Antioksidativna aktivnost Lactobacillus Plantarum NJAU-01 u životinjskom modelu starenja

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Abstract

Pozadina:Prekomjerne reaktivne vrste kisika (ROS) mogu uzrokovati ozbiljna oštećenja ljudskog tijela i mogu uzrokovati razne kronične bolesti. Studije su otkrile da bakterije mliječne kiseline (LAB) imaju antioksidativne i anti-aging efekte, te su važni resursi za razvoj mikrobnih antioksidansa. Ovaj rad je trebao istražiti potencijalnu ulogu antioksidativnog soja, Lactobacillus plantarum NJAU-01 koji je testiran iz tradicionalnog suhomesnatog proizvoda Jinhua Ham u regulaciji subakutnog starenja miševa izazvanog D-galaktozom. Ukupno 48 Kun Ming miševa bez specifičnih patogena (SPF KM miševi) nasumično je raspoređeno u 6 grupa: kontrolna grupa sa sterilnom injekcijom fiziološkog rastvora, staračka grupa sa supkutanom injekcijom D-galaktoze, tretirane grupe sa injekcijom D-galaktoze i intragastričnom primenom od 10',10 stepeni i 10 stepeni FU/mL L.plantarum NJAU-01, i pozitivna kontrolna grupa sa injekcijom D-galaktoze i intragastričnom primjenom 1 mg/mL vitamina C.

Rezultati:Rezultati su pokazali da je tretirana grupa L. plantarum NJAU-01 na 10 stepeni FU/mL pokazao je veći ukupni antioksidativni kapacitet (T-AOC) i antioksidativne enzimske aktivnosti superoksid dismutaze (SOD), glutation peroksidaze (GSH-Px) i katalaze (CAT) od onih ostalih grupa u serumu, srcu i jetri. Nasuprot tome, sadržaj markera oksidativnog stresa malondialdehida (MDA) pokazao je niže nivoe od ostalih grupa (P<0.05). the="" antioxidant="" capacity="" was="" improved="" with="" the="" supplement="" of="" the="" increasing="" concentration="" of="" l.="" plantarum="">

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Zaključci:Dakle, ova studija pokazuje da L plantarum NJAU-01 može ublažiti oksidativni stres povećanjem aktivnosti enzima uključenih u otpornost na oksidaciju i smanjenjem nivoa oksidacije lipida kod miševa. Ključne riječi: Lactobacillus Plantarum NJAU-01, Jinhua Halm, D-galaktoza izazvana starenjem životinja, Malondialdehid, Antioksidativni kapacitet

Pozadina

Oksidacija je proces neophodan za ćelijski metabolizam u tijelu. Za oksidaciju su bile odgovorne reaktivne vrste kiseonika (ROS) kao slobodni radikali proizvedeni endogenim reakcijama oksidacije-redukcije (REDOX). Međutim, kada stanice primaju vanjske stimulanse izazvane oksidativnim stresom, prekomjerna proizvodnja ROS nadmašuje ćelijski kapacitet čišćenja ROS-a [1]. Neki podaci istraživanja su pokazali da je oksidativni stres povezan sa životnim vijekom organizama [2]Nemogućnost metaboliziranja preostalih ROS može uzrokovati ozbiljna oštećenja ljudskog tijela i može uzrokovati razne kronične bolesti povezane sa starenjem, poput dijabetesa, bolesti srca, povišeni lipidi u krvi, artritis, neurodegenerativne bolesti, kardiovaskularne i cerebrovaskularne bolesti [3]. Normalno, tijelo ima niz enzima ili ne-enzima i sistema za popravku koji su uključeni u antioksidantnu odbranu i štite ih od oksidativnog oštećenja [4-6]. Na primjer, askorbinska kiselina troši kisik kroz samooksidaciju, redukujući metalne ione kako bi smanjila oksidaciono-redukcioni potencijal i uključena je u antioksidantnu odbranu [7]. Superoksid dismutaza (SOD) može pretvoriti štetne superoksidne radikale u vodikov peroksid [8]. Katalaza (CAT) sudjeluje u ćelijskoj antioksidantnoj odbrani razlaganjem vodikovog peroksida, čime se sprječava da Fentonova reakcija proizvodi hidroksilne slobodne radikale [9]. Međutim, suvišni ROS bi doveo do oksidativnog oštećenja uzrokovanog mnogim faktorima kao što su zračenje (rendgenske zrake, y-zrake, ultraljubičasto), kemijski reagensi (metalni joni, HONO, HOCl i HOBr), lijekovi i njihovi metaboliti, pa čak i pušenje. Ovi prirodni antioksidativni sistemi u tijelu često su nedovoljni da spriječe oksidativna oštećenja, pa su im potrebni antioksidansi kao što su astaksantin i folna kiselina [10]. Stoga je potraga za dostupnim pristupom koji može ublažiti ili inhibirati ćelijska oksidativna oštećenja dobila značajnu pažnju.

Bakterije mliječne kiseline (LAB) su široko pronađene i korištene u fermentiranim mesnim proizvodima. Osim poboljšanja nutrijenata, okusa i očuvanja fermentirane hrane, LAB ima i dodatne probiotičke karakteristike [11, 12]. Neka istraživanja su otkrila da LAB imaju antioksidativne i anti-aging efekte, te su važni resursi za razvoj mikrobnih antioksidanata [13]. Na primjer, otkriveno je da slučaj Lactobacillus odvojen od kineskog domaćeg likera efikasno ublažava peroksidaciju lipida i poboljšava metabolizam lipida zbog visoke sposobnosti uklanjanja kolesterola i sposobnosti adhezije ljudskih crijevnih stanica [14]. Prethodno smo izolovali i pregledali bakteriju mliječne kiseline prema ukupnom antioksidativnom kapacitetu iz Jinhua šunke i identificirali je kao Lactobacillus plantarum otkrivanjem biohemijskih karakteristika, kolonijalne morfologije i sekvenciranja 16 s rDNK, nazvane L. plantarum NJAU{{10} } [15]. L. plantarum NJAU-01 pokazao je odličnu moć čišćenja i redukcije slobodnih radikala DPPH, slobodnih hidroksilnih radikala i superoksidnih anjonskih slobodnih radikala in vitro [16]. U ćelijskom modelu u kombinaciji sa elektrohemijskim senzorom, sposobnost makrofaga RAW264.7 kao odgovor na oksidativni stres značajno je poboljšana inkubacijom sa L. plan-tarum NJAU-01 [15].Ekstrakt Cistanche protiv zračenjaOsim toga, L. plantarum NJAU-01 također može ublažiti stepen oksidacije proteina u fermentiranoj kobasici [17]. Dakle, L. plantarum NJAU-01 dokazano ima antioksidativni efekat in vitro, što obećava da će se potencijalno koristiti u regulaciji oksidativnog stresa in vivo.

Cistanche može protiv starenja

Stoga je neophodno procijeniti antioksidativni efekat L. Plantarum NJAU-01 in vivo koristeći životinjski model, koji može efikasno posmatrati apsorpciju, transport i metabolizam kod životinja. Miševi izazvani starenjem D-galaktozom razvijeni su da simuliraju pojavu oksidativnog oštećenja u procesu starenja tijela decenijama [18]. D-galaktoza doprinosi stvaranju ROS reakcijom s aminokiselinama kako bi se formirali krajnji proizvodi glikacije kroz neenzimsku glikaciju uz prednosti niske toksičnosti, sporog procesa oksidacije i bez smrtonosnog efekta [19,20]. Često se navodi da model miševa starenja izazvanog D-galaktozom procjenjuje antioksidativni kapacitet probiotika kao što su L-karnitin, ursolna kiselina i L. Plantarum AR501 [19,21,22]. Stoga su ovi zreli miševi starenja izazvani D-galaktozom korišteni za preliminarno istraživanje uloge L. plantarum NJAU-01 u ublažavanju oksidativnog stresa kod miševa. L. plan-tarum NJAU-01 je hranjen miševima starenja izazvanim D-galaktozom kako bi se procijenili njegovi antioksidativni efekti in vivo mjerenjem ukupnog antioksidativnog kapaciteta (T-AOC), antioksidativnih enzimskih aktivnosti SOD, glutationa peroksidaze (GSH-Px), i CAT, kao i sadržaj markera oksidativnog stresa malondialdehida (MDA) u serumu miševa, srcu i jetri.cistanche herbaOvo će pružiti osnovu za dalja istraživanja o razvoju i korištenju L. plantarum NJAU-01 kao probiotika.

Rezultati

Tjelesna težina i indeksi organa kod miševa

Nijedna životinja nije umrla tokom perioda hranjenja i uključeni su datumi svih miševa. Efekti različitih tretmana sa L. plantarum NJAU-01 na indekse organa miševa prikazani su u Tabeli 1. Miševi u starijoj grupi kojima je injektirana D-galaktoza pokazali su značajno manju tjelesnu težinu u odnosu na ostale grupe (P<0.05). no="" significant="" difference="" was="" ob-served="" in="" kidney="" liver="" index="" and="" lung="" be-tween="" the="" l.="" plantarum="" njau-01="" treatment="" groups="" normal="" positive="" group="" aging="" model="" p="">0.05). Srčani indeks grupe modela starenja bio je značajno viši u odnosu na normalnu grupu (P<>

T-AOC aktivnost seruma, srca i jetre miševa. T-AOC aktivnost miševa među različitim tretiranim grupama prikazana je na slici 1. T-AOC aktivnost u modelnoj grupi miševa koji stare je bila 6,68 U/mL, a u srcu, serumu i jetri 6,62, 3,55 i 3,58 U/mg proteina, respektivno, što je niže od ostalih grupa (P<0.05). in="" the="" l.="" plantarum="" njau-01="" lp3="" group,="" serum,="" heart,="" and="" liver="" had="" significantly="" higher="" t-aoc="" than="" the="" other="" groups=""><0.05). the="" liver="" t-aoc="" in="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" the="" control="" group="" and="" the="" aging="" model="" group=""><0.05). however,="" the="" antioxidant="" activity="" of="" the="" heart="" and="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" lp3="" group=""><0.05). the="" above="" results="" indicate="" that="" l.="" plantarum="" njau-01="" can="" enhance="" the="" t-aoc="" of="" the="" mice="" in="" a="" dose-dependent="">

Aktivnost SOD u serumu, srcu i jetri miševa

Aktivnosti SOD miševa u grupi modela starenja u serumu, srcu i jetri miševa bile su 16,72 U/mL, 18,93 U/mg proteina i 44,82 U/mg proteina, respektivno, što je značajno niže od kontrolne grupe (P<0.05,fig.2).in contrast,the="" sod="" activity="" in="" serum,="" heart="" and="" liver="" of="" mice="" in="" vc="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" mice="" in="" the="" aging="" model="" group="" and="" control="" group=""><0.05). the="" sod="" activity="" in="" heart="" of="" mice="" lp2="" group="" was="" 61.85="" mg="" which="" not="" significantly="" different="" from="" that="" positive="" control="" p="">0.05). S druge strane, aktivnosti SOD u serumu, srcu i jetri grupe visoke doze bile su 48,83 U/mL, 74,67 U/mg proteina i 69,55 U/mg proteina, respektivno, što je značajno više nego u drugim grupama (P<0.05). these="" results="" showed="" that="" l.="" plantarum="" njau-01="" could="" alleviate="" the="" oxidative="" damage="" induced="" by="" d-galactose="" to="" the="" body,="" and="" increase="" sod="">

GSH-Px u serumu, srcu i jetri miševa

LP3 grupa pokazala je veću aktivnost GSH-PX od miševa u drugim grupama u serumu, srcu i jetri (P<0.05, fig.="" 3).="" the="" gsh-px="" activity="" in="" the="" heart="" and="" liver="" tissues="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" was="" signifi-cantly="" higher="" than="" that="" of="" mice="" in="" the="" control="" group="" and="" the="" aging="" model="" group=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" for="" the="" serum="" gsh-px="" activity="" between="" lp1="" and="" control="" group="" p="">0.05). Osim toga, grupe modela starenja u srcu i jetri miševa bile su 50,39 U/mL, 8,48 U/mg proteina i 62,67 U/mg proteina, respektivno, pokazujući nižu aktivnost GSH-Px od druge grupe (P<0.05). therefore,l.="" plantarum="" njau-01="" has="" an="" enhancing="" effect="" on="" the="" antioxidant="" enzymatic="" activity="" of="" gsh-px="" in="" mice,="" and="" the="" strain="" concentration="" is="" related="" to="" the="" antioxidant="">

Aktivnost CAT u serumu, srcu i jetri miševa

Kao što je prikazano na slici 4, CAT aktivnosti seruma, srca i jetre LP3 miševa bile su 22,98 U/mL, 137,99 U/mg proteina i 136,31 U/mg proteina, respektivno, što je imalo veću CAT aktivnost od one u drugom tretmanu. grupe (P<0.05), indicating="" that="" the="" concentration="" of="" the="" strain="" had="" a="" marked="" effect="" on="" the="" cat="" activity.="">cistanche rast penisaNasuprot tome, grupa modela starenja pokazala je nižu CAT aktivnost nego ona kod miševa u drugim grupama u serumu, srcu i jetri miševa (P<0.05). as="" for="" vc="" group,="" it="" presented="" higher="" cat="" activity="" than="" the="" control="" group="" and="" aging="" model="" group="" in="" serum,="" heart="" and="" liver="" of="" mice=""><0.05). these="" findings="" demonstrate="" that="" l.="" plantarum="" njau-01="" can="" enhance="" the="" cat="" activity="" in="" mice="" serum,="" heart="" and="" liver="">

Sadržaj MDA u serumu miševa, srcu i jetri

Sadržaj MDA u serumu, srcu i jetri miševa u grupi modela starenja bio je značajno veći od kontrolne grupe (P<0.05, fig.="" 5).="" the="" serum="" mda="" content="" of="" mice="" in="" the="" lp3="" group="" was="" 14.29="" nmol/ml,="" and="" the="" mda="" contents="" in="" the="" heart="" and="" liver="" were="" 8.00="" and="" 26.49="" nmol/mg="" protein,="" respectively,="" being="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" other="" groups=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" mda="" content="" among="" the="" positive="" control="" lp1="" and="" lp2="" groups="" p="">0.05).

Diskusija

Model subakutnog starenja miševa indukcijom D-galaktoze se široko koristi i dobro je poznat [14,23,24]. Model uključuje kontinuirano ubrizgavanje D-galaktoze koja se reducira u galaktozu galaktoza reduktazom unutar ćelija, što rezultira promjenom osmotskog tlaka između stanice i okoline, a zatim oticanjem i starenjem ćelije [25]. Intracelularni enzimi koji ublažavaju oksidativni stres, kao što su SOD, CAT i GSH-Px, nisu dovoljni da eliminišu reaktivne vrste kiseonika, kada su ćelije u telu podvrgnute akutnom oksidativnom stresu. To je direktna i efikasna metoda za proučavanje antioksidativne aktivnosti LAB-a ubrizgavanjem LAB-a u miševe sa subakutnim starenjem izazvanim D-galaktozom i poređenjem enzimske antioksidativne aktivnosti, kao što su SOD, GSH-Px i CAT sa kontrolnom grupom [21].

U ovoj studiji, grupa modela starenja i grupa pozitivne kontrole (injekcija sa Vc) upoređene su sa različitim dozama grupe koja je tretirana L. plantarum NJAU-01. Indeks organa je omjer težine organa u eksperimentalnoj životinji i njezine tjelesne težine, a povećanje koeficijenta organa ukazuje na kongestiju, edem ili hiperplaziju organa, dok smanjenje koeficijenta organa ukazuje na atrofiju organa i druge degenerativne promjene. Indeks organa je također korišten za izražavanje promjena u stepenu starenja, što je dokazano u studijama Yu et al. (2016) i Xu et al. (2016)[18,26]. Ova studija je otkrila da su miševi u grupi modela starenja imali nižu težinu i veći srčani indeks od miševa u drugim grupama. Davanje D-galaktoze značajno je smanjilo antioksidativnu enzimsku aktivnost u serumu, srcu i jetri miševa u grupi modela starenja. Predloženo je da suplementi L. plantarum NJAU{7}} smanjuju oštećenje jetre kod miševa izazvanih oksidativnim stresom D-galaktozom regulacijom abnormalnih aktivnosti SOD, GSH-Px i CAT na normalne nivoe. To je u skladu sa objavljenim studijama kada se istražuje antioksidativna uloga ciljanih sojeva uključujući L. plantarum AR113 i ARS01 [12],L. del-brueckii subsp. bulgaricus F17 [27]. Dakle, model starenja D-galaktoze subakutnih miševa u trenutnoj studiji je efikasan da pruži povjerljive dokaze za istraživanje antioksidativnog kapaciteta LAB in vivo.

Rezultati prethodnih istraživanja su pokazali da se antioksidativni mehanizam LAB-a uglavnom manifestuje u sljedećim aspektima: helirani metalni joni, autotrofni antioksidativni enzimski sistemi, proizvodnja antioksidativnih metabolita, povećana aktivnost antioksidativnih enzima domaćina, kontrola antioksidativnih signalnih puteva i regulacija grupe crijevnih bakterija [28]. Ovi aspekti igraju ključnu ulogu u ublažavanju bolesti čiji razvoj uključuje oksidativni stres [29]. MDA se smatra biomarkerom lipidne peroksidacije i može dovesti do umrežene polimerizacije makromolekula, igrajući potencijalnu ulogu u citotoksičnosti i genotoksičnosti. Sadržaj MDA se obično koristi kao osnova za procjenu stepena peroksidacije lipida i odražava nivo oštećenja ćelija [30].prednosti cistanche salseTrenutna studija je otkrila da su miševi s oksidativnim stresom izazvanim D-galaktozom značajno snizili nivoe MDA u serumu, srcu i jetri injekcijom L. plantarum NJAU-01 što ukazuje da L. Plantarum može efikasno smanjiti stvaranje lipidni peroksid kod miševa. Ovo je u skladu sa in vitro studijom, koja je pokazala efikasnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala soja L. plantarum NJAU{4}} [16]. Slično, odbijena prasad hranjena sa L. plantarum ZLP001 imala su niži sadržaj MDA u serumu (4,1 nmol/ml) od kontrolne grupe (6,23 nmol/ml), što pokazuje da L. Plantarum ZLP001 posjeduje antioksidativno djelovanje [31]. Trenutna studija sugerira da suplementi L. plantarum NJAU-01 mogu u suštini ublažiti stepen oksidacije lipida kod miševa izazvanih D-galaktozom, štiteći miševe od oksidativnog stresa.

U tijelu postoji skup enzimskih odbrambenih sistema za čišćenje slobodnih radikala, kao što su SOD, GSH-Px i CAT, koji sinergistički uklanjaju superoksidne radikale, hidroksil radikale i vodikov peroksid, odnosno [32]Oksidacija slobodnih radikala i antioksidans odbrambeni sistem organizma je u stanju dinamičke ravnoteže. Kada je tijelo izloženo podražajima koji izazivaju oksidativni stres, ova dinamička ravnoteža može biti poremećena. Prekomjerna proizvodnja ROS-a oštećuje proteine, lipide i molekule nukleinskih kiselina, što u konačnici dovodi do starenja organizama i razvoja raznih bolesti [3]. SOD može pretvoriti superoksidne radikale u vodikov peroksid, koji je još uvijek citotoksičan i može stvoriti hidroksilne radikale Fentonom reakcijom [34]. Hidroksilni radikal je jedan od najaktivnijih ROS, koji može reagirati s organskom tvari u ćeliji uz brzu reakciju i destruktivni učinak [35]. Štaviše, CAT može razgraditi hidroksilne radikale da bi učestvovao u antioksidativnoj odbrani ćelije [36]. U fiziološkim uslovima, antioksidativni enzimi, kao što je GSH-Px, mogu se proizvoditi u ćelijama kako bi zaštitili ove ćelije od oksidativnog oštećenja [25]. Ova studija je pokazala da L. plantarum NJAU-01 može značajno pojačati aktivnosti SOD, GSH-Px, CAT i T-AOC u serumu, srcu i jetri miševa, što ukazuje da L. plantarum NJAU-01 ublažava oksidativna oštećenja uzrokovana D-galaktozom. Ovaj efekat se može pripisati dvama aspektima.L. plantarum NAJU-01 može promovirati aktivnost antioksidativnih enzima kod miševa, regulirajući ravnotežu ROS-a na normalne nivoe kod miševa. S druge strane, također može ukloniti slobodne radikale i djelovati sinergistički sa SOD, GSH-Px i CAT kako bi smanjio oksidativni stres. Regulacija aktivnosti antioksidativnih enzima od strane probiotskih bakterija je također prijavljena za Lactobacillus fermentum [37] i Lactobacillus ferment-tum ME-3 [38]. Ova studija pokazuje da L. plan-tarum NJAU-01 ispoljava antioksidativni efekat kod miševa i da je obećavajuća alternativa sintetičkim ili biljnim antioksidansima. Obično se koristi kao bio-izvor antioksidansa za proučavanje predjela za kobasice ili funkcionalnih proizvoda [18]. Iako su istraživanja o antioksidativnom djelovanju LAB-a privukla široku pažnju posljednjih godina, istraživanja temeljnog mehanizma antioksidacije L. Plantarum NJAU-01, posebno metaboličkih puteva, ekspresije proteina i regulacije crijevnog flora je i dalje oskudna. Štaviše, ukrštanje i dopuna višestrukih antioksidativnih mehanizama u bakterijama mliječne kiseline zahtijevaju daljnja istraživanja.

Zaključci

Ova preliminarna studija je dokazala efekat L. plan-term NJAU{1}} izolovanog iz Jinhua šunke na model starenja miševa izazvan D-galaktozom. Utvrđeno je da dodavanje L. Plantarum NJAU-01 tokom procesa hranjenja miševa može značajno povećati aktivnost antioksidativnih enzima i smanjiti sadržaj MDA. Ovo istraživanje potvrđuje mogućnost L. plan-tarum NJAU-01 kao bio-antioksidansa i postavlja osnovu za dalje proučavanje antioksidativnog mehanizma L.plantarum.

Metode

Bakterijski soj i životinjski preparat

L.plantarum NJAU{{0}} (CGMCC14194) je pregledan iz tradicionalno sušenog mesnog proizvoda Jinhua šunke korištenjem morfoloških, biohemijskih i molekularno genetičkih metoda identifikacije [15]. Ovaj soj je imao visoku antioksidativnu aktivnost i sačuvan je na Fakultetu za nauku o hrani i inženjeringu Univerziteta Yangzhou [16]. Lactobacillus Plantarum NJAU-01 je sačuvan kao smrznuti (-80 stepen) zalihe u De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) bujonu (Bio-way Technology Co., Ltd, Šangaj, Kina) dopunjen sa 20 posto (v/v) glicerol. Soj od 1% inokuluma je dva puta aktiviran i uzgajan u 10 mL MRS bujona na 37 stepeni tokom 18 sati. Bakterijska suspenzija od 100 μL je zatim inokulirana u čvrsti MRS medij pomoću automatskog razblaživača i tanjira (Referenca 414,000, Interscience, Saint-Nom-la-Breteche, Francuska). Inokulisani čvrsti medij MRS kultivisan je na 37 stepeni tokom 24 h, a broj održivih ćelija je prebrojan automatskim brojačem HD kolonija (Skeniranje 1200, Interscience, Saint-Nom-la-Breteche, Francuska) i stepenom skeniranja verzija softvera 8.0 (Interscience, Saint-Nom-la-Breteche, Francuska). Detektovana je koncentracija bakterijske suspenzije 2×10' CFU/mL, a kultura soja od 10 mL je centrifugirana na 6,000 g 10 minuta na 4 stepena da bi se supernatant odbacio. Pelet je tri puta ispran sterilnim fiziološkim rastvorom, a zatim rastvoren u 20 mL sterilnog fiziološkog rastvora, čime se dobija 1×10 stepeni FU/mL L.plantarum NJAU-01. Zatim je alikvot od 2 mL bakterijske suspenzije na 1×10 stepeni FU/mL uklonjen u novu epruvetu da se kombinuje sa 18 mL sterilnog fiziološkog rastvora za dobijanje doze od 1×10 stepeni FU/mL bakterija. Analogno, koncentracija od 1×107 CFU/mL dobijena je razblaženjem 1×10 stepeni FU/mL bakterijske suspenzije. Za eksperimentalnu životinju odabrani su KM miševi SPF razreda (ženke, stare 4 sedmice, težine 18-20 g). Hranu za životinje i posteljinu obezbijedio je Institut za komparativnu medicinu Univerziteta Yangzhou (Yangzhou, Jiangsu, Kina). Svi eksperimenti na životinjama odobreni su od strane Odbora za dobrobit životinja i etičkih odbora Univerziteta Yangzhou iu skladu su sa smjernicama Institucionalnog administrativnog odbora i Etičkog odbora laboratorijskih životinja (IACUC broj licence: 201811009). Miševi su uzgajani na 20±2 stepena sa relativnom vlažnošću od 55±5 procenata. Pacovi su nasumično hranjeni standardnom ishranom za pacove tokom poludnevnog ciklusa svetlosti i mraka (svetlosna faza od 7:00 do 19:00). Četiri miša su uzgajana u kavezu, hranjena hranom bez patogena i vodom. Svi materijali, uključujući poklopce, hranilice, boce i posteljinu su autoklavirani prije upotrebe. Miševi su aklimatizovani nedelju dana pre uspostavljanja modela starenja miševa.

Uspostavljanje modela starenja miševa

Ustanovljen je subakutni model starenja miševa izazvan D-galaktozom i upućen Zhao et al. uz male modifikacije [39]. Metoda primjene galaktoze provedena je supkutanom injekcijom u vrat i leđa. Ukupno 48 SPF miševa je nasumično raspoređeno u 6 grupa (8 pacova/grupa) nakon jedne sedmice aklimatizacije. Slučajni brojevi su generirani korištenjem standardne=RAND() funkcije u programu Microsoft Excel. Miševima u svakoj grupi, osim kontrolne grupe, subkutano je ubrizgano 500 mg D-galaktoze po kg tjelesne težine (Shanghai Blue Season Biological Co., Ltd, Šangaj, Kina) 4 sedmice jednom dnevno (rastvor D-galaktoze, 50 g/L). Kontrolnoj grupi je ubrizgano 10 mL sterilne fiziološke otopine po kg tjelesne težine. Pored toga, tri grupe za liječenje dobile su intragastrične doze L.cistanche tubulosa doza redditPlantarum NJAU-01 (10' CFU/mL, 10 stepeni CFU/mL i 10 stepeni FU/mL) na 20 mL po kg tjelesne težine, i označen kao LP1 grupa, LP2 grupa i LP3 grupa, respektivno. Miševi u kontrolnoj grupi i starijoj grupi su intragastrično hranjeni sterilnom fiziološkom otopinom od 20 mL/kg dnevno. Miševi u pozitivnoj kontrolnoj grupi tretirani su sa 1 mg/mL vitamina C (Vc) u dozi od 20 mL/kg dnevno. Čitav eksperiment je trajao četiri sedmice.

Priprema uzoraka tkiva

Miševi su eutanazirani do nesvjesnog stanja intraperitonealnom injekcijom 3 posto izoflurana. Prestanak otkucaja srca i nereagiranje na štetni stimulus (štipanje stražnje šape) korišteni su kao kriteriji za verifikaciju smrti. Miševima je uklonjena očna jabučica i vađena krv. Zatim je krv odmah centrifugirana na 3,00xg 10 min na 4 stepena da bi se dobio serum i pohranjena na -20 stepen do analize. Nakon eutanazije, miševi su nesvjesno pogubljeni vađenjem vratnih pršljenova, a jetra, srce, slezina, bubrezi, pluća i mozak su sakupljeni i izvagani kako bi se odredili indeksi organa. Uzorci jetre i srca su homogenizirani u 10 postotni homogenat tkiva sa 0,9 posto NaCl, a supernatant je sakupljen centrifugiranjem kao što je gore navedeno.

Detekcije parametara

T-AOC i antioksidativna enzimska aktivnost SOD, GSH-Px i CAT, te sadržaj MDA određivani su korištenjem kompleta za analizu ukupnog antioksidativnog kapaciteta (ABTS metoda, A015-2-1), testa superoksid dismutaze (SOD) komplet (WST-1 metoda, A001-1-2), komplet za ispitivanje glutation peroksidaze (GSH-PX) (kolorimetrijska metoda, A0060201), komplet za analizu katalaze (CAT) (kolorimetrijska metoda, A007-2-1 ) i malondialdehid (MDA) test kit (TBA metoda, A003-2-1), respektivno. Svi kompleti su kupljeni od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute Co, Ltd (Nanjing, Jiangsu, Kina). Svi uzorci su testirani u tri primjerka, a postupci detekcije su provedeni u skladu s uputama.

Statistička analiza

Podaci su analizirani pomoću softvera Data Processing System 7.05 (Hangzhou Ruifeng Information Technology Co., Ltd, Hangzhou, Kina). Duncanovom novom kompleksnom metodom raspona upoređene su različite srednje vrijednosti. Test statističke značajnosti urađen je na nivou 0,05 (P<>

Ovaj članak je preuzet iz Ge et al. BMC Microbiology (2021) 21:182 https://doi.org/10.1186/s12866-021-02248-5