuju smanjenje proliferacije stanica, što rezultira epidermalnom atrofijom, i smanjenjem dermalnih komponenti kao što su fibroblasti i elastinska i kolagenska vlakna, a time i smanjenje debljine derme kod starijih osoba [1,2] Borealna šuma je puna neistraženih resursa sa velikim potencijalom za razvoj kozmetičkih aktivnih sastojaka.Kalmia angustifolia, poznata i kao ovčji lovor, je biljka kritosjemenjača iz porodice Ericaceae.prednosti i nuspojave cistanche tubulosaOva biljka je porijeklom iz istočne Sjeverne Amerike, ali se uglavnom nalazi u kanadskim borealnim šumama [3]. U tradicionalnoj indijanskoj medicini, K. Angustifolia se koristila za liječenje različitih zdravstvenih problema koji uključuju upale, kao što su bolovi u trbuhu, uganuća i otekline, što sugerira da ova biljka ima protuupalna svojstva [4]. Razne biljke iz porodice Ericaceae posjeduju i protuupalna i antioksidativna svojstva, što ih čini zanimljivim kozmetičkim aktivnim sastojcima. Hemijski sastav K.angustifolia još nije dobro dokumentovan. Neka istraživanja su identifikovala toksična jedinjenja, kao što su grajanotoksini, koji su neurotoksini otrovni za ljude kada se progutaju, ali retko fatalni, i arbutin (4-hidroksifenil-D-glukopiranozid), inhibitor tirozinaze koji se nalazi u listovima K. Angustifolia i koristi se kao sredstvo za depigmentaciju [5-8]. Uprkos ovim potencijalno toksičnim jedinjenjima pronađenim u K. Angustifolia, druga istraživanja su takođe utvrdila da se flavonoidi, fenolne kiseline, tanini i terpeni mogu naći u izobilju u biljci [9-15]. Neka od ovih jedinjenja imaju zanimljive biološke aktivnosti i stoga mogu dati K. Angustifolia obećavajući efekat protiv starenja, kao i za druge biljke.

Cistanche može protiv starenja

Čak i ako postoji potreba za razvojem novih dermokozmetičkih proizvoda koji pomažu u sprječavanju starenja kože, novi zakoni koji zabranjuju ili ograničavaju testiranje na životinjama u kozmetičkoj industriji otežavaju to. Stoga su potrebne druge opcije za testiranje efikasnosti proizvoda. Upotreba in vitro ćelijskih kultura, ili zamjene za kožu, dobra je alternativa za skrining kozmetičkih sastojaka. Nekoliko modela je odobreno od strane Evropskog centra za validaciju alternativnih metoda (ECVAM, Ispra, Italija) i komercijalno se prodaju kozmetičkim kompanijama, kako bi provele bezbednosne testove i izbegle nepotrebne patnje koje dolaze od upotrebe životinja [16,17] . Međutim, većina komercijalno dostupnih modela predstavlja samo diferencirani epidermis i nedostaje interakcija između keratinocita i fibroblasta [16]. Novi modeli pune debljine pojavili su se u posljednjih nekoliko godina i omogućili su, između ostalog, istraživanje puteva starenja i spojeva protiv starenja, što ih čini korisnim alatima za zamjenu upotrebe životinja u kozmetičkom polju [18,19].ekstrakt cistanche tubulosaCilj ovog istraživanja bio je prvo procijeniti biološku aktivnost ekstrakta K. Angustifolia na monoslojevima kultiviranih stanica, a zatim procijeniti potencijal ovog ekstrakta protiv starenja upotrebom nadomjestaka za kožu rekonstruiranih prema metodi samosastavljanja [20,21] . Snaga ovog modela zamjene za kožu je u tome što ne sadrži egzogene materijale i oslanja se na sposobnost askorbinske kiseline da promovira proizvodnju ekstracelularnog matriksa od strane dermalnih fibroblasta, što model čini potpuno ljudskim.cistanche tubulosa recenzijeOva studija predstavlja novi aktivni sastojak koji bi se mogao koristiti u dermokozmetičkim proizvodima i predlaže korištenje in vitro modela kao alternative u kozmetičkim istraživanjima.

2. Materijali i metode

2.1. Biljni materijal i priprema ekstrakta

K.angustifolia je ubrana 2015. maja u regiji Lac-St-Jean u Kvebeku, Kanada. Biljku je identifikovao M. Patrick Nadeau, a uzorak vaučera (br. QFA0617265) deponovan je u herbarijum Louis Marie Univerziteta Laval, Ouébec, Kanada. Vazdušni dijelovi K.angustifolia (2,1 kg) su mljeveni pomoću Fritsch Pulverisette 25 Cutting Mill (Fritsch, Laval, QC, Kanada) i ekstrahovani su pod refluksom sa bezvodnim etanolom (1,5L, tri puta) i EtOH-H2O3:1( 1,5 L, dva puta). Ekstrakti dobijeni nakon prvih ekstrakcija (u EtOH i EtOH-H, O) su filtrirani i spojeni. Nakon uparavanja EtOH u vakuumu, vodena faza je podijeljena sa dihlorometanom (DCM, CHCl; 300 mL, pet puta) i etil acetatom (EtOAc; 300 mL, pet puta). EtOAc faza je uparena pod sniženim pritiskom do suva da bi se dobio ekstrakt K.angustifolia (222,6 g, 10,6 procenata). Dan prije tretmana, ekstrakt, u obliku praha, otopljen je u dimetil sulfoksidu (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Kanada) da bi se dobio osnovni rastvor, a zatim je čuvan na -20 stepeni dok nije bio potreban. Željene koncentracije K.angustifolia dobijene su razrjeđivanjem matične otopine (12,5 ili 25 mg/mL) direktno u mediju kulture na dan eksperimenta. Konačna koncentracija DMSO bila je 0,2 posto (ofo) kako bi se izbjegla toksičnost rastvarača.

2.2. Izolacija glavnih spojeva ekstrakta K. Angustifolia

Od prethodno opisanog EtOAc ekstrakta, 30 g je odvojeno hromatografijom preko Diaioncolumn (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA), koristeći MeOH/H2O kao eluent u uslovima gradijenta (40%) , 50 posto, 60 posto, 70 posto i 100 posto), da bi se dobile četiri obogaćene frakcije (AD). Frakcija B (2 g) je podvrgnuta koloni silika gela (200 g) i eluirana sa gradijentom MeOH-DCM od 5 posto do 15 posto da bi se dobile četiri frakcije (B1-B4). Frakcija C (6 g) je takođe podvrgnuta koloni silika gela (300 g) i eluirana sa gradijentom MeOH-DCM od 5 procenata do 25 procenata da bi se dobilo sedam frakcija (C1-C7). Frakcija C3 (500 mg) je pročišćena hromatografijom reverzne faze na koloni C18 (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Kanada) upotrebom 0,1 posto mravlje kiseline u H, O-MeOH iz 40 posto do 60 posto. Dobijene su četiri podfrakcije: C3A-C3D, sa C3B, i C3C visoke čistoće, koja sadrži glavna jedinjenja. Frakcija C4(2g) je također pročišćena hromatografijom reverzne faze na koloni C18 upotrebom 0,1 posto mravlje kiseline u H2O-MeOH od 30 posto do 45 posto. Odvajanjem su dobijene tri podfrakcije: C4A-C4C, sa C4A i C4C visoke čistoće, od kojih svaka sadrži jedno jedinjenje. Frakcija D (8,7 g) je podvrgnuta kolonama silika gela (2×200 g) i eluirana sa gradijentom CHCl3-MeOH (15:1;10:1;5:1) da bi se dobilo osam frakcija (D 1-D8). Svaka frakcija D1 do D4 predstavljala je glavno jedinjenje.

2.3. NMR i GC-MS analiza

Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) snimljeni su spektrometrom Bruker Avance 400 (Bruker, Milton, ON, Kanada) na 400 MHz za jezgra'H i 100 MHz za jezgra 13C, koristeći deuterirani hloroform (CDCl3) ili deuterirani metan CH3OD kao rastvarač. Hemijski pomaci su prijavljeni u ppm u odnosu na rezidualni vrh rastvarača. Masena spektrometrija visoke rezolucije (HRMS) snimljena je na Agilent 6224 MS-TOF masenom spektrometru (Agilent, Saint-Laurent, QC, Kanada) opremljenom izvorom za elektrosprej.

2.4.Biopsije i ekstrakcija ćelija

Primarni keratinociti i fibroblasti su dobijeni biopsijama operacija smanjenja grudi. Donori su bile bijele rase u dobi od 18 do 52 godine. Keratinociti i fibroblasti su ekstrahovani iz biopsija koristeći prethodno opisanu metodu izolacije [22,23]. Biopsije su inkubirane u termolizinu na 4 stepena tokom 16 sati kako bi se odvojila epiderma od dermisa. Nakon toga, keratinociti su izolovani iz epiderme upotrebom tripsina u trajanju od 30 minuta, dok su fibroblasti izolovani iz dermisa korišćenjem kolagenaze tokom 4 sata. Ćelije su potom kultivisane do željenog prolaza. Keratinociti su korišteni na prolazu 1, a fibroblasti na prolazu 4.

2.5. Cell Culture

Primarni fibroblasti (prolaz 4) su zasijani pri 4× 103 ćelije/cm² i kultivisani u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (DMEM) dopunjenom sa 10 posto FB Essence seruma (FBI; Seradigm, Salt Lake City , UT, SAD), 100 UI/ml penicilina G (Sigma, Oakville, ON, Kanada) i 25 ug/ml gentamicina (Blizanci, Zapadni Sakramento, Kalifornija, SAD). Primarni keratinociti (prolaz 1) su zasijani pri 4×103 ćelije/cm² na hranidbenom sloju ozračenih 3T3 mišjih fibroblasta i kultivisani u kombinaciji DMEM-a sa Hamovim F12 u omjeru 3:1 (DMEMH), dopunjenim sa 5 posto Clone Ⅱ serum (Hyclone, Scarborough, ON, Kanada）, 5 ug/mL insulina (Sigma, St. Louis, MO, SAD)), 0,4 ug/mL hidrokortizon (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Kanada), 0,212 ug /mL izoproterenol hidrohlorid (Sandoz Kanada, Boucherville, QC, Kanada), 10 ng/mL humani epidermalni faktor rasta (EGF; Austral Biological, San Ramon, Kalifornija, SAD), 100UI/mL penicilin G (Sigma, Oakville, ON, Kanada ) i 25 ug/mL gentamicina (Blizanci, Zapadni Sakramento, Kalifornija, SAD). Ćelijske kulture su inkubirane na 37°C u atmosferi sa 8% ugljen-dioksida (CO2). Podloge za ćelijsku kulturu mijenjale su se svaka dva dana, ukupno tri puta sedmično.

2.6. Cytotoxicity Assay

Toksičnost ekstrakta K.angustifolia procijenjena je na primarnim keratinocitima korištenjem {{0}}(4,5-dimetil tiazolil-2)-2,{{5} }difeniltetrazolijum bromid (MTT) test. MTT test je kolorimetrijski test zasnovan na enzimskoj redukciji žute tetrazolijeve soli (MTT) u ljubičaste kristale formazana. Ovu enzimsku reakciju katalizira mitohondrijalna sukcinat dehidrogenaza u metabolički aktivnim stanicama. Stoga se koristi za procjenu vitalnosti ćelije na osnovu ćelijske metaboličke aktivnosti. Ukratko, dana 0, keratinociti na P3 od zdravih donora su postavljeni na 5×103 ćelija/jažici u ploču 96-jažice na dovodnom sloju ozračenih 3T3 mišjih fibroblasta. Drugi dan je dodan tretman. Dana 4, MTT boja (Tiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) je dodana na ploču u koncentraciji od 0,5 mg/mL u sterilnom fosfatnom puferu (PBS)1X. Ploča je zatim inkubirana 3 h (37 stepeni, 8 posto CO) i formazan je ekstrahovan svježim rastvorom izopropanola i hlorovodonične kiseline (HCl). Apsorbanca je očitana na 570 nm pomoću čitača mikroploča (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, Kalifornija, SAD). 2.7. Analiza kapaciteta apsorpcije radikala kisika (ORAC).

Da bi se procijenila antioksidativna svojstva ekstrakta K.angustifolia, proveden je test kapaciteta apsorpcije radikala kisika (ORAC) kako su opisali Ou et al. uz neke modifikacije [24]. Ukratko, analiza je izvedena u 384-ploči sa jažicom na Fluoroskan Ascent FLTM čitaču ploča (Labsystems, Milford, MA, SAD). Različite koncentracije Troloxa (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametil kroman-2-karboksilna kiselina; analog vitamina E) su pripremljene da se napravi standardna kriva kako bi se da se uporede testni uzorci sa ovom pozitivnom kontrolom. Eksperiment je izveden na temperaturi od 37,5 stepeni i po 7,4 sa paralelnim slijepim uzorkom.cistanche UKFluorescencija fluoresceina je bilježena svakih 60 s fluorometrom nakon dodavanja 2,2'-azobis(2-amidino-propan) dihidroklorida. Fluorescencija je mjerena na talasnoj dužini ekscitacije od 485 nm i talasnoj dužini emisije od 538 nm. Rezultati su izračunati korišćenjem razlika između površina ispod raspada fluoresceina sa krive slijepog uzorka i krive uzorka. Rezultati za ORAC vrijednosti izraženi su u mikromolima Trolox ekvivalenta (TE) po miligramu (μmol TE/mg) ili mikromolima TE po mikromolu (umol TE/mol).

2.8. Antioksidativna aktivnost procijenjena pomoću testa baziranog na ćelijama

Antioksidativna aktivnost je procijenjena testom baziranim na ćelijama korištenjem 2',7/-dihlorofluorescein-diacetata (DCFH-DA) kako su opisali Girard-Lalancette et al., uz neke modifikacije [25]. Ukratko, WS1 fibroblasti ljudske kože (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, SAD) su inkubirani 60 minuta sa 100 μL 5μM DCFH-DA u Hanksovom balansiranom rastvoru soli (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, SAD) . Zatim, da bi se procijenila antioksidativna aktivnost ekstrakta, ćelije su inkubirane 60 minuta uz povećanje koncentracije ekstrakta K.angustifolia i pozitivnih kontrola (kvercetin i Trolox). Za oksidativni stres, dodano je 100 μL 400 μM tertbutil hidroperoksida (t-BuOOH) da bi se dobila konačna koncentracija od 200 μM t-BuOOH u jažice. Fluorescencija je tada izmjerena odmah i nakon 90 minuta korištenjem automatskog čitača ploča Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, SAD). Fluorescencija je procijenjena na talasnoj dužini ekscitacije od 485 nm i talasnoj dužini emisije od 538 nm. Antioksidativna aktivnost je izražena kao postotak inhibicije DCFH oksidacije.

2.9. Anti-inflamatorna aktivnost procijenjena kvantifikacijom nitrita

Protuupalna aktivnost je procijenjena procjenom inhibicije proizvodnje dušikovog oksida (NO) ekstraktom K.angustifolia kako su opisali Legault et al. [26]. Ukratko, mišji makrofagi RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, SAD) su inkubirani sa rastućom koncentracijom ekstrakta K. Angustifolia, a zatim stimulirani sa 100 ng/mL lipopolisaharida (LPS). Pozitivna kontrola, Nw-nitro-L-arginin metil ester hidroklorid (L-NAME) je također korištena u dvije različite koncentracije ∶250 μM (67 ug/mL) i 1 mM (270 ug/mL). Supernatanti bez ćelija su sakupljeni 24 h nakon LPS stimulacije, a koncentracija NO je odmah procijenjena pomoću Griessove reakcije. Apsorbanca je očitana na 540 nm pomoću Multiskan čitača ploča (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Prisustvo nitrita je kvantificirano korištenjem NaNO, standardne krive. Inaktivirane ćelije (izložene samo mediju) korištene su kao negativna kontrola, a aktivirane ćelije kao pozitivna kontrola.

2.10. Proizvodnja zamjene za kožu

Zamjene za zdravu kožu proizvedene su metodom samomontaže, djelimično modificirane pomoću 6-ploča s jažicom [20,21]. Ukratko, fibroblasti na P5 od zdravih donatora zasijani su pri 1,5×105 ćelija/jažici i kultivisani 26 dana u DMEM sa dodatkom 50 ug/mL (plus)-natrijum L-askorbata (Sigma, St. Louis, MO, SAD) sve dok nisu formirali listove kojima se može manipulisati. Zatim su dva fibroblastna lista odvojena i postavljena da bi se formirao dermalni ekvivalent. Dermalni ekvivalenti su inkubirani na 37 stepeni u atmosferi sa 8 posto CO2 još dva dana kako bi se omogućilo spajanje listova i tako formirao novi dermalni sloj kožnih nadomjestaka. Nakon ovog perioda, keratinociti na P2 od zdravih donatora su zasijani na dermalni ekvivalent na 1 × 10 stepeni ćelija/ekvivalent da bi se formirao epidermalni sloj kožnih nadomjestaka i kultivirani sedam dana u DMEMH dopunjenoj sa 50 ug/mL ( plus ) -natrijum L-askorbat (Sigma, St. Louis, MO, SAD) za omogućavanje proliferacije keratinocita. Zatim su zamjene za kožu podignute na sučelje zrak-tečnost kako bi se promovirala diferencijacija stanica. Na interfejsu vazduh-tečnost, zamene za kožu su kultivisane sa medijumom bez EGF-a da bi se dobio slojevit epitel koji predstavlja in vivo kožu. Četrnaest dana nakon podizanja na granicu vazduh-tečnost, zamene za kožu tretirane su tri puta nedeljno tokom jedne nedelje sa osnovnim rastvorom ekstrakta razblaženim u medijumu za kulturu (sa konačnom koncentracijom ekstrakta K. Angustifolia od 25 ug/mL). Nakon ukupno 56 dana kulture, uzete su biopsije zamjenske kože i analizirane histološkim i imunofluorescentnim bojenjem.

2.11. Histološke analize

Biopsije kožne zamjene iz svakog stanja su fiksirane u HistoChoice otopini (Amresco, Solon, OH, SAD) i ugrađene u parafinski vosak. Sekcije debljine 5 μm su zatim izrezane i obojene Massonovim trihromom koristeći Weigertov hematoksilin, fuchsin-ponceau i anilinsko plavo boje. Debljina dermisa i živog epidermisa mjerena je softverom ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Za mjerenja debljine analizirane su tri različite populacije ćelija, a za svaku od njih snimljene su dvije reprezentativne slike po stanju i napravljeno je 10 mjerenja po slici za ukupno 60 mjerenja po stanju.

2.12. Imunofluorescentno bojenje

Biopsije zamjene kože iz svakog stanja su ugrađene u Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek, Torrance, Kalifornija, SAD), zamrznute u tečnom dušiku, a zatim držane na -80 stepenu dok nije potrebno. Zamrznuti dijelovi normalne ljudske kože korišteni su kao pozitivne kontrole. Indirektno imunofluorescentno bojenje izvedeno je na kriorezcima debljine 6 um fiksiranih u acetonu. Primarna korišćena antitela su: zečji poliklonalni antielastin (gG) (razblaživanje 1:800, Abcam, Kembridž, MA, SAD), zečji poliklonalni antikolagen-1 (IgG) (razblaživanje 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada), zečji poliklonalni anti-kolagen-3 (IgG) (razrjeđenje 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada) i zečji poliklonski anti-akvaporin-3(IgG) (razrjeđenje 1:500, Abcam, Cambridge, MA, SAD). Korišteno sekundarno antitijelo je magareće anti-zečje IgG (H plus L)Alexa 488 (razrjeđenje 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, SAD). Ćelijska jezgra su označena nakon sekundarnog antitela sa medijumom za montažu DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Da bi se polukvantificirao intenzitet fluorescencije svakog proteina, intenzitet piksela imunofluorescentnog bojenja mjeren je korištenjem softvera ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Ukratko, cijeli sloj kože (dermis ili živi epidermis) proučavanog proteina je analiziran mjerenjem srednje vrijednosti sive boje svakog područja. Intenzitet fluorescencije tretiranih nadomjestaka za kožu upoređen je sa intenzitetom fluorescencije kontrolnih nadomjestaka za kožu kako bi se procijenila promjena u ekspresiji proteina uočena pri tretmanima.

2.13. Statistička analiza

Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Statistička analiza MTI testa, testa baziranog na antioksidativnim ćelijama i antiinflamatorne aktivnosti izvršena je jednosmernom analizom varijanse (ANOVA) nakon čega je usledio Dunnettov post hoc test (p-vrednost<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

Ovaj članak je preuzet iz Antioxidants 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants