Adenovirusna vakcina koja sadrži skraćeni SARS-CoV-2 podjedinicu šiljastog proteina S1 dovodi do specifičnog imunološkog odgovora kod miševa

Abstract:Razvoj efikasne i sigurne vakcine protiv korona virusa 2019. (COVID-19) je ključni pristup za upravljanje pandemijom teške akutne respiratorne bolesti koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) u svjetlu trenutnih uslova. U ovoj studiji proizveli smo skraćeni segment optimiziranog SARS-CoV-2 šiljastog gena (2043 bp, nazvan S1) koji je bio u stanju da kodira skraćeni S1 protein. Protein je testiran kako bi se utvrdilo može li izazvati efikasnu imunizaciju miševa protiv SARS-CoV-2. Prisustvo S1 proteina je potvrđeno imunofluorescencijom i Western blotingom. Adenovirusna vakcina koja nosi fragment gena S1 (Ad-S1) je davana intramuskularno miševima četiri puta tokom 4 nedelje. Humoralni imunitet na SARS-CoV-2 S1 protein dokazan je kod svih imuniziranih miševa. Serum imuniziranih miševa pokazao je odličnu antiinfekciju in vitro. Uočen je snažan humoralni imuni odgovor protiv SARS-CoV-2 kod miševa nakon vakcinacije Ad-S1, što sugerira da vakcina protiv adenovirusa može pomoći u razvoju vakcina protiv SARS-CoV-2 i drugih genetski različitih virusi.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Ključne riječi: SARS-CoV-2; vakcine; adenovirusni vektor; S1 gen; imunitet

1. Uvod

Koronavirusna bolest 2019. (COVID-19) često je povezana sa zatajenjem više organa i visokom stopom smrtnosti [1] i predstavlja veliku prijetnju javnoj sigurnosti širom svijeta. Od 15. jula 2022. godine, pandemija COVID-19 je opstala u cijelom svijetu, sa 557.917.904 potvrđenih slučajeva, uključujući 6.358.899 smrtnih slučajeva, prijavljenih Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (WHO). Nadalje, do 11. jula 2022. godine primijenjeno je ukupno 12.130.881.147 doza vakcine. Stoga je osmišljavanje i razvoj novih vakcina protiv koronavirusa (nCoV) od velike važnosti i jedan od glavnih globalnih zdravstvenih prioriteta. S protein je ključni faktor u ulasku SARS-CoV-2 teške akutne respiratorne bolesti coronavirus 2 (SARS-CoV-2) u ćelije domaćina [2,3]. Protein se veže za receptor domaćina i omogućava virusu da nesmetano uđe u ćeliju domaćina [4]. N-povezani glikani strše iz površine trimera i u velikoj meri ukrašavaju S protein, utičući na savijanje S proteina, humoralni imunitet i procesiranje proteaze ćelije domaćina [5]. SARS-CoV-2 S protein ima nižu gustinu N-vezanog glikana od drugih S proteina izazvanih humanim virusom korona [6]. Stoga, S protein može biti visoko imunogen i glavna je meta neutralizirajućih antitijela. S protein ima tri strukturna domena, među kojima je S1 domen najvažniji površinski antigen S proteina [4]. Zbog poteškoće proizvodnje velikih rekombinantnih proteina (ekstracelularni domen proteina S ima oko 1300 aminokiselina) i rizika od pojačanja infekcije ovisno o antitijelima (ADE), S1 (oko 700 aminokiselina) i njegova domena za vezanje receptora (RBD, oko 200 aminokiselina) se naširoko smatra najatraktivnijim potencijalnim ciljevima za vakcinu protiv koronavirusa [7,8]. Humani adenovirus serotip 5 (HAdV-C5) se široko koristi u bazičnoj virologiji kao genska terapija i vektor za isporuku vakcine [9]. HAdV-C5 ima prirodnu raznolikost i može parazitirati na većini domaćina, što čini osnovu za razvoj eksperimenata na životinjama. Rekombinantni adenovirusni vektori sa replikacijom i defektima replikacije konstruisani od HAdV-C5 naširoko se koriste u isporuci vakcine i genskoj terapiji [9,10]. Trenutno su adenovirusi odobreni kao vakcine protiv akutnih respiratornih infekcija i bilo je mnogo ispitivanja takvih vakcina, kao što su malarija i HIV-1 [9]. U ovom radu opisujemo SARS-CoV-2 humanu vektorsku vakcinu adenovirusa sa nedostatkom replikacije i njenu pripremu i primjenu. U ovoj studiji, vakcina protiv adenovirusa je konstruisana na sljedeći način: vektor je bio humani adenovirus defektan u replikaciji HAdV-C5 sa E1 i E3 delecijom, skeletni plazmid je bio rekombinantni adenovirus sa pBHGlox∆E1,3Cre, ćelijska linija za pakovanje su bile ćelije HEK293, a ciljni gen je bio skraćeni gen S1 proteina SARS-CoV-2. Ekspresija proteina S1 u vakcini identifikovana je Western blot testovima i imunofluorescentnim testovima. Da bi se odredio kvalitet imunoloških odgovora izazvanih kandidatima za vakcinu zasnovanu na šiljcima, odgovor antitijela nakon vakcinacije je detaljno ispitan. Imunološka korist od vakcine procenjena je testom na vezivna antitela (enzimski imunosorbentni test [ELISA]) i testom neutralizacionih antitela. Naši nalazi pružaju osnovu za razvoj i procjenu COVID-19 vakcina i tretmana zasnovanih na proteinu S1.

2. Materijali i metoda

2.1. Ćelije i životinje

U ovoj studiji korištene su ćelijske linije bubrega majmuna HEK293 i Vero E6. Obje ćelijske linije su uzgajane u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle's mediju (DMEM) sa dodatkom 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1% penicilina i streptomicina na 37 ◦C sa 5% CO2 i zasićenom vlažnošću. Dvadeset ženki miševa C57BL/6 (6-8 sedmica) kupljeno je od Zhejiang Animal Experimental Center, Zhejiang Province. Miševi su nasumično podijeljeni u dvije grupe sa 10 mišem u svakoj grupi. Jedna grupa je imunizirana (100 µL intraperitonealne injekcije) s Ad5 vektorom koji eksprimira SARS-CoV-2 spike protein (Ad5-S), a druga sa PBS-om (100 µL intraperitonealne injekcije) kao kontrolom. Ukupna količina virusa bila je 5 × 109 VP. Svi miševi su imunizirani intramuskularnom injekcijom D0/D14 [11,12]. U D14 uzeta je periferna krv od 100 µL, serum je odvojen, a druga injekcija je data dva sata nakon uzimanja krvi. Na D28, krv je sakupljena retro-orbitalnom punkcijom i serum je odvojen. Vezujuća antitijela su otkrivena 3 dana nakon svakog uzimanja krvi, neutralizirajuća antitijela su otkrivena 7 dana nakon svakog uzimanja krvi, a citokini su otkriveni 7 dana nakon drugog uzimanja krvi. Svi miševi su eutanazirani; svi testovi su sprovedeni u strogom skladu sa "Smernicama za brigu i upotrebu eksperimentalnih životinja Narodne Republike Kine" i odobreni od strane Etičkog saveta Univerziteta Zhejiang Shuren.

2.2. Vakcine

Svi sojevi SARS-CoV-2 korišteni u ovoj studiji prikupljeni su od pacijenata sa COVID-19 uz pristanak. Državna ključna laboratorija za dijagnostiku i liječenje zaraznih bolesti razvila je vakcinu protiv adenovirusa (Vero cell, WuHan soj, GISAID broj: EPI_ISL_415711) protiv SARS-CoV-2, a zatim vakcina je proizvedena u okruženju usklađenom sa nivoom biološke sigurnosti (BSL). Specifikacija vakcine je 0,5 mL/dozi i sadrži Tris, NaCl, šećer od trske, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, apsolutni etanol i SARS-CoV-2 S1 protein.

2.3. Konstrukcija rekombinantnog adenovirusa

SARS-CoV-2 S1 proteinska sekvenca (br. QRU91950.1) dobijena je od PubMed-a. Prema degeneraciji gena, optimizirana sekvenca nukleotida kodona pogodna za ekspresiju ćelija sisara je dizajnirana na osnovu pretpostavke da je aminokiselinska sekvenca proteina proizvoda kodiranog SARS-CoV-2 S1 proteinom ostala nepromijenjena. Ukupna dužina je bila 2043 bp. Prekursorska sekvenca 50 je sintetizirana aktivatorom tkivnog plazminogena (tPA) i vezana je sekvenca koja kodira SARS-CoV-2 S1 aminokiselinu 2–688 i sekvencu prekursora tPA. Kozak sekvenca i SpeI restrikcijsko mjesto su dodani ispred startnog kodona, a XbaI restrikcijsko mjesto je dodano nakon terminacionog kodona. Nukleotidne sekvence gornjih gena sintetizirane su i klonirane u pUC18 od strane Sangon Biotech-a kako bi se dobio klonirani plazmid sintetičkog gena. Sintetizirana sekvenca gena S1 i vektor pDC316 su digestirani restrikcijskim endonukleazama SpeI i XbaI. Ciljni fragment i vektor su izvučeni iz gela i povezani kako bi se formirao šatl plazmid. SARS-CoV-2 šatl plazmid je upakovan sa skeletnim plazmidom AdMax adenovirus sistema pBHGloxd∆E1 i 3Cre ko-transfekcijom ćelija HEK293. Primarni rastvor virusa je dobijen nakon ponovljenog zamrzavanja-odmrzavanja i centrifugiranja, a virus je amplifikovan i kultivisan nakon pročišćavanja plaka.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Određivanje titra adenovirusa

HEK293 ćelije u dobrom zdravlju su odabrane i resuspendirane kako bi se pripremila suspenzija ćelija od 5.0 × 105 ćelija/mL, koja je zasijana u 24-ploču (1 mL/jažici) ) i kultivisan na 37 ◦C u okruženju sa 5% CO2. Uzorak je serijski razrijeđen desetostruko i razrijeđeni uzorak (0.1 mL) od 10−5 do 10−8 ćelija je inokuliran na 24-ploču s jažicom . Zatim su ploče izložene infekciji na 37 ◦C sa 5% CO2 tokom 48 h. Zatim je medij kulture uklonjen, dodat je prethodno ohlađen metanol (0,5 mL) i uzorci su fiksirani na -20 ◦C 20 min. Nakon fiksacije, uzorci su isprani fiziološkim rastvorom puferiranim fosfatom (PBS) i blokirani sa 1% goveđeg serumskog albumina (BSA, 0,2 mL) na 37 ◦C tokom 1 h. Zatim su dodana primarna (Mišji anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) i sekundarna (kozji pAb na MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) antitela i inkubirana 1 h, tokom čega je PBS korišćen je za pranje. Nakon inkubacije, dodat je novopripremljen radni rastvor (0,2 mL) i inkubiran 5-10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je radni rastvor odbačen, uzorci su isprani PBS-om i ponovo je dodan PBS (1 mL). Izračunat je prosječan broj pozitivnih ćelija u mikroskopskom polju (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), pri čemu je odabran gradijent sa 5-50 pozitivnih ćelija u vidnom polju i najmanje pet područja nasumično odabrano za brojanje . Izračunat je broj vidnih polja u svakoj jažici 24-ploče. Zatim je titar virusa izračunat prema sljedećoj formuli (1):

2.5. PCR u realnom vremenu

Da bismo otkrili ekspresiju mRNA ćelije HEK293 nakon virusne infekcije, ekstrahovali smo intermedijernu RNK prema uputstvima za rad TRIzola (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Ukupna RNK je ekstrahirana upotrebom TRIzola i obrađena sa DNazom I bez RQ1 RNK (Promega, Madison, WI, SAD) da bi se eliminirala rezidualna DNK. Komplementarna DNK (cDNA) je dobijena reverznom transkripcijom ekstrahovane RNK upotrebom PrimerScript™ RT kompleta reagensa sa kompletom za brisanje gDNA (Takara, Kusatsu, Japan). DNK fragmenti su generirani sa specifičnim prajmerima P1 (50 -GGTGATTTCTTCTTCAGGTTGGA-30) i P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​ciljnog gena (S1). Gen je amplificiran prajmerima P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) i P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) kao internom kontrolom (GAPHD).

2.6. Western Blot

Ćelijski lizat i supernatant su razdvojeni elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gela (SDS-PAGE) i zatim prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida (PVDF). Mrlje su vizualizirane pomoću Western blot opreme za snimanje (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Ukratko, membrane su prebačene u TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0.5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) sa 5% nemasnog suvog mlijeka u prahu i mućkati na šejkeru za dekolorizaciju na sobnoj temperaturi 1 h. Membrane eksperimentalne i kontrolne grupe su uklonjene iz rastvora za zatvaranje i inkubirane sa primarnim antitelom: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kat. #40591- T62, Sino Biological, Peking, Kina)] na sobnoj temperaturi. Primarna antitijela su protresena i inkubirana preko noći na mućkalici za dekolorizaciju na 4 ◦C. Mrlja je isprana rastvorom TBST i inkubirana 2 h sa sekundarnim antitelom [kozji anti-zečji imunoglobulin G (IgG) H&L (HRP) (1:10,000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Nakon ispiranja, mrlje su inkubirane 1 min sa kompletom rastvora LumiBest ECL supstrata (kat. #4AW011-100, 4A Biotech), a zatim posmatrane u snimaču.

2.7. Imunofluorescentni test

HEK293 ćelije (3 × 106/bunarić) su posađene u ploče 12-jažica. Nakon 48 h, ćelije su inficirane adenovirusom koji sadrži S1 gen (Ad-S1). Nakon 48 h, medijum je aspiriran, a ćelije su jednom isprane PBS-om koji sadrži 2% BSA i fiksiran 15 minuta metanolom koji je prethodno ohlađen 15 minuta na -20 ◦C. Nakon tri ispiranja sa 2% BSA u PBS, ćelije su permeabilizirane sa 0,5% Triton X-100 tokom 10 minuta. Zatim su ćelije blokirane 1 h sa 2 mL 2% BSA, rastvor za blokiranje je odbačen, a ćelije su isprane tri puta sa PBS. Nakon toga, 2 mL primarnog antitijela [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] je dodato u svaku jažicu i inkubirati na sobnoj temperaturi 1 h ili 4 ◦C preko noći. Zatim je uzorak ispran tri puta sa 2% BSA po 5 minuta po ispiranju. Zatim, 2 mL sekundarnog antitela [kozji anti-zečji IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. #550037, ZenBio)] je dodato u svaku jažicu i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 h. Nakon toga, uzorci su ispirani tri puta sa 2% BSA po 5 minuta po ispiranju. 40,6-diamidino-2-rastvor fenilindola (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, kat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) je dodan u svaku jažicu i reagovao 10 min u mraku. Analiza je posmatrana pomoću EVOS™ M7000 sistema za snimanje (kat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S protein (1 µg/mL) obložen je preko noći u 96-pločama sa bunarima (100 µL/bunariću) sa 0. 05 M bikarbonatni pufer. Nakon pranja sa PBST (0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4·12H2O, 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.5 mL Tween-20, dodajte vodu do 1000 mL) pet puta, dodat je rastvor za blokiranje i inkubiran na 37 ◦C 1 h. Uzorak seruma je razrijeđen i dodan u svaku jažicu (100 µL/jažici). Nakon 1 h inkubacije na 37 ◦C, uzorci su isprani PBST pet puta. Primarno antitijelo [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] je dodano i inkubirano 1 h, zatim uzorci su isprani pet puta sa PBST, nakon čega je uslijedila 1 h inkubacije na 37 ◦C sa sekundarnim antitijelom konjugovanim s peroksidazom hrena [kozji anti-zečji IgG H&L (HRP) (1:10,000, kat. #ab6721, abcam)] i pet pere sa PBST. Nakon dodavanja 3, 30, 5 i 50-tetrametil bifenil anhidrida tokom 5 minuta, reakcija je zaustavljena sa 2 M sumpornom kiselinom. Optička gustina je izmjerena na 450 nm i 630 nm instrumentom za označavanje enzima (Molecular Devices, SpectraMax 190), a zatim je postavljena na standardnu ​​krivu.

Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem

2.9. Određivanje citokina 

Ploča (kat. #T-k15048D-1, MSD) je isprana tri puta sa 150 µL/bažirić pufera za ispiranje i 50 µL pripremljenog uzorka je dodat u svaku jažicu. Zatim je ploča zapečaćena lepljivim zatvaračem i inkubirana na sobnoj temperaturi uz mućkanje 2 h. Zatim je ploča isprana tri puta sa 150 µL/bažirić pufera za ispiranje i 25 µL rastvora antitela za detekciju je dodato u svaki bunar. Ploča je ponovo zatvorena i inkubirana na sobnoj temperaturi uz mućkanje 2 h. Zatim je ploča isprana tri puta sa najmanje 150 µL/buferu za ispiranje; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) je dodato u svaku jažicu, a ploča je analizirana na MSD instrumentu.

2.10. Neutralizirajuće antitelo

2.10.1. Test neutralizacije pseudovirusa

Aktivnost neutralizacije mišjeg seruma testirana je pomoću pseudovirusnog sistema virusa vezikularnog stomatitisa (VSV). Serum je inaktiviran u vodenom kupatilu {{0}}.5 h na 56 ◦C, a zatim serijski razblažen do potrebnog opsega. HEK293 ćelije su postavljene u ploču sa 96-jažicom. Razrijeđeni serum je pomiješan sa 200 CCID50 (doza virusa koja može inficirati 50% ćelijske kulture)/100 µL suspenzije virusa u omjeru 1:1 i stavljen u CO2 inkubator (37 ± 1 ◦C) za 2 h. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 µL otopine za održavanje virusa koja sadrži 0,5% dvostrukog antitijela penicilin-streptomicin, a neutralizirana smjesa je inokulirana u 96- ploču s jažicom koja je sadržavala ćelije u količini od 100 µL po jažici, s dvije ponovljene jažice za svako razblaživanje. Istovremeno je postavljena normalna ćelijska kontrola i ćelije su inkubirane u CO2 inkubatoru (37 ± 1 ◦C) 96 h. Zatim je 200 CCID50/100 µL rastvora virusa razrijeđeno u 10-1~10-3. Medij ćelijske kulture u pločici 96-jažice je odbačen, 150 µL otopine za održavanje virusa je dodano u svaku jažicu, a razrjeđenje otopine virusa je inokulirano u koncentraciji od 10-1~{{33} } u jažice 96-ploče (50 µL po jažici). Svako razrjeđivanje je ponovljeno u 8 jažica; normalna ćelijska kontrola je postavljena u isto vrijeme, nakon čega je uslijedila kultura u trajanju od 96 h. Promjene u ćelijskom CPE-u promatrane su pod obrnutim mikroskopom. Normalna ćelijska kontrola ne bi trebala imati citopatske promjene, a pozitivna kontrola bi trebala imati CPE promjene. Krajnje tačke neutralizacije (razblaženja seruma pretvorena u logaritme) su izračunate posmatranjem CPE. Seronegativan/pozitivan kriterijum je bio 1:12 kao pozitivan/negativan kriterijum,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Test neutralizacije uživo

Aktivnost neutralizacije mišjeg seruma procijenjena je testom neutralizacije uživo. Razrijeđeni serum je pomiješan sa SARS-CoV-2 i inkubiran na 37 ◦C 1 h. Smjesa je dodana u 96-ploču sa jažicom da inficira Vero E6 ćelije. Nakon 72-h inkubacije na 37 ◦C, uočen je citopatski efekat virusa (CPE) pod povećanjem od ×40 i izračunat je titar neutralizacije (recipročno 50% razrjeđenja seruma potrebno za neutralizaciju virusne infekcije). Sve gore navedene procedure su sprovedene u okruženju sa nivoom biološke bezbednosti 3.

2.11. Statistička analiza

Statističke analize su obavljene t-testom dva uzorka koristeći SPSS 26. P-vrijednosti manje od ili jednake 0.05 smatrane su značajnim. Centralna tendencija je mjerena geometrijskim srednjim titrom (GMT).

3. Rezultati

3.1. Konstrukcija rekombinantnog adenovirusa

Dobijen je rekombinantni adenovirus šatl plazmid pAdeno-CMV-S1 sa ispravnom insercijom; dijagram njegove strukture je prikazan na slici 1. Rekombinantni adenovirus je sadržavao HAdV-C5 genom kojem nedostaje E1/E3 region. Šematski dijagram rekombinantnog adenovirusnog vektora dobijenog transfekcijom šatl plazmida i plazmida citoskeleta u ćelijama HEK293 prikazan je na slici 1.

3.2. Karakterizacija rekombinantnog adenovirusa

Rekombinantni plazmid koji sadrži ciljni gen identificiran je PCR-om (vidi sliku 2A za rezultate gel elektroforeze). Ovo je bio ponovljen eksperiment. Sekvence prajmera bile su MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag i S1-R acaataagtagggactgggtc, a sekvenciranje je potvrdilo da je sekvenca u skladu sa dizajnom. Ekspresija SARS-CoV-2 S1 u ćelijama otkrivena je Western blottingom (slika 2B) i indirektnom imunofluorescencijom (slika 2C). Boja trake (~75 kDa) je otkrivena Western blotingom i bila je u skladu sa očekivanom pozicijom trake. Na nivou transkripcije, in vitro ekspresija S1 je otkrivena pomoću PT-PCR. Rezultati su pokazali da je ekspresija S1 mRNA u HEK-293 ćelijama značajno veća nego u kontrolnoj grupi.

Slika 1. Konstrukcija rekombinantne adenovirusne vakcine i eksperimentalna strategija. (A) pAdeno-CMV-S1 je rekombinantni adenovirusni šatl plazmid koji sadrži ciljni gen S1. pBHGlox∆E1,3Cre je plazmid skeleta adenovirusa. pBHGlox∆E1,3Cre i pAdeno-CMV-S1 ekstrahovani su QIAGEN kompletom za ekstrakciju plazmida (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Peking, Kina). Dan prije transfekcije, ćelije HEK293 su pasirane u bocu za ćelijsku kulturu od 25 cm2. Podloga za kulturu je DMEM sa 5% FBS bez antibiotika. Drugog dana odabrano je 60-80% ćelija i ćelijama je dodan rastvor za transfekciju. Nakon 7 dana transfekcije, ćelije su ostrugane, centrifugirane, supernatant odbačen, a ćelije su oživljene sa PBS. Ćelije su više puta zamrznute-odmrznute na -80 ◦C i 37 ◦C. Nakon centrifugiranja, supernatant je sadržavao primarni rastvor virusa. Rekombinantni soj adenovirusa je pročišćen, amplificiran i dobiven nakon daljnje obrade i označen kao Ad-S1. Vakcina je ubrizgana intramuskularno u miševe radi naknadnih studija. (B) Prikazana vremenska skala imunizacije i uzimanja krvi.

3.3. Titar adenovirusa

U ovom eksperimentu izračunato je prosječno šest pozitivnih ćelija u pet mikroskopskih polja, a virus u jažici je razrijeđen 108 puta. Na osnovu formule opisane u odjeljku Materijali i metode, titar adenovirusa bio je 4,74 × 1011 jedinica koje formiraju plak (pfu)/mL (slika 2D).

3.4. Ćelijski imunitet nakon vakcinacije

Tokom perioda testiranja, došlo je do statistički značajnih promjena serumskih citokina (p manje od ili jednako 0.05), što je uglavnom pokazalo da je koncentracija kemoatraktanta keratinocita/onkogena reguliranog ljudskog rasta (KC/GRO) bila smanjene, a koncentracije IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } i TNF- su povećani, dok koncentracija IL-6 nije značajno promijenjena (slika 3).

Slika 2. Identifikacija rekombinantnog HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 proteina i određivanje titra adenovirusa. (A) PCR detekcija rekombinantnog plazmida sa ciljnim genom S1. (B) Western blot detekcija SARS-CoV-2. Ćelije HEK293 eksponencijalnog rasta su inficirane SARS-CoV-2 tokom 48 h, zatim je ćelijski protein ekstrahiran i odvojen pomoću SDS-PAGE. Ekspresija SARS-CoV-2 potvrđena je Western blotingom sa kozjim anti-zečjim IgG. (C) Imunofluorescentna mikroskopija HEK-293 ćelija inficiranih Ad-S1 (zeleno). Ćelije su obojene sa 40, 6-diamidino- 2-fenilindolom (DAPI) za bojenje jezgara. Skala bar 1000 µm. (D) Test plaka je korišten za mjerenje. Mikrografije koje prikazuju razrjeđenje 10-5, 10-6, 10-7 i 10-8 (s lijeva na desno).

Slika 3. Ad-S1 inducirao je promijenjene nivoe citokina tipa 1/2 u plazmi, interferona tipa 1 i drugih citokina. Rezultati su otkriveni vađenjem krvi od miševa 7 dana nakon prve imunizacije. Podaci su predstavljeni kao dijagrami raspršene kutije i brkova. Svaki krug predstavlja jednu individuu. p-vrijednosti su izračunate pomoću t-testa sa dva uzorka.

3.5. Detekcija anti-SARS-CoV-2 S1 antitijela nakon imunizacije

ELISA je otkrila da su SARS-CoV-2-specifična antitijela bila prisutna kod miševa kojima je ubrizgan prvi i drugi Ad-S1, ali ne i oni kojima je ubrizgan kontrolni adenovirusni kapsid ili otopina PBS (Ad/PBS) (slika 4A). IgG titri 1:210 i 1:212 otkriveni su kod Ad-S{10}}vakcinisanih miševa dvije sedmice nakon prve i druge imunizacije. Titar razblaženja 28 dana nakon vakcinacije (D28, GMT 2297,4) bio je 61-puta veći od onog na D14 (GMT 378,9).

Slika 4. Ad-S1 inducirao je visoke titre antitela (A) i aktivnosti neutralizacije (B, C) kod miševa. (A) ELISA SARS-CoV-2-specifičnog seruma IgG od Ad-S1-imuniziranih miševa. (B) Analiza aktivnosti pseudovirusa seruma Ad-S{8}}imuniziranih miševa. (C) Analiza neutralizacijskih aktivnosti seruma Ad-S{10}}imuniziranih miševa

3.6. Analiza neutralizirajućih antitijela

SARS-CoV-2 izazivanje ćelija Vero E6 omogućilo je otkrivanje neutralizirajuće aktivnosti u imuniziranom mišjem serumu (Slika 4B, C). Titri neutralizacije D14 i D28 Ad-S1-imuniziranih Vero E6 ćelija protiv SARS-CoV{{10}} izazova živim virusom in vitro bili su 1:24,3 odnosno 1:26,3. Test pseudovirusa dao je slične rezultate kao i test na živi virus, sa titrima neutralizacije do 1:28,1 i 1:29,6 na D14 i D28, respektivno. Titar za neutralizaciju pseudovirusa D28 (GMT 769.0) bio je 27-put veći od onog kod D14 (GMT 283.7).

4. Diskusija

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 to<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

U ovoj studiji smo konstruirali rekombinantnu adenovirusnu SARS-CoV-2 vakcinu koja sadrži SARS-CoV-2 S1 podjedinicu i nazvali je Ad-S1. Kao i CanSinoBIO, koji je odobren za marketing [28], koristili smo HAdV-C5 u ovoj vakcini. Adenovirus se široko koristi u rekombinantnoj genskoj terapiji i kao vektor vakcine. Međutim, seropozitivna stopa HAdV-C5 je čak 75-80% u normalnoj populaciji [29]. To implicira da imunitet prije skladištenja protiv vektora HAdV-C5 značajno smanjuje imunitet izazvan vakcinom. Razvijen na Univerzitetu Oxford u Ujedinjenom Kraljevstvu, ChAdOx1 nCoV-19 koristi vektor adenovirusa čimpanze koji, nasuprot tome, ima nižu stopu seropozitivnosti kod ljudi, a kada je pozitivan, obično ima niži titar antitijela u serumu [30] . Stoga se vektori adenovirusa koji mogu izbjeći već postojeći imunitet mogu istražiti kako bi se poboljšala zaštitna učinkovitost vakcine protiv adenovirusa. U ovoj studiji, serumski status miševa prije i nakon imunizacije određen je ELISA i neutralizacijskim testovima i dao je dokaz o humoralnom imunitetu za kandidate za vakcinu. Serum proizveden nakon intramuskularne injekcije vakcine kod miševa efikasno je štitio ćelije Vero E6 od infekcije SARS-CoV-2 in vitro (Slika 4). Također smo otkrili jači imunološki odgovor i bolju zaštitu kod miševa nakon druge imunizacije (Slika 4). Naši eksperimentalni rezultati su slični uobičajenim eksperimentalnim rezultatima.

Kako se istraživanja SARS-CoV-2 nastavljaju, nekoliko studija je pokazalo da citokinska oluja koja je posljedica infekcije SARS-CoV-2 može utjecati na proizvodnju T-ćelija, što otežava pacijentima da održe dugotrajni imunitet na SARS-CoV{7}} [31]. Stoga je neophodno utvrditi može li Ad-S1 inducirati imunitet posredovan T-ćelijama kod miševa. Naši rezultati su pokazali da su se koncentracije IFN- i IL-12 povećale, a koncentracije IL-4 smanjile u Ad-S1 grupi, što ukazuje na preživljavanje i rast Th1 ćelija izazvanih vakcinom kod miševa. Sekrecija IL-12, IL-10 i TNF-a od strane Th1 ćelija je blago povećana u eksperimentalnoj grupi. Ovi rezultati su pokazali da je Ad-S1 efektivno inducirao Th{26}}pristrasan odgovor T-ćelija kod miševa [32]. Povećani IL-5 ukazuje da Th2 ćelije također učestvuju u imunološkom odgovoru i proizvode određene efekte. Koncentracija KC/GRO u eksperimentalnoj grupi bila je značajno smanjena u odnosu na PBS kontrolnu grupu, što je moglo biti posljedica smanjene kemotakse neutrofila koja je potisnula upalni odgovor i omogućila da se nuspojave cjepiva malo kontroliraju. Ovo bi bilo korisnije za imunokompromitovane osobe, kao što su starije osobe ili pacijenti koji se podvrgavaju kemoterapiji. Li M., et al. [29] razvili su vakcinu protiv adenovirusa koristeći Ad68 kao vektor. Rezultati su pokazali da se in vivo neutralizujuća aktivnost SARS-CoV-2 može otkriti u roku od dvije sedmice nakon intramuskularne imunizacije BALB/c miševa, a zatim nastaviti da raste, a titar neutralizacijskih antitijela (PRNT ID50) dostigao je 957,3 u osam sedmice. U međuvremenu, u studiji Liu J., et al. [33], razvijene su vakcine koje koriste AdC6 i AdC68 kao vektore; Odgovori na vezivanje i neutraliziranje antitijela nakon imunizacije su generirani 14 dana nakon doze, sa titrom IgG od 7108 (geometrijski srednji titar, GMT; AdC6) i 5489 (GMT, AdC68). Titar neutralizacije 50 (NT50) testa neutralizacije pseudovirusa bio je 125 (GMT, AdC6) i 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

U ovoj studiji, miševi vakcinisani sa Ad-S1 imali su IgG titar od 1:1010 i 1:122 detektovan ELISA testom dve nedelje nakon prve i druge imunizacije, respektivno. Titar razblaženja ad-s1 bio je 378,9 (GMT) 14 dana nakon inokulacije i 2297,4 (GMT) 28 dana nakon inokulacije. U testu neutralizacijskih antitijela, Vero E6 ćelije imunizirane Ad-S1 pokazale su neutralizaciju 1:24,3 i 1:26,3 na D14 i D28 protiv živog SARS-CoV-2 izazova virusom in vitro, respektivno. Titri neutralizacije pseudovirusa na D14 i D28 bili su 283,7 (GMT) i 769,0 (GMT), respektivno. Stoga je vakcina u ovoj studiji bila efikasnija u smislu imunološkog odgovora na modelu miša.

Zbog ograničenja eksperimentalnih uslova, nismo radili enzimski vezanu imunosorbentnu tačku (ELISpot) analizu imunoloških ćelija slezene eksperimentalnih miševa. Štaviše, eksperimenti zaštite od napada SARS-CoV-2 na miševima nisu mogli biti izvedeni zbog ograničenja laboratorija za fizičku zaštitu. Međutim, utvrdili smo da je vakcina imala visoku efikasnost na mišjim modelima i da se može koristiti kao idealan rezervni soj vakcine. Osim toga, imunogenost, sigurnost i djelotvornost potencijalnih kandidata za vakcinu protiv SARS-CoV-2 treba ispitati na dodatnim životinjskim modelima (npr. zečevi, primati, rakuni, psi), jer modeli miša možda neće u potpunosti duplirati ljudske imunološke karakteristike.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

5. Zaključci

Podaci dobijeni iz naših pretkliničkih studija adenovirusne vakcine pokazali su da vakcina ima dovoljnu sigurnost i efikasnost. Stoga bi to mogla biti obećavajuća i izvodljiva profilaktička vakcina protiv SARS-CoV-2 infekcije.

Reference

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Uvid u životni ciklus SARS-CoV-2, patofiziologiju i racionalizirane tretmane koji ciljaju na kliničke komplikacije COVID-19. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, TS Gen mjeseca: 2019-nCoV/SARS-CoV-2 novi korona virus spike protein. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366–369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regresija raka pluća kod miševa intranazalnim davanjem SARS-CoV-2 Spike S1. Rakovi 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, pandemija korona virusa: molekularni i strukturni uvidi. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180–202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Strukturne karakteristike korona virusa SARS-CoV-2 spike proteina: mete za vakcinaciju. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Zidovi, klima; mr Tortorici; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glikanski štit i maskiranje epitopa proteina korona virusa uočeno krioelektronskom mikroskopijom. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2016, 23, 899–905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 je superiorniji od RBD kao antigen vakcine podjedinice COVID-19. J. Med. Virol. 2021, 93, 892–898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Budite svjesni SARS-CoV-2 šiljastog proteina: Ima više nego što se na prvi pogled čini. J. Biol. Regular. Homeost. Agents 2021, 35, 833–838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Sistemski i mukozni imunitet kod miševa izazvan jednom imunizacijom humanim adenovirusom tipa 5 ili 41 vektorskim vakcinama koje nose šiljasti protein koronavirusa bliskoistočnog respiratornog sindroma. Imunologija 2015, 145, 476–484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. Najmodernija vektorologija humanog adenovirusa za terapijske pristupe. FEBS Lett. 2019, 593, 3609–3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Efikasnost i sigurnost vakcina protiv COVID-19: sistematski pregled. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221–228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, PM; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Sigurnost i efikasnost vakcine ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) protiv SARS-CoV-2: privremena analiza četiri randomizirana kontrolirana ispitivanja u Brazilu, Južnoj Africi i Velikoj Britaniji. Lancet 2021, 397, 99–111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analiza zaštitne efikasnosti odobrenih vakcina protiv COVID-19 vakcina protiv različitih mutanata. Front. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalın, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Efikasnost i sigurnost inaktivirane vakcine SARS-CoV-2 sa cijelim virionom (CoronaVac): privremeni rezultati dvostruko slijepog, randomiziranog, placebom kontroliranog ispitivanja faze 3 u Turskoj. Lancet 2021, 398, 213–222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Sigurnost i imunogenost inaktivirane SARS-CoV-2 vakcine, BBIBP-CorV: randomizirano, dvostruko slijepo, placebo kontrolirano ispitivanje faze 1/2. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39–51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; On, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Sigurnost i imunogenost rekombinantne tandem-ponavljajuće dimerne proteinske podjedinice vakcine na bazi RBD (ZF2001) protiv COVID-19 kod odraslih: dva randomizirana, dvostruko slijepa, placebom kontrolirana, faza 1 i 2 ispitivanja. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107–1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Indijska DNK vakcina protiv virusa COVID-19 je prva na svijetu, dolazi još više. Nature 2021, 597, 161–162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Ciljevi odgovora T ćelija na SARS-CoV-2 Coronavirus kod ljudi sa bolešću COVID-19 i neeksponiranih pojedinaca. Cell 2020, 181, 1489–1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Snažna neutralizirajuća antitijela protiv SARS-CoV-2 identificirana visokopropusnim jednoćelijskim sekvenciranjem B ćelija rekonvalescentnih pacijenata. Cell 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vakcine: Izvještaj o stanju. Imunitet 2020, 52, 583–589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. Nova formula DNK i proteina kombinacije COVID-19 vakcine pruža potpunu zaštitu od SARS-CoV-2 kod rezus makaka. Emerg. Mikrobi inficiraju. 2021, 10, 342–355. [CrossRef]

22. Du, L.; On, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Šiljasti protein SARS-CoV – meta za vakcinu i terapijski razvoj. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226–236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-terminalno skraćeni nukleokapsidni protein SARS-CoV-2 kao bolji serološki marker od cijelog nukleokapsidnog proteina u procjeni imunogenosti inaktiviranog SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732–1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentles, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD Vakcina SARS-CoV-2 mRNA-1273 izaziva neutralizaciju koja je više fokusirana na RBD, ali sa širim vezivanjem antitijela unutar RBD-a. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Procjena ćelijskih i seroloških odgovora na akutnu SARS-CoV-2 infekciju pokazuje funkcionalnu važnost domene za vezivanje receptora. J. Immunol. 2021, 206, 2605–2613. [CrossRef]

26. He, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Receptor-vezujući domen SARS-CoV šiljastog proteina inducira vrlo moćna neutralizirajuća antitijela: Implikacija za razvoj podjedinične vakcine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324, 773–781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Razvoj i primjena virusne vektorske vakcine tokom pandemije COVID{1}}. Mikroorganizmi 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Imunogenost i sigurnost rekombinantnog adenovirusnog tipa-5-vektorske vakcine protiv COVID-19 kod zdravih odraslih osoba u dobi od 18 godina ili više: randomizirano, dvostruko slijepo, placebom kontrolirano ispitivanje faze 2. Lancet 2020, 396, 479–488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Imunizacija jednom dozom vakcinom baziranom na adenovirusu šimpanze izaziva trajni i zaštitni imunitet protiv SARS-CoV-2 infekcije. Front. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Razvoj novih vektora vakcine: adenovirusni vektori šimpanze. Hum. Vaccines Immunother. 2018, 14, 1679–1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Gubitak Bcl-6-ekspresirajućih T folikularnih pomoćnih ćelija i germinalnih centara u COVID-19. Cell 2020, 183, 143–157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- i IL-12 sinergiziraju za pretvaranje in vivo generiranih Th17 u Th1/Th17 ćelije. EUR. J. Immunol. 2010, 40, 3017–3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; An, Y.; Li, J.; Gao, P.; et al. Heterologna prime-boost imunizacija adenovirusnim vektorima čimpanze izaziva snažan i zaštitni imunitet protiv infekcije SARS-CoV-2. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]