Acilirani feniletanoidni oligoglikozidi s hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljke Cistanche Tubulosa

za više informacija:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa i dr

Abstract

Metanolni ekstrakt iz svježih stabljikaCistanche tubulosaUtvrđeno je da (Orobanchaceae) pokazuje hepatoprotektivne efekte protiv D-galaktozaminom (D-GalN)/lipopolisaharidom (LPS) indukovane povrede jetre kod miševa. Iz izvoda tri novafeniletanoidoligoglikozidi, kankanozidi H1 (1), H2 (2) i I(3), izolovani su zajedno sa 16feniletanoidni glikozidi(4–19) i dva acilirana oligošećera (20,21). Strukture 1-3 su određene na osnovu spektroskopskih svojstava, kao i hemijskih dokaza. Među izolatima, ehinakozid (4, IC50=10.2 lM), akteozid (5, 4,6 lM), izoakteozid (6,5,3 lM), 20-acetilakteozid (8, 4,8 lM) i tubulozid A (10, 8,6 lM) je inhibirao smrt hepatocita izazvanu D-GalN. Ovih pet izolata, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) i 10 (23,2 lM), i cistantubulozid B1 (11, 21,4 lM) takođe smanjuju TNF-a- indukovana citotoksičnost u L929 ćelijama. Štaviše, glavni sastojci (4-6) su pokazali in vivo hepatoprotektivne efekte u dozama od 25-100 mg/kg, PO.

Click to cistanche nuspojave i Cistanche proizvodi

1. Uvod

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je višegodišnja parazitska biljka koja raste na korijenu Salvadora ili Calotropisspecies, a rasprostranjena je u Sjevernoj Africi, Arabiji i azijskim zemljama.2StabljikaCistanche tubulosakao i pomoćna salsa i Cistanche deserticolah tradicionalno su se koristile za liječenje impotencije, steriliteta, lumbaga i tjelesne slabosti, kao i sredstvo za poticanje cirkulacije.2,3 Ranije je nekolikofeniletanoids, iridoidi, monoterpeni i lignani izolovani su iz Kine i PakistanaCistanche tubulosa.2,4–9 U toku naših studija karakterizacije bioaktivnih sastojaka u ovom prirodnom lijeku, prethodno smo objavili da pet iridoida, kankanozida A–D i kankanola, monoterpeneglikozida, kankanozida E, dvafeniletanoidoligoglikozidi, kankanozidi F i G (23) i acilirani oligošećer, kankanoza(21), izolovani su iz metanolnog ekstrakta osušenih stabljikaCistanche tubulosa.10,11 Pored toga, otkriveno je da metanolni ekstrakt i nekoliko izolata kao što su ehinakozid (4), akteozid (5), cistanozid F (20), 21 i kankanozid F pokazuju vazorelaksante efekte, odnosno inhibitorne efekte na kontrakcije izazvane noradrenalinom u izolovanoj torakalnoj aorti štakora.11 U našim kontinuiranim studijama o sastojcima u biljci, metanolni ekstrakt svježih stabljikaCistanche tubule je biootkriveno je da pokazuje zaštitni učinak na ozljedu jetre uzrokovanu D-galaktozaminom (D-GalN)/lipopolisaharidom (LPS) kod miševa. Iz metanolnog ekstrakta izdvojili smo tri novafeniletanoidoligoglikozidi pod nazivom kankanozidi H1 (1), H2 (2) i I (3) zajedno sa 16 feniletanoidnih glikozida (4–19) i dva acilirana oligošećera (20, 21). Ovaj rad se bavi izolacijom i strukturalnim rasvjetljavanjem ovih novihfeniletanoidoligoglikozidi (1-3). Strukturni zahtjevi feniletanoidnih glikozida za hepatoprotektivnu aktivnost su također razmatrani (slika 1)

2. Rezultati i diskusija

2.1. Zaštitni efekat metanolnog ekstrakta iz stabljikeCistanche tubulosao ozljedi jetre izazvanoj D-GalN/LPS kod miševa

Svježe stabljikeCistanche tubulosa(uzgajane u Urumqiju, provincija Xinjiang, Kina) ekstrahovane su metanolom pod refluksom da bi se dobio metanolni ekstrakt (8,36 procenata iz svežih stabljika). Kao što je prikazano u tabeli 1, u dozama od 250-500 mg/kg, PO, metanolni ekstrakti su pokazali inhibitorni efekat na povećanje serumske aspartat amino transaminaze (sAST) i alanin aminotransaminaze (sALT), markera oštećenja jetre, izazvanih D- GalN/LPS kod miševa.

2.2. Hemijski sastojci iz stabljikaCistanche tubulosa

Metanolni ekstrakt iz svježih stabljikaCistanche tubulosaje podvrgnut Diaion HP-20 kolonskoj hromatografiji (H2O?MeOH) da bi se dobile H2O- i MeOH-eluirane frakcije (5,63 posto i 2,73 posto, respektivno). Frakcija eluirana sa MeOH je podvrgnuta SiO2 i ODScolumn hromatografiji i konačno HPLC da bi se dobile tri novefeniletanoidoligoglikozidi, kankanozidi H1 (1, 0.0008 posto), H2 (2, 0,0001 posto), i I (3, 0,0007 posto) zajedno sa 16feniletanoidni glikozidi, echinacoside2,11 (4, 0.45 posto ), acteoside2,11 (5, 0.28 posto), izoacteoside2,11 (6, 0.0 41 posto), cis-akteozid12,13 (7, 0.0007 posto), 20-acetilakteozid2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}38 posto ), dekafeoilakteozid14 (9, 0.0002 posto ), tubulo strana A2,11 (10, 0.013 posto), cistantubulozid B19 (11, 0,0020 posto), B29 (12,0,0003 posto), arenarioside15 (13, 0,0006 posto), videmaninozid C16 (14,0,0008 posto), cistantubulozid A9 (15, 0,0009 posto), siringalid A 30-OaL ramnopiranozid4 (16, 0,0017 posto), kampneozidi I17,18 i 18,18 (II, 117 posto) , 0,0005 posto), i salidrozid11 (19, 0,0027 posto), i dva acilirana oligošećera, cistanozid F11 (20, 0,0004 posto) i kankanoza11 (21, 0,0004 posto).

2.3. Strukture kankanozida H1 (1), H2 (2) i I (3)

Kankanozid H1 (1) je dobijen kao bijeli prah sa negativnom optičkom rotacijom (½a-24D-45.3 u MeOH). Njegov IR spektar je pokazao apsorpcione trake na 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70 i 1040 cm 1 koje se mogu pripisati hidroksilima, esterskim funkcijama karbonila, i aromatičnim prstenovima. FABMS spektri pozitivnih i negativnih jona od 1 pokazali su pikove kvazimolekularnih jona na m/z 835(M plus Na) plus i m/z 811 (MH), respektivno, a molekulska formula je određena kao C37H48O20 pomoću pozitivne rezolucije visoke rezolucije ion FABMS mjerenje. 1H i 13C NMR spektri 1 (CD3OD, tabele 2 i 3), koji su dodeljeni različitim NMR eksperimentima,19 su pokazali signale koji se mogu pripisati dva metilena [d 2,70(2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H svaki, oba m, H2-8)], orto- i meta-spregnuti aromatični protoni ABC tipa [d 6,52 (1H, dd, J=1.8,7,8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{62 }})], dva bD-glukopiranozil ostatka [d 4.29 (1H, d, J=7.8 Hz, terminal-Glc-H-1), 4.54 (1H, d, J {{76 }}.2 Hz, unutrašnji-Glc-H-1)], i aa-L-ramnopiranozilni dio [d 1.06 (3H, d, J=6.0 Hz, Rha-H{{89 }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] zajedno sa acetil grupom [d 1,98(3H, s)] i trans-p-kumaroil grupom {trans-olefin [d 6,34,7,67 (1H svaki, oba d, J=16.0 Hz, H-8 i 7)] i orto-spregnuti aromatični protoni tipa A2B2- [d 6,80, 7,46 (2H svaki , oba d,J=8.7 Hz, H-3,5 i 2,6)]}. Povezanost između oligoglikozidnih i acilnih dijelova u 1 okarakterisana je HMBC eksperimentom, koji je pokazao dugotrajne korelacije između sljedećih protonskih i ugljičnih parova: unutrašnji-Glc-H-1 i C-8 (dC71.9 ); unutrašnji-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-like)] i acetil karbonilugljenik (dC 171,4); unutrašnji-Glc-H-4 [d 5.08 (1H, dd, J=9.6, 9.6 Hz)] i p-kumaroil karbonil ugljenik (dC 168.2); Rha-H-1 i unutrašnji-Glc-C-3 (dC 80,5); i terminal-Glc-H-1 i unutrašnji-Glc-C-6 (dC69.3) (slika 2). Konačno, alkalna hidroliza 1 sa 5 procenata kalijum hidroksida (KOH) oslobađa trans-p-kumarinsku kiselinu, koja je identifikovana HPLC analizom, zajedno sa deaciliranim proizvodom. Deacilirani proizvod je sukcesivno tretiran sa 1,0 M hlorovodoničnom kiselinom (HCl) da bi se oslobodila L-ramnoza i D-glukoza, koji su identifikovani HPLC analizom pomoću optičkog detektora rotacije.10,11 Dakle, struktura kankanozida H1 je razjašnjena {{181 }}(3,4-dihidroksi fenil)etil OaL-ramnopiranozil-(1- 3)-[bD-glukopiranozil-(1-6)]-2-O-acetil{{196 }}O-trans-p-kumaroil-bD-glukopiranozid (1).

Kankanozid H2 (2) je izolovan kao bijeli prah sa negativnom optičkom rotacijom (½a 25 D 52,4 u MeOH). Utvrđeno je da je njegova molekularna formula C37H48O20 ista kao kod 1 FABMS mjerenjem pozitivnih jona visoke rezolucije. Spektroskopska svojstva 2 su bila vrlo slična onima kod 1, osim za signale zbog cis-p-kumaroil grupe [d 5.79, 6.95 (1H svaki, oba d, J=12.8 Hz, H{{ 22}} i 7), 6,76, 7,73 (po 2H, oba d, J=8.7 Hz, H-3,5 i 2,6)]. Nadalje, HMBC eksperiment na 2 je također otkrio slične načine korelacije dugog dometa kao oni otkriveni za 1 između sljedećih protonskih i ugljičnih parova: unutrašnji-Glc-H-1 [d 4.51 (1H, d, J {{44 }}.8 Hz)] i C-8 (dC 72.0); unutrašnji-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] i acetil karbonil ugljenik (dC 171,4); unutrašnji-Glc-H-4 [d 4.98 (1H, dd, J=9.6, 9.7 Hz)] i p-kumaroil karbonil ugljenik (dC 166.7); Rha-H-1 [d 4.77 (1H, d, J=1.4 Hz, Rha-H-1)] i unutrašnji-Glc-C-3 (dC 80.7 ); i terminal-Glc-H-1 [d 4.28 (1H, d, J=7.8 Hz)] i unutrašnji-Glc-C-6 (dC 69.4) (slika 2) . Studijom razgradnje, 2 je dalo cis-p-kumarinsku kiselinu i dva ista šećera kao ona dobijena u slučaju 1. Kao posljedica toga, razjašnjeno je da je struktura kankanozida H2 2-(3,4- dihidroksi fenil)etil OaL-ramnopiranozil-(1-3)- [bD-glukopiranozil-(1-6)]-2-O-acetil-4-O-cis-p-kumaroil- bD-glukopiranozid (2).

Kankanozid I (3) je također izolovan kao bijeli prah sa negativnom optičkom rotacijom (½a- 25D-62.2 u MeOH). Njegova molekularna formula, C35H46O18, određena je pozitivnim i negativnim FABMS i HRFABMS mjerenjima. Spektroskopska svojstva 3(CD3OD, tabele 2 i 3) su bila superponirana na one ehinakozida (4), osim za signale zbog aglikonskog dijela {{dva metilena {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J=16.9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monosupstituisani aromatični protoni [d7.18 (1H, m, H-4), 7.26–7.28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alkalna hidroliza 3 sa 5 posto KOH oslobodila je trans-kafeinsku kiselinu, a deacilirani proizvod je sukcesivno tretiran sa 1,0 M HCl da bi se oslobodila L-ramnoza i D-glukoza. Konačno, veze acilne grupe i šećera u 3 su razjašnjene HMBC eksperimentom, kao što je prikazano na slici 2. Na osnovu gore navedenih dokaza, razjašnjeno je da je struktura kankanozida I 2-feniletil OaL- ramnopiranozil-(1-3)-[bD-glukopirano-sil-(1-6)]-4-O-trans-kafeoil-bD-glukopiranozid (3)

2.4. Učinci kemijskih sastojaka iz stabljike Cistanche tubulosa na citotoksičnost izazvanu D-GalN u primarno kultiviranim hepatocitima miša

Poznato je da D-GalN/LPS-indukovana povreda jetre razvija imunološke odgovore.19 Izvještava se da se ova vrsta ozljede jetre javlja u dva oblika. Prvo, osjetljivost na TNF-a smanjenjem količine ofuridin trifosfata u hepatocitima povećava se D-GalN. Drugo, proinflamatorni medijatori, kao što su NO i TNF-a, oslobađaju se iz makrofaga aktiviranih LPS (Kupfferove ćelije). Izvještava se da apoptoza hepatocita TNF-a ima važnu ulogu u D-GalN/LPS-induciranoj ozljedi jetre.20

U našim prethodnim studijama o hepatoprotektivnim jedinjenjima iz prirodnih lijekova, izvijestili smo da nekoliko sastojaka iz Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia31astatica reticula,30 hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 i Piper chaba42,43 su pokazali efekte na lipama u PS-u. kod miševa i/ili platyphylla var. japonica,29 Pisum inhibitorni efekat na D-GalN-indukovanu citotoksičnost u primarnim kultivisanim hepatocitima. Budući da je metanolni ekstrakt iz stabljikaCistanche tubulosapokazao hepatoprotektivne efekte na oštećenje jetre izazvano D-GalN/LPS-om kod miševa (vide ante), inhibitorni efekat sastojaka na D-GalN-indukovanu citotoksičnost u primarno kultivisanim hepatocitima miševa ispitan je pomoću 3-(4,{ {6}}dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid (MTT) test. Kao što je prikazano u tabeli 4, ehinakozid (4, IC50=10.2 lM), akteozid (5, 4,6 lM), izoaceteozid (6, 5,3 lM), 20-acetilakteozid (8, 4,8 lM), Tubulozid A (10,8,6 lM) i B11 (22, 14,6 lM) i kankanozid G11 (23, 14,8 lM) su pokazali jaku aktivnost. Njihove aktivnosti su bile veće od aktivnosti komercijalnog silibina (38,8 lM),33–43 kao pozitivne kontrole.44,45 Strukturni zahtjevifeniletanoidni glikozidi for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) aglikon koji ima 3,4-dihidroksi grupu pokazao je jaču aktivnost od onog koji ima 4-hidroksi grupu (6 > 23); (3) 60-ObD-glukopiranozilni dio je smanjio aktivnost (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" 8-obd-glukopiranozil="" dio="" koji="" ima="" 40-o-kafeoilnu="" grupu="" pokazao="" je="" jaču="" aktivnost="" od="" onog="" koji="" ima="" 60-o-kafeoilnu="" grupu="" (5="6," 8=""> 22 ); i (5) uvođenje 20-O-acetil grupe smanjilo je aktivnost (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, podaci nisu prikazani). Tako je utvrđeno da ova jedinjenja ne utiču na prekomernu proizvodnju NO i TNF-a iz makrofaga aktiviranih LPS.

2.5. Učinci kemijskih sastojaka na citotoksičnost izazvanu TNF-a u L929 stanicama

Kako bi se razjasnili efekti sastojaka na osjetljivost hepatocita na TNF-a, TNF-a-indukovano smanjenje vijabilnosti ćelija L929, TNF-a-osjetljiva ćelijska linija,48 ispitana je pomoću MTT testa. Bez testnih uzoraka, vitalnost ćelija je smanjena na ca. 60 posto nakon inkubacije ćelija sa 20 ng/mL TNF-a tokom 44 h u poređenju sa slučajem bez TNF-a. Kao što je prikazano u tabeli 5, ehinakozid (4, IC50=31.1 lM), akteozid (5, 17,8 lM), izoaceteozid (6, 22,7 lM), 20-acetilakteozid (8, 25,7 lM), tubulozid A (10,23,2 lM) i cistantubulozid B1 (11, 21,4 lM) inhibirali su smanjenje vijabilnosti ćelija, a njihova aktivnost je bila veća od aktivnosti piperina42,43 i silibina. Strukturni zahtjevifeniletanoidni glikozidi for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; i (5) uvođenje 20-O-acetil grupe smanjilo je aktivnost (8 < 5,="" 22="">< 6).="" nađeno="" je="" da="" su="" ovi="" zahtjevi="" slični="" onima="" uočenim="" u="" prethodnom="" poglavlju="" u="" vezi="" sa="" inhibitornim="" efektima="" na="" d-galn-indukovanu="" citotoksičnost="" u="" primarno="" uzgojenim="" hepatocitima="">

Ovi in ​​vitro nalazi ukazuju na sljedeće moguće mehanizme djelovanja za hepatoprotektivni učinak sastojaka stabljikeCistanche tubulosa: (i) smanjenje citotoksičnosti izazvane D-GalN (4-6, 8, 10, 22 i 23) i (ii) smanjenje citotoksičnosti izazvane TNF-a (4-6, 8, 10 i 11) .

2.6. Zaštitni efekti ehinakozida (4), akteozida (5) i izoakteozida (6) protiv oštećenja jetre izazvanih D-GalN/LPS miševima i njihov način djelovanja

Na kraju, ispitali smo efekat principalafeniletanoidni glikozidi, ehinakozid (4), akteozid (5) i izoakteozid (6) na D-GalN/LPS-indukovanu ozljedu jetre kod miševa. Kao što je prikazano u tabelama 6 i 4-6, značajno je inhibirao povećanje sAST i sALT izazvano D-GalN/LPS kod miševa u dozama od 25-100 mg/kg, PO. S druge strane, 4-6 nije utjecao na prekomjernu proizvodnju TNF-a iz LPS-aktiviranih makrofaga. Nadalje, 4-6 značajno inhibira smrt L929 ćelija uzrokovanu TNF-a, što ukazuje na smanjenje osjetljivosti L929 ćelija na TNF-a (vide ante). Ovi nalazi sugeriraju da 4-6 smanjuju osjetljivost ovih stanica na citotoksičnost izazvanu TNF-a. Prijavljena su mnoga jedinjenja koja inhibiraju ćelijsku smrt izazvanu D-GalN i proizvodnju TNF-a,24,26,32, ali je prijavljeno nekoliko jedinjenja koja selektivno smanjuju osetljivost hepatocita na TNF-a.42,43,49,50

U zaključku, od svježih stabljikaCistanche tubulosa, tri novafeniletanoidni glikozidi, kankanozidi H1 (1), H2 (2) i I (3) zajedno sa 16 poznatihfeniletanoidni glikozidi(4–19) i dva acilirani oligošećeri (20, 21) su izolovani. Strukturni zahtjevi za njihov zaštitni učinak na ozljedu hepatocita izazvanu D-GalN, i citoprotektivni efekti na L929 ćelije uzrokovane TNF-a bili su sljedeći; (1) aglikonski dio je bio neophodan za aktivnost; (2) aglikon koji ima 3,4-dihidroksi grupe pokazao je jaču aktivnost od onog koji ima 4-hidroksi grupu; (3) 60-ObD-glukopiranozil dio je smanjio aktivnost; (4) 8-ObD-glukopiranozil dio koji ima 40-O-kafeoilnu grupu pokazao je jaču aktivnost od onog koji ima 60-O-kafeoilnu grupu; i (5) uvođenje {{27 }}O-acetilni dio smanjio je aktivnost. Nadalje, glavnifeniletanoidni glikozidi, ehinakozid(4), akteozid (5) i izoakteozid (6), inhibirali su povećanje insAST-a i sALT u dozama od 25-100 mg/kg PO kod miševa tretiranih D-GalN/LPS, a sugerirano je da su ti inhibitorni efekti ovisno o smanjenoj osjetljivosti hepatocita na TNF-a. Detaljni mehanizmi djelovanjafeniletanoidni glikoziditreba dalje proučavati.

3. Eksperimentalno

3.1. Generale

Za dobijanje spektralnih i fizičkih podataka korišteni su sljedeći instrumenti: specifične rotacije, Horiba SEPA{0}} digitalni polarimetar (l=5 cm); UV spektri, Shimadzu UV-1600 spektrometar; IR spektri,Shimadzu FTIR-8100 spektrometar; 1H i 13C NMR spektri, JEOLJNM-ECA600 (600 i 150 MHz) i JEOL JNM-ECS400 (400 i 100 HMz) spektrometri sa tetrametilsilanom kao internim standardom; FABMS i FABMS visoke rezolucije, JEOL JMS-SX 102A maseni spektrometar; HPLC detektor, Shimadzu RID-10A indeks loma, Shimadzu SPD-10A UV-vis, i Shodex OR-2 optički detektori rotacije. HPLC kolona, ​​Cosmosil 5C18-MS-II, i pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) i (250 - 20 mm id) kolone su korištene u analitičke i preparativne svrhe.

Za hromatografiju su korišteni sljedeći eksperimentalni uslovi: hromatografija na koloni silika gela normalne faze (CC), silika gel 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 mreža, sferna, neutralna ); reverzno-fazni silika gel CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) i Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); TLC normalne faze, prethodno obložene TLC ploče sa silika gelom 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC reverzne faze, prethodno obložene TLC ploče sa silika gelom RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC reverzne faze, prethodno obložene TLC ploče sa silika gelom RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekcija je postignuta prskanjem sa 1 posto Ce(SO4)2–10 posto vodenog H2SO4, nakon čega je uslijedilo zagrijavanje .

3.2. Biljni materijal

Svježe stabljikeCistanche tubulosauzgajane u Urumqiju, provincija Xinjiang, Kina, sakupljene su u septembru 2007. Biljni materijal je identificirao jedan od autora (MY). Vaučer za biljni materijal nalazi se u našoj laboratoriji.

3.3. Ekstrakcija i izolacija

Svježe stabljikeCistanche tubulosa(2,98 kg) su fino isječeni i ekstrahirani tri puta metanolom pod refluksom 3 h. Isparavanje rastvarača pod sniženim pritiskom dalo je metanolni ekstrakt (249,1 g, 8,36 procenata). Metanolni ekstrakt je podvrgnut Diaion HP 20 CC (5.0 kg, H2O?MeOH) da bi se dobile H2O- i MeOH-eluirane frakcije (167,84 g, 5,63 posto i 81,21 g, 2,73 posto , odnosno). Frakcija eluirana MeOH (61.00 g) podvrgnuta je normalnoj fazi silika gela CC[1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] da se dobije sedam frakcija [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) i 7 (4,60 g)]. Frakcija 2 (9,56 g) je odvojena silika gelom reverzne faze CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?aceton] da bi se dobilo pet frakcija [Fr. 2–1 (55,9 mg), 2–2 (4,48 g), 2–3 (3,42 g), 2–4 (1,16 g) i 2–5 (31,9 mg)]. Frakcija 2–3 (1.00 g) je podvrgnuta HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (7:93, v/ v)] dati sedam razlomaka [Fr. 2–3–1 (66,5 mg), 2–3–2 (20.4 mg), 2–3–3 (26.0 mg), 2–3–4 (136,6 mg), 2–3–5 (38{{300}}.6 mg), 2–3–7 (84,9 mg)]. Frakcija 2–3–4 (106,6 mg) je dalje pročišćena HPLC-om [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procentni vodeni AcOH (5:95, v/v)] da se dobije salidrozid (19,13,7 mg, {{340}.0{{409}}27 posto ). Frakcija 4 (10.69 g) odvojena je silika gelom reverzne faze CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?aceton] da bi se dobile četiri frakcije [Fr. 4–1 (878,2 mg), 4–2 (7.06 g), 4–3 (1,57 g) i 4–4 (792,8 mg)]. Frakcija 4–2 (1,5{{560}} g) je podvrgnuta HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (2{{57{{586} }}}:80, v/v)] da damo pet razlomaka {Fr. 4–2–1 (42,9 mg), 4–2–2 [= kampneozid I (17, 67.0 mg, 0.014 posto )], 4–2– 3 [= akteozid (5, 1,21 g, 0,26 procenata)], 4–2–4 (41,6 mg) i 4–2–5 (181,3 mg)}. Frakcija 4–2–4 (41,6 mg) je dalje prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (18:82, v/v)] da bi se dobio izoakteozid (6, 19,1 mg, 0,0040 posto) i cis-akteozid (7,3,4 mg, 0,0007 posto). Frakcija 4–3 (1,57 g) je prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (20:80, v/v)] da bi se dobilo 11 frakcija [Fr. 4–3–1 (30,4 mg), 4–3–2 (55,2 mg), 4–3–3 (= 17, 22,1 mg, 0,0010 posto), 4–3–4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 posto ), 4–3–5 (27,4 mg), 4–3–6 (43,6 mg), 4–3–7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 posto), 4–3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-ramnopiranozid (16, 37,6 mg, 0,0017 posto)], 4–3–9 (39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetilakteozid (8, 85,4 mg, 0,0038 procenata)], i 4–3–11 (64,6 mg)]. Frakcija 4–3–6 (43,6 mg) je dalje prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (18:82, v/v)] da bi se dobili kankanozidi H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 posto) i H2 (2,3,3 mg, 0,0001 posto). Frakcija 4–3–9 (39,8 mg) je dalje prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (18:82, v/v)] da bi se dobio kankanozid I (3, 15,4 mg, 0,0007 posto) i 6 ( 3,1 mg, 0,0001 posto). Frakcija 5 (8,84 g) je odvojena silika gelom reverzne faze [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?aceton] koji daje sedam frakcija [Fr. 5–1 (870,2 mg), 5–2 (478,9 mg), 5–3 (3,72 g), 5–4 (979,9 mg), 5–5 (1,19 g), 5–6 (1,27 g) i 5 –7(130,1 mg)]. Frakcija 5–1 (870,2 mg) je pročišćena pomoću HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (5:95, v/v)] da bi se dobio lakteozid bez kofeja (9, 5,1 mg, 0,0002 posto) i cistanozid F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 posto). Frakcija 5–3 (3,72 g) je prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1 procentni vodeni AcOH (15:85, v/v)] da bi se dobilo šest frakcija [Fr. 5–3–1 (128,6 mg), 5–3–2 [= kankanoza (21, 9,4 mg, 0,0004 posto)], 5–3–3 (64,6 mg), 5–3–4 (72,3 mg), 5–3–5 [= strana echinaco (4, 2,54 g, 0,11 posto), i 5–3–6 (318,5 mg)]. Frakcija 5–3–4 (72,3 mg) je dalje prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procenat vodenog AcOH (10:90, v/v)] da se dobije kampneozid II (18,10,6 mg, 0,0005 procenata). Frakcija 5–4 (979,9 mg) je prečišćena pomoću HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 procentna vodena AcOH (15:85, v/v)] do frakcija dataina [Fr. 5–4–1 (28,6 mg), 5–4–2 (90,5 mg), 5–4–3 (99,7 mg), 5–4–4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 posto), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 posto), i 5– 4–9 (134,7 mg)]. Frakcija 5–4–6 (318,5 mg) je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 procentna vodena otopina AcOH (15:85, v/v)] dajući cistantubulozide B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 posto), B2 (12 , 7,6 mg, 0,0003 posto), i A (15, 21,1 mg, 0,0009 posto) i videmaninozid C (14, 17,2 mg, 0,0008 posto). Frakcija 5-5 (1,19 g) je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (18:82, v/v)] da se dobije tubulozid A (10, 300,3 mg, 0,013 posto) i arenariozid (13,5,8 mg, 0,0006 posto). Frakcija 6 (12,52 g) je odvojena silika gelom reverzne faze CC [600 g, MeOH–H2O (20:80?30:70,v/v)?MeOH?aceton] da bi se dobile četiri frakcije [Fr. 6–1 (553,8 mg), 6–2 (10,69 g), 6–3 (1,40 g) i 6–4 (17,8 mg)]. Frakcija 6–2 (500,0 mg) je pročišćena pomoću HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 posto vodenog AcOH (25:75, v/v)] da se dobije 4 (353,1 mg, 0,34 posto) ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Bijeli prah, ½a- 24D -45.3 (c 1,06, MeOH). FABMS sa pozitivnim jonima visoke rezolucije: Izračunato za C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835.2637.Pronađeno: 835.2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm{30}}. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: dat u tabeli 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: dat u tabeli 3. FABMS pozitivnih jona: m/z 835 (M plus Na) plus . FABMS negativnih jona: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) Bijeli prah, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). FABMS sa pozitivnim jonima visoke rezolucije: Izračunato za C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Pronađeno:835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: dat u tabeli 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: dat u tabeli 3. FABMS pozitivnih jona: m/z 835 (M plus Na) plus FABMS negativnih jona : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Bijeli prah, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). FABMS sa pozitivnim jonima visoke rezolucije: Izračunato za C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Pronađeno: 777,2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm{30}}. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: dat u tabeli 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: dat u tabeli 3. FABMS pozitivnih jona: m/z 777 (M plus Na) plus . FABMS negativnih jona: m/z 753 (MH)-.

3.4. Alkalna i kisela hidroliza 1–3

Rastvori 1, 2 i 3 (svaki 1,5 mg) u 5 posto vodenom rastvoru kalijum hidroksida (KOH, 0.5 mL) su miješani na 40 stepena 1 h. Svaki rastvor je neutralizovan sa Dowex HCR W2 (H plus oblik), a smole su uklonjene filtracijom. Isparavanje rastvarača pod sniženim pritiskom dalo je odgovarajuće deacilirane proizvode, koji su podvrgnuti HPLC analizi [kolona: Cosmosil pNAP,250 - 4.6 mm id; mobilna faza: CH3CN–1 posto vodeni AcOH (15:85, v/v); detekcija: UV (254 nm); brzina protoka: 1.0 mL/min] koja se identificira kao trans-kafeinska kiselina (tR 9,9 min od 3), trans-p-kumarinska kiselina (tR 17,1 min od 1) i cis-p-kumarina kiselina (tR17,8 min od 2), respektivno. Zatim je svaki otopljen u 1.0 MHCl (1.0 mL) i zagrijavan na 80 C 3 h. Nakon hlađenja, reakciona smjesa je neutralizirana Amberlite IRA-400 (OH oblik), a smole su uklonjene filtracijom. Nakon uklanjanja rastvarača pod sniženim pritiskom, ostatak je odvojen sa Sep-Pak C18 kartridž kolonom (H2O?MeOH). H2O-eluirana frakcija je podvrgnuta HPLC analizi pod sljedećim uslovima: HPLC kolona, ​​Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Japan); detekcija, optička rotacija [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokio, Japan); mobilna faza, CH3CN–H2O (85:15, v/v); protok 0,8 mL/min]. Identifikacija L-ramnoze (i) i D-glukoze (ii) oslobođene iz 1, 2 ili 3 u H2O-eluiranoj frakciji izvršena je poređenjem njihovih vremena zadržavanja i optičke rotacije s onima kod autentičnih uzoraka [i,tR 9,9 min. (negativno)] i [ii, tR 17,9 min (pozitivno)].

3.5. Biotest

3.5.1. Reagensi

LPS (od Salmonella enteritidis), minimalni esencijalni medij (MEM) i William's E medijum su kupljeni od Sigma–Aldrich Chemical (St. Louis, MO, SAD); fetalni goveđi serum (FBS) je iz Invitrogena (Carlsbad, CA, USA); i druge hemikalije bile su iz Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japan). 96-Mikroploče za bunare su kupljene od Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokio, Japan).

3.5.2. Životinje

Mužjaci ddY miševa su kupljeni od Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japan). Životinje su bile smještene na konstantnoj temperaturi od 23 ± 2 C i hranjene su standardnom laboratorijskom hranom (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japan). Svi eksperimenti su izvedeni na miševima pri svijesti, osim ako nije drugačije naznačeno. Eksperimentalni protokol je odobrio Komitet za eksperimentalna istraživanja na životinjama Univerziteta Kinki.

3.5.3. Zaštitni efekti na D-GalN/LPS-inducirano oštećenje jetre kod miševa

Metoda koju su opisali Tiegs et al.51 je modificirana i korištena za ovaj eksperiment. Ukratko, mužjaci ddY miševa težine oko 25-30 g gladili su 20 sati prije eksperimenta. D-GalN (350 mg/kg) i LPS (10 lg/kg) rastvoreni u fiziološkom rastvoru su ubrizgani intraperitonealno da izazovu povredu jetre. Svaki test uzorak je dat oralno 1 h prije injekcije D-GalN/LPS. Uzorci krvi su uzeti iz infraorbitalnog venskog pleksusa 10 h nakon injekcije D-GalN/LPS. Nivoi sAST i sALT određivani su korištenjem Reitman–Frankel metode (komercijalni komplet, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hidrokortizon je korišten kao referentni spoj. Testni uzorci su suspendovani sa 5% rastvora arapske gume, a rastvor je davan oralno u dozi od 10 mL/kg u svakom eksperimentu, dok je nosač oralno davan u dozi od 10 mL/kg u odgovarajućoj kontrolnoj grupi.

3.5.4. Zaštitni učinci na citotoksičnost inducirana od strane D-GalN primarno kultiviranih mišjih hepatocita

Hepatoprotektivni efekat sastojaka određen je {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromidom (MTT ) kolorimetrijski test koristeći primarno kultivisane hepatocite miša.33–43 Hepatociti su izolovani iz maleddY miševa (30–35 g) metodom perfuzije kolagenaze. Suspenzija ćelija u 4 - 104 ćelijama u 100 l William's E medijuma koji sadrži FBS (10 procenata), penicilin G (100 jedinica/mL) i streptomicin (100 lg/mL) inokulisana je u 96-jažicu mikroploče i prethodno kultivisan 4 h na 37 stepeni pod atmosferom od 5 procenata CO2. U medijum je dodato 100 lL svežeg medijuma koji sadrži D-GalN (2 mM) sa ili bez test uzorka i hepatociti su kultivisani 44 h. Medijum je zamenjen sa 100 lL svežeg medijuma i 10 lL MTT [5 mg/mL u fosfatnom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS)] je dodato u medijum. Nakon 4 h inkubacije, podloga je uklonjena, a zatim je dodato 100 lL izopropanola koji sadrži 0,04 M HCl da se rastvori formazan proizveden u ćelijama. Optička gustina (OD) otopine formazana je izmjerena čitačem mikroploče na 570 nm (referenca: 655 nm). Inhibicija ( procenat ) je dobijena sljedećom formulom.

Inhibicija ( posto )= [(OD(uzorak) - OD(kontrola))/(OD(normalno)-OD(kontrola))] x 100

3.5.5. Učinci na proizvodnju NO u peritonealnim makrofagima miša stimuliranim LPS-om

Test skrininga za proizvodnju NO pomoću TGC-indukovanih mišjih peritonealnih makrofaga izveden je kako je prethodno opisano.43,46,

3.5.6. Učinci na proizvodnju TNF-a u peritonealnim makrofagima miša stimuliranim LPS-om

TNF-a oslobođen u mediju je određen kao što je prethodno opisano28 uz malu modifikaciju. Ukratko, TGC-inducirani mišji peritonealni makrofagi (5 - 105 ćelije/jažica) sakupljeni su iz peritonealnih šupljina mužjaka ddY miševa, suspendirani u 100 lLof RPMI 1640 dopunjen sa 5 posto FBS, penicilin/ (100 jedinica) mL), i streptomicinom (100 lg/mL), i prethodno kultivisani u 96-mikropločama na 37 stepeni u 5% CO2 u vazduhu tokom 1 h. Neadherentne ćelije su uklonjene ispiranjem sa PBS i dodano je 100 lL svežeg medijuma koji sadrži različite koncentracije test jedinjenja. Nakon 10 min, 100 lL medijuma koji sadrži 10 lg/mL LPS je dodano i inkubirano 4 h. Proizvodnja TNF-a u svakoj jažici određena je upotrebom ELISA kompleta (mišji TNF-a ELISA komplet, Invitrogen). Svako testno jedinjenje je otopljeno u DMSO, a rastvor je dodan u medijum (konačna koncentracija DMSO 0,5 procenata)

3.5.7. Inhibicijski efekti na TNF-a-indukovanu ćelijsku smrt u L929 ćelijama

L929 ćelije (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japan) održavane su u Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma-Aldrich) koji sadrži 10 posto FBS, 1 posto MEM neesencijalnih aminokiselina (Invitrogen), penicilin G (11000) /mL) i streptomicin (100 lg/mL) na 37 C u atmosferi od 5 posto CO2. Ćelije su inokulirane u 96-pločicu za kulturu tkiva [3 -104 ćelije/bunariću u 100 lL/jažici u MEM]. Nakon 44 h inkubacije u mediju TNF-a (20 ng/mL) sa ili bez test uzorka, vitalnost ćelija je procijenjena MTT kolorimetrijskim testom (videante).49,50 Svako testno jedinjenje je otopljeno u DMSO, i rastvor je dodan u medijum (konačna koncentracija u DMSO0,5 procenata).

3.6. Statistika

Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SEM Za statističku analizu korištena je jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA) praćena Dunnettovim testom. Vrijednosti vjerovatnoće (p) manje od 0.05 su smatrane značajnim.

Priznanja

TM, KN i OM su podržani od strane Grant-in-Aid za naučna istraživanja projekta 'High-tech Research Center' za privatne univerzitete: odgovarajuća subvencija iz granta za naučna istraživanja od Ministarstva prosvjete, kulture , Sport, Nauka i tehnologija (MEXT) Japana, 2007–2011, a takođe podržan od strane Grant-in-Aid za naučna istraživanja od MEXT-a. MY i HM su podržani od strane 21. programa COE, projekta Academic Frontier i granta za naučna istraživanja od strane MEX-a

Od: ' Aciliranofeniletanoidoligoglikozidi sa hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljkeCistanche tubulosa' byToshio Morikawa i dr

---Bioorganska i medicinska hemija 18 (2010) 1882–1890.