Novi, ataksični mišji model ataksije teleangiektazije uzrokovan klinički relevantnom glupom mutacijom (1. dio)

Za više informacija molimo kontaktirajtedavid.wan@wecistanche.com

Abstract

Ataksija teleangiektazija (AT) i ataksija sa okularnom apraksijom tipa 1 (AOA1) su razorni neurološki poremećaji uzrokovani nultim mutacijama u genima za stabilnost genoma, AT mutiranim (ATM) i Aprataksinom (APTX), respektivno. Naše mehaničko razumijevanje i terapijski repertoar za liječenje ovih poremećaja ozbiljno nedostaju, velikim dijelom zbog neuspjeha prethodnih životinjskih modela sa sličnim nultim mutacijama da rekapituliraju karakterističan gubitak motoričke koordinacije (tj. ataksija) i pridružene cerebelarne defekte. Povećanjemgenotoksičanstresa kroz umetanje nultih mutacija u gen Atm (besmislica) i Aptx (knockout) u istoj životinji, generirali smo novi model miša koji po prvi put razvija progresivno ozbiljan ataksični fenotip povezan s atrofijom cerebelarne molekule sloj. Nalazimo da su biofizička svojstva malog mozga Purkinje neurona značajno poremećena (npr. smanjen kapacitet membrane, niži pragovi akcionog potencijala, itd.), dok svojstva sinaptičkih inputa ostaju uglavnom nepromijenjena. Oveperturbacijeznačajno mijenjaju neuronsku aktivnost Purkinijevog neurona, uključujući progresivno smanjenje spontanog aktiviranja akcionog potencijala

učestalost koja je u korelaciji sa atrofijom malog mozga i ataksijom tokom prve godine života životinje. Dvostruki mutirani miševi također pokazuju visoku predispoziciju za razvoj raka (timoma) i imunološke abnormalnosti (poremećeni rani razvoj timocita i sazrijevanje T-ćelija), simptome karakteristične za AT. Konačno, umetanjem klinički relevantne nulte mutacije tipa gluposti u Atm, pokazujemo da jedinjenja za čitanje malih molekula (SMRT) mogu obnoviti proizvodnju ATM-a, što ukazuje na njihov potencijal kao budući AT terapeutik.

Kliknite ovdje da saznate više o Cistancheu

1.0 Uvod

Ataksija teleangiektazija (AT) je rijedak (1 u~100,000) (Swift et al. 1986), autosomno recesivni genetski poremećaj karakteriziran predispozicijom za rak, imunološkim nedostatkom i visoko penetrantnom progresivnom i teškom povezanom ataksijom do cerebelarne atrofije (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Boder i Sedgwick 1958; Levy i Lang 2018). AT pacijenti obično umiru u drugoj ili trećoj deceniji života (Crawford et al. 2006) od limfnog karcinoma, respiratornih infekcija ili komplikacija ataksije—nažalost, preživljavanje se nije dramatično promijenilo od 1950-ih (Micol et al.2011; Rothblum- Oviatt et al. 2016). Dok se progresija bolesti i uzrok smrti uvelike razlikuju među pacijentima, visoko penetrantni progresivni pad motoričke koordinacije je zabilježen kao najveći negativan utjecaj na kvalitetu života pacijenta (Jackson et al.2016). Njega je općenito palijativna, usmjerena na smanjenje, ograničavanje ili eliminaciju karcinoma ili infekcija. Ne postoje dugoročne terapije za liječenje ataksije i povezane cerebelarne disfunkcije i atrofije. AT je uzrokovan nedostatkom ili disfunkcijom bankomata (AT mutiran) protein (Savitsky et al. 1995). Preuranjeni terminacioni kodon (PTC) koji uzrokuje besmislene mutacije čini do polovine poznatih slučajeva, pri čemu doprinose i misense i delecione mutacije (Concannon i Gatti 1997; Sandoval et al. 1999). ATM je serin/treonin PIKK familija kinaza koja igra ključnu ulogu u odgovoru na oštećenje DNK (DDR), štiteći ćelije od desetina hiljada DNK lezija nastalih svaki dan (Lindahl i Barnes 2000; Kastan i Bartek 2004; Shiloh i Ziv 2013).U aktivnom monomernom obliku, ATM fosforilira nekoliko ključnih proteina zaustavljajući proizvodnju nove DNK (zaustavljanje ćelijskog ciklusa) (Ando et al.2012), a zatim, ovisno o ozbiljnosti oštećenja, pokreće popravak DNK ili programira ćeliju smrt (tj. apoptoza) (Ando et al.2012; Rashi-Elkeles et al.2006). Identificirano je nekoliko DDR meta ATM-a, uključujući p53, CHK2, BRCA1, SMC1 i NBS1 (Matsuoka et al. 2007). Uloga ATM-a u popravci DNK također je implicirana u normalnom razvoju imunološkog sistema, gdje se predlaže da doprinese na rekombinaciju prirodnog spajanja DNK koja se javlja tokom preuređivanja gena u sazrevanju T- i B-limfocita (Chao, Yang i Xu 2000; Matei, Guidos i Danska 2006; Vacchio et al. 2007; Schubert, Reichenbach i2 Zielen 200 ). Iako se njegove uloge još uvijek pojavljuju, ATM je također uključen u homeostazu oksidativnog stresa (Guo et al. 2010) i mitofagiju (Valentin-Vega i Kastan 2012; Pizzamiglio, Focchi i Antonucci 2020). Nejasno je zašto nedostatak ATM-a uzrokuje ataksiju, ali to je daleko od jedinog DDR proteina koji je povezan s ataksijom, kao Aprataxin (APTX) (Aicardi et al.1988), Mejotička rekombinacija 11 homolog 1(MRE11)(Sedghi et al.2018), Nibrin (NBS1)(van der Burgt et al.1996), Senataxin (SETX) (Moreira et al.2004) i tirozil-DNK fosfodiesteraza 1 (TDP1) (Takashima et al. 2002) kada je odsutna ili nefunkcionalna može uzrokovati ataksiju povezanu sa cerebelarom. Ovo sugerira da neurološke karakteristike sindroma nestabilnosti genoma imaju zajednički osnovni uzrok, iako to tek treba mehanički demonstrirati (McKinnon 2009; Rass, Ahel i West 2007). Glavni faktor koji ograničava našu sposobnost da definiramo zašto gubitak DDR proteina, kao što je ATM, selektivno utječe na mali mozak i uzrokuje progresivnu ataksiju je nedostatak životinjskog modela koji rekapitulira ove neurološke simptome (Lavin 2013). Nekoliko AT modela glodara stvoreno je u posljednjih nekoliko godina umetanjem genskih mutacija koje uzrokuju disfunkciju proteina (nedostatak aktivnosti kinaze) ili potpuni nedostatak (Herzog et al.1998; Xu i Baltimore 1996; Elson et al.1996; Spring et al. 2001; Campbell et al. 2015; Quek et al. 2016; Tal et al. 2018; Lavin 2013); nedavno je prijavljena i mini svinja (Beraldi et al. 2017). Međutim, nijedan ne razvija očiglednu, progresivnu ataksiju s cerebelarnom disfunkcijom i atrofijom koja rekapitulira ljudsku bolest, iako se razvijaju drugi aspekti poremećaja poput karcinoma štitnjače, neplodnosti i imunoloških abnormalnosti. Ostaje nejasno zašto ovi prethodni životinjski modeli ne pokazuju progresivni ataksični fenotip (Lavin 2013). Moguće je da molekularne kompenzacije specifične za vrstu kod miševa pružaju redundancije ili alternativne puteve koji minimiziraju efekte nedostatka ATM-a u mozgu (El-Brolosy i Stainier 2017). Također je moguće da je skraćeni životni vijek prethodnih modela (Barlow et al. 1996) previše kratak da bi stohastički mehanizmi koji pokreću cerebelarnu disfunkciju i atrofiju akumulirali i utjecali na motoričko ponašanje. Drugi izazovi uključuju potencijalno propuštajuće genetske manipulacije koje rezultiraju niskim nivoom ATM proteina ili aktivnih fragmenata sa rezidualnom aktivnošću kinaze, čime se ograničava neuropatologija (Li et al. 2011). Nedostatak tako važnog životinjskog modela ima utjecaj

bile značajne, ozbiljno ograničavajuće eksperimentalne studije od identifikacije ćelijskih i molekularnih mehanizama i ometanja pretkliničkog razvoja i testiranja prijeko potrebnih terapeutika. Ovdje testiramo da li povećanje genotoksičnog stresa, postavljanjem nultih mutacija ne samo na Atm gen, već i na srodni Aptx gen, dovodi do reprezentativnijeg mišjeg modela koji prikazuje cerebelarnu disfunkciju, atrofiju i razvoj progresivne ataksije. Odlučili smo dodatno izbaciti Aptx jer njegov nedostatak uzrokuje poremećaj sličan AT kod ljudi koji se zove ataksija s okularnom apraksijom tipa 1 (AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) u Atm genu zajedničkom za veliku porodicu sjevernoafričkih pacijenata sa AT (Gilad, Bar-Shira, et al.1996). Ova mutacija rezultira preranim terminacijskim kodonom (PTC) na onome što bi normalno bila aminokiselina 35 i gubitkom ATM translacije. Ovdje izvještavamo o eksperimentima s dokazom principa koji pokazuju da su klinički relevantne genetske mutacije ugrađene u model AT miša podložne čitanju spojeva i stoga prikladne za pretkliničko testiranje SMRT spojeva.

2.0 Rezultati

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>T mutacija rezultira različitim PTC-ovima u ljudskom genu u poređenju sa mišjim Atmgen—TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>T mutacija transformiše glutamin (Q)-kodirajući CAG kodon u TAG stop kodon i označava se Atm235×(zvanično Atmm1.103c)vrijeme). Prisustvo PTC-a rezultira gubitkom ekspresije ATM-a, bilo smanjenom za otprilike polovicu u heterozigotu koji ekspresira jednu normalnu mišju kopiju

ili Atm Q35v35×) (sl. ili Atm 835×), ili potpuno u homozigotu (Atm?35×R35×Atm gen (Atm35× plus 1C).

Atm35x7R35×; Aptx^(dvostruki mutant) miševi su stvoreni prvim ukrštanjem pojedinačnih mutantnih AtmF3xR3x (kongeničnih na pozadini C57BL/6J) i Aptx'(mješovitih C57BL/6J i 129 pozadinskih) miševa na Aptx* miševe. F1-5 leglo Atm"; Aptx* miševi su zatim ukršteni kako bi se generirao heterozigot Atm unutar legla kako bi se stvorio dovoljan broj željenih eksperimentalnih i kontrolnih genotipova kako bi se utvrdilo kako gubitak različitih količina ATM i APTX utiče na fenotip životinje ( Slika 1D).

Poput prethodnih modela AT miša s nedostatkom ATM-a, sam nedostatak ATM-a ili APTX-a nije rezultirao miševima s ataksijom (Video 1 i 2). Međutim, nedostatak oba proteina (Atm35k35x; Aptx') dovodi do razvoja teškog i progresivno ataksijskog fenotipa (Slika 1E, Video 3 i 4).

2.2 Miševi s nedostatkom ATM-a imaju smanjenu sposobnost preživljavanja i visoku učestalost timoma

Procenjivali smo opšte zdravlje i razvoj kontrolnih i eksperimentalnih miševa sa različitim nivoima ATM i APTX (Sl.2). Otkrili smo da Atm735xR35×; Aptx^'miševi su rasli ~55 posto sporije i dostigli procijenjene težine platoa koje su bile ~35 posto manje od kontrolnih genotipova (log-rang, n=21 do 40,p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0.4 za sva poređenja u paru; Fig.2-sl.S1B]. Generalno, trećina miševa sa nedostatkom ATM umrla je od komplikacija povezanih sa velikim tumorima timusa (timoma) pronađenim u torakalnoj šupljini (slika 2C). Prisustvo ili odsustvo APTX-a nije utjecalo na prevalenciju raka, a miševi s najmanje jednim Atm transkriptom bili su bez raka do najmanje P400. Sve u svemu, nedostatak ATM, ali ne i APTX, imao je ozbiljne posljedice na zdravlje i preživljavanje miševa.

2.3 Nedostatak i ATM i APTX je neophodan za stvaranje progresivne motoričke disfunkcije

Progresivni razvoj teške ataksije je karakteristična karakteristika AT koja je rekapitulirana u Atm? 35/R35x; Aptx' miševi, ali nijedan od drugih kontrolnih genotipova koje smo testirali. Sve u svemu, nalazimo da se deficiti motoričke koordinacije pojavljuju između 210 i 400 dana nakon rođenja kod Atm735Xk3x; Aptxmice i ne nalaze dokaze ataksije kod miševa sa najmanje jednom kopijom Atm ili Aptx gena (Sl. 3A, B). Za test vertikalnih stubova, Atm735xR3x×; Aptx miševima je trebalo duplo duže da se spuste na P400 u poređenju sa Atm*;Aptx*,Atm*; Aptx', Atm735xR35×; Aptx*, ili Atm35×*; Aptx' miševi [muški:29.1±0.9s(n=3) vs.7.5±0.4s(n=12),12.5±2.5s(n=9),9.2±0.9s (n=10),8.6±0.9s(n=11),1-način ANOVA,F4.40=19.9,p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 Membranska i sinaptička svojstva su poremećena u Purkinje neuronima sa nedostatkom ATM i APTX

Purkinje neuroni (PN) su ključni neuronski podtip koji se nalazi u malom mozgu. Oni pokazuju značajnu intrinzičnu ekscitabilnost, spontano ispaljuju akcione potencijale brzinom znatno većom od većine drugih neurona u mozgu (50 do 100 Hz više u mnogim slučajevima). Njihova aktivnost oblikuje cerebelarni izlaz putem toničke inhibicije neurona jezgara malog mozga, koji se projektuju u centre motorne koordinacije u prednjem mozgu, moždanom deblu i kičmenoj moždini. Cerebelarna PN disfunkcija je povezana s nekoliko oblika ataksije i implicirana je u AT(Hoxha et al.2018: Cook. Fields. i Watt 2021: Shiloh Aptx*-X/R35X.2020). Stoga smo ispitali da li su elektrofiziološka svojstva PN-a u Atm' malom mozgu abnormalna. Budući da su početna aktivnost PN i odgovor na ulaz posredovani osnovnim skupom pasivnih i aktivnih svojstava membrane (slika 4), direktno smo snimili i uporedili svojstva membrane PN u akutnim cerebelarnim sekcijama sakupljenim iz Atm35XR35×; Aptx* i Atm*; Aptx* miševi (P350 do 400). PN-ovi snimljeni sa Atm35xR35×; Aptx miševi su imali značajno "čvršće" membrane, pokazujući veće ulazne otpore membrane (Rm) od onih iz Atm; Aptx* miševi [47,7±5,6 (n=15)vs.

30.2±1.47(n=23)MQ, t-test,p-0.008; Slika 4B] i prikazana je brža vremenska konstanta membrane() [3.6±0.4(n=15)vs.5.1±0.3(n=23)ms, t-test, p=0 .009; sl. 4B]. Ovi rezultati pokazuju da je ukupna membranska kapacitivnost (Cm=t/Rm) Atm35x/35x;Aptx^PNs značajno smanjena [98,25±19,23(n=15)vs.175,6±12,67(n =23)pF,t-test,p=0.0025;Sl.4B]. Na ćelijskom nivou, ovo sugeriše da PN-ovi sa nedostatkom ATM-a i APTX-a imaju manje (tj. smanjenu površinu) ili tanje membrane

nego kod divljih tipova PN, rezultat koji ukazuje na razvojni deficit ili neurodegenerativni proces; Aptx/-i (DellOrco et al.2015). Zatim smo procijenili intrinzičnu ekscitabilnost PN u AtmR35xR3x;

Atm*;Aptx* miševi ispitivanjem generisanja i dinamike PN akcionog potencijala (AP). Značajni deficiti u sposobnosti PN-ova da neprekidno pucaju kao odgovor na strujnu injekciju uočeni su kod Atm?35×3x;Aptx^ miševa (slika 4C). Ovi deficiti su bili povezani sa značajnim perturbacijama u amplitudi, pragu i području izazvanih akcionih potencijala [amplituda: 66,2± 0,7 (n=14)vs. 72.1±1.4 (n=13)AmV,t-test,p=0.003;prag:-55.2±1.5vs.-48. 61±1,9 mV,t-test,p=0.0196; površina:17.96±0.6vs.

20.63±1.0 mV*ms, t-test, p=0.048; Fig.4C]. Zajedno, ovi eksperimenti pokazuju značajne perturbacije fizioloških svojstava PN-a koje vjerovatno remete njihovu sposobnost da normalno funkcionišu u malom mozgu At/mR35×R35×; Aptx' miševi.

Zatim smo testirali da li su ekstrinzična i/ili sinaptička PN svojstva takođe uticala na AtmR35xR3sx. Aptx* miševi. Prvo smo ispitali spontane ekscitatorne post sinaptičke struje (iPSC) generirane sinapsama granula ćelija-PN (tj. paralelni ulazi vlakana). Nije otkrivena razlika u veličini UPSC, što ukazuje da je funkcija terminala aksona ćelija granula (tj. paralelnih vlakana) bila relativno normalna u AtmR35KR35X; Aptx'cerebellum[18,92±1,3(n{{10}}) je bio. 23.4±3.3(n=11)pA,t-test,p=0.477;Sl.4D](Yamasaki, Hashimoto i Kano 20{{5{{58} }}}6). Međutim, utvrđeno je da je sEPSC frekvencija značajno povećana, što je fenomen koji se može pripisati ili povećanju ukupnog broja sinapsi, povećanju veličine lako otpuštajućeg skupa sinaptičkih vezikula ili povećanju vjerovatnoće neurotransmitera oslobađanje u PN-ovima fAtmR35XR35X; Aptx'mice [18.75±2.8Hz(n=11) naspram 11.4±1.0Hz(n=11), t-test,p=0.{{ 69}}47; Fig.4D]. Zatim smo istražili izazvano sinaptičko oslobađanje i kratkoročnu plastičnost simultanim snimanjem iz PN-a i električnom stimulacijom aksona ili granularne ćelije (tj. paralelna vlakna) ili inferiornih aksona olivarija (tj. penjajuća vlakna) sa uparenim pulsnim udarom (2- pulsa, 50 ms razmaka). Utvrđeno je da su sinaptička svojstva paralelnih vlakana normalna, ne pokazujući značajne razlike u očekivanom kratkoročnom olakšavanju (Atluri i Regehr 1996) ili polovičnoj širini i vremenskoj konstanti raspada izazvanog EPSC [PPR: 1,3±0. 03 (n=10) vs.1.4±{{90}}.{{1{{1{{106}}5}}1 }}5(n=13),t-test,p=0.162;polovina:3.9±0.6 vs.4.9±0.4 ms,t -test,p=0.175;vremenska konstanta: 3.5±0.5 vs.4.7±0.4 ms,t-test,p=0.054;Sl. 4E]. Za usporedbu, otkrili smo penjanje sinaptičkih odgovora vlakana na PN, koji normalno pokazuju depresiju parnih impulsa (Hansel i Linden 2000), t depresiju u značajno većim veličinama u Atm/3338/R35X; Aptx'miševi [PPR:0,6±0,03 (n=6) vs.0.7±0.02(n=9),t-test,p=0.03;Sl.4F]. Ukupna širina i vremenska konstanta opadanja evoke struje su takođe bile manje [polovina: 2.3±0.6(n =6).3.0±0.2(n=9)ms,t-test,p=0.004;vremenska konstanta(brzo) :1.1±0.14 vs.2.9±0.4ms,t-test, p=0.001]. Iako ovi rezultati mogu biti uzrokovani presinaptičkim deficitom, kao što su smanjene zalihe vezikula u terminalu aksona penjajućeg vlakna, nepromijenjena početna veličina EPSC [2,4±0,4(n=6)vs. 1,9 ±0,2 nA (n=9), t-test, p=0.3] ukazuje na intrinzičniji deficit, kao što je smanjeni priliv Ca2* iz endoplazmatskog retikuluma, koji bi mogao značajno utjecati na dugo -termin sinaptička plastičnost kritična za cerebelarnu funkciju (Hoxha et al. 2018; Kano i Watanabe 2017). Sve u svemu, perturbacije pasivnih i aktivnih PN svojstava koje posmatramo ovde verovatno dovode do značajne cerebelarne disfunkcije kod AtmR35X/R35X; Aptx'mice.

2.5 Nedostatak ATM i APTX uzrokuje progresivnu perturbaciju PN neuralne aktivnosti koja je povezana s dendritikomsmanjenje i ukupna cerebelarna atrofija Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0.3 za sva poređenja u paru; sl. 4-sl. S3). Prethodne studije na nekoliko mišjih modela nasljedne ataksije, uključujući epizodnu ataksiju i nekoliko varijanti spinocerebelarne ataksije, otkrivaju da fiziološki poremećaji u PN aktiviranju ne samo da mijenjaju njegovu učestalost, već i njegovu pravilnost (Kasumu i Bezprozvanny 2012; Jayabal et al. 2016; Stoyas et al. 2020; Cook, Fields i Watt 2021). Uporedili smo i koeficijent varijacije (CV) i varijabilnost u susednim intervalima (CV2) između AtmR35X/R35X; Aptx/ i kontrolni miševi (sl. 4-sl. S4, S5). Nije otkrivena razlika u ovim parametrima u odnosu na spol, dob ili genotip. U skladu sa rezultatima ponašanja, cerebelarna disfunkcija je pronađena samo kod AtmR35XR35X; Aptx'miševi koji su razvili ataksiju, a ne kod miševa s djelomičnom ili punom ekspresijom ATM ili APTX.

2.5 ATM i APTX nedostatak izaziva cerebelarnu atrofiju

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0.3 za sva 4 genotipa na P460, n=10 do 20]. Nadalje, otkrili smo da se veličina malog mozga ne razlikuje između mužjaka i u prosjeku 22 posto manjih ženki miševa po genotipovima u ovoj dobi [2-način ANOVA, F(2. 153)=1.9, p =0.2]. Stoga, cerebelarna neurodegeneracija u Atm35XR35×; Aptx*miševi, koji počinje nakon P120, povezan je s nedostatkom ATM i APTX. Otkrili smo da je cerebelarna atrofija povezana sa selektivnim smanjenjem širine molekularnog sloja u kojem se nalaze PN dendriti (slika 5B). U skladu s vremenskim promjenama ukupne veličine malog mozga, frekvencije PN aktiviranja i ponašanja, širina ML u Atm35×R35X; Aptx* miševi je bio normalan kod mlađih miševa, ali se progresivno smanjivao u širini kako se težina ataksije povećavala 【P400∶120,2±2,1 μm （n=5）vs.140,2±4,8 μm（n=5）, {31}}način ANOVA, Fu42=45.04, str<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

Kronične sinopulmonalne infekcije povezane s imunodeficijencijom jedan su od vodećih uzroka smrti kod AT pacijenata (Morrell, Cromartie i Swift 1986; Bhatt i Bush 2014). Imunodeficijencija je povezana sa deficitom u generisanju B- i T-limfocita koji su povezani sa defektima u procesima rearanžiranja gena receptora antigena tokom stvaranja ovih ćelija u koštanoj srži, odnosno timusu (Staples et al. 2008). Nastali defekti u broju zrelih limfocita uključuju smanjenje CD4t pomoćnih T-ćelija i CD8*T-ćelija ubojica (Schubert, Reichenbach i Zielen 2002). Stoga smo ispitali procente T-ćelija u perifernoj krvi i različitih subpopulacija u timusu Atm35xR35×; Aptx*' miševi koji koriste T-ćelijski antigen receptor (TCR) i ekspresiju ko-receptora CD4/CD8. U perifernoj krvi, uočili smo značajno smanjenje ukupne frakcije CD3*T-ćelija kod miševa sa smanjenom ili odsutnom ekspresijom ATM u poređenju sa miševima divljeg tipa (Sl.6). Ovo smanjenje je dodatno pogoršano pratećim nedostatkom APTX-a. Nedostaci ATM-a i APTX-a su smanjili T-ćelije u perifernoj krvi za preko 65 posto u poređenju sa divljim tipom kontrola. Učinak nedostatka APTX-a bio je aditivni u odnosu na nedostatak ATM-a, što ukazuje na drugačiji mehanizam djelovanja za svaki od ova dva proteina na stvaranje T-ćelija. Smanjenje procenta T-ćelija u perifernoj krvi uglavnom je bilo povezano sa smanjenjem populacije CD4 plus pomoćnih T-ćelija (slika 6B). Zanimljivo je da je udio CD8 plus T-ćelija povećan samo u AtmR35X/R35×; Aptx* miševi (slika 6B). Opet, uočili smo diferencijalni efekat nedostataka ATM i APTX kao što se vidi za efekte ovih mutacija na ukupnu frakciju T-ćelija. S obzirom na smanjenje populacija T-ćelija u krvi, zatim smo procijenili razvoj T-ćelija u timusu. U ovom organu, T-ćelijski progenitori iz koštane srži prolaze kroz preuređenje TCR gena nakon čega slijedi pozitivna selekcija za MHC restrikciju i negativna selekcija autoreaktivnih klonova. Faze razvoja timocita mogu se pratiti praćenjem ekspresije CD4 i CD8 ekspresije u timocitima. Progresija ovog razvojnog programa ide od dvostruko negativnih (CD4CD8) timocita do dvostruko pozitivnih (CD4*CD8) timocita, a zatim do jednostruko pozitivnih (CD4*ili CD8*)timocita. Osim toga, unutar dvostruko negativnog stadijuma, četiri različite subpopulacije se mogu identifikovati, na osnovu ekspresije CD25 i CD44, poznate kao DN1(CD44*CD25),DN2 (CD44*CD25*), DN3 (CD44 CD25*) i DN4 (CD44 stepen CD25) (Germain 2002). Preuređenje gena tokom razvoja timocita događa se dva puta – jednom u fazi dvostruko negativnih timocita u fazi CD25*CD44 (Krangel 2009), a zatim ponovo u fazi dvostruko pozitivnih timocita prije nego što napreduje u odvojene CD4* i CD8t pojedinačno pozitivne populacije (Livak et al. 1999). Nedostatak ATM-a je povezan sa defektima u oba napada preuređivanja kod miševa (Vachio 2007, Hathcock 2013). Stoga smo uporedili udio ćelija u timusu koje eksprimiraju ove različite razvojne površinske markere ćelija kod naših miševa s nedostatkom ATM i kontrolnih miševa (Sl.7). AtmR35xR35×; Aptx i Atm35×; Aptx^ ali ne i AtmR35XR35; Aptx* miševi su imali značajno povišene proporcije CD44*CD25, CD44*CD25t i CD44CD25* ćelija u poređenju sa divljim tipom (Slika 7A) Čini se da su ove povećane proporcije dijelom posljedica smetnje CD44 CD25t ćelija koje sazrijevaju u CD44 CD25 dvostruko negativne ćelije, kao frakcija CD44CD25 ćelija iz Atm735xR35×; Aptx'i Atm35× plus ; Aptx'miševi su značajno niži od divljeg tipa (slika 7A). Interesantno je da je nedostatak APTX-a sam po sebi imao najveći uticaj na gubitak DN4 ćelija, što sugeriše da je nedostatak APTX-a, a ne nedostatak ATM-a, odgovoran za ovaj efekat. Prema našim saznanjima, ovo otkriće po prvi put implicira APTX u preuređenje gena tokom procesa TCR rekombinacije. Zatim smo pogledali proporcije CD4*CD8t timocita u poređenju sa CD4tCD8 i CD4CD8 plus jednostruko pozitivnih timocita u ova četiri različita soja. U skladu sa našim rezultatima u krvi i prethodnim studijama, otkrili smo da su miševi sa nedostatkom ATM, ali ne i kontrolni miševi, pokazali smanjenu ekspresiju CD4*CD8 i CD4CD8* pojedinačnih pozitivnih timocita (slika 7B). Ovi rezultati podržavaju ulogu ATM-a u preuređenju TCR a/δgena tokom razvoja timocita (Bredemeyer et al. 2006), ulogu koja je nezavisna od uloge koju ima APTX u ranom sazrevanju timocita.

2.7 Čitajući molekuli prevazilaze PTC kako bi obnovili ekspresiju ATM-a

Naš primarni razlog za umetanje klinički relevantne besmislene mutacije u gen Atm bio je stvaranje miša koji je podložan kritičkom pretkliničkom testiranju novog skupa SMRT spojeva. Prethodno smo pokazali da SMRT spojevi obnavljaju proizvodnju ATM proteina u limfoblastoidnim ćelijskim linijama koje su izvedene od AT pacijenata prevladavanjem kodona preranog terminiranja (PTC) uzrokovanih besmislenim mutacijama (Du et al. 2013). Kako bismo demonstrirali prikladnost ovog novog AT životinjskog modela za testiranje SMRT spojeva, odlučili smo direktno ispitati njihovu sposobnost da obnove ekspresiju ATM-a koristeći eksplantacijski pristup koji zaobilazi izazove povezane s isporukom in vivo (npr. bioraspoloživost, put isporuke, itd.). Ekspresija ATM-a je mjerena u uzorcima iz slezene, gdje je ATM normalno izražen na visokim nivoima, i malog mozga, ključnog ciljnog tkiva za poremećaj. Da li smo izložili ova tkiva eksplantata, sakupljena od homozigotnih Atm?35× i Atm? 35 miševa sa bilo kandidatom SMRT spojem (GJ103) ili aminoglikozidom za koji se ranije znalo da ima svojstva čitanja (G418), a zatim je izmjereno ATM ekspresiju imunoblotom kako bi se procijenila restauracija. Kod oba tipa miševa sa nedostatkom ATM-a, ekspresija ATM je konzistentno obnovljena u slezeni i malom mozgu i G418 i GJ103 (slika 8). Ovi rezultati pokazuju da naša SMRT jedinjenja mogu omogućiti čitanje najmanje 2 od 3 moguće besmislene mutacije koje uzrokuju PTC i daju obrazloženje za in vivo testiranje efikasnosti u sljedećim studijama.