Nerandomizirano ispitivanje koje istražuje utjecaj konzumiranja smeđe riže na mikrobiotu crijeva, pažnju i kratkoročno radno pamćenje kod tajlandske djece školskog uzrasta, 2. dio

2.4. Kvantitativna analiza fekalne mikrobiote

Uzorci fekalija su prikupljeni od djece na početku, 4., 15., 56. i 61. sedmica i 71. sedmica u steriliziranim posudama i odmah su zamrznuti na -80 ◦C. Ekstrakcija mikrobne DNK i kvantitativno mjerenje apsolutnog obilja fekalne mikrobiote izvedeni su kao što je prethodno opisano [29].

Odnos između kvantitativnih mjera i pamćenja tema je vrijedna proučavanja. Za mnoge probleme u životu, problemi s pamćenjem često su ti koji ljudi muče, kao što su nesposobnost da se sjete važnih stvari, zaboravljanje termina, itd. U ovom trenutku, kvantitativne metode mjerenja nam mogu pomoći da razumijemo situaciju pamćenja i napravimo ciljana poboljšanja .

Metode kvantitativnog mjerenja mogu kvantificirati pamćenje ljudi pomoću naučnih sredstava. Na osnovu toga, predložene su neke specifične i efikasne metode za treniranje pamćenja. U svakodnevnom životu možemo koristiti i jednostavne metode za treniranje pamćenja, kao što je pamćenje riječi, poezije, itd. Sve su to efikasni načini za razvoj dobrog pamćenja.

Istovremeno, možemo poboljšati i pamćenje u svim aspektima života. Na primjer, ako želimo da zapamtimo novu riječ iz vokabulara, možemo je pročitati nekoliko puta, napisati nekoliko puta ili je povezati s njenim značenjem, tako da će pamćenje biti dublje.

U eri eksplozije informacija, često se osjećamo preplavljeni informacijama. Mnogo puta moramo zapamtiti mnogo stvari, ali ne znamo kako se nositi s tim informacijama. U ovom trenutku možemo koristiti kvantitativne metode mjerenja kako bismo odredili svoj status pamćenja, a zatim trenirali i poboljšali se na osnovu specifičnih situacija. Uz razumne metode pamćenja, možemo efikasno poboljšati svoje pamćenje i pružiti više pogodnosti za naš život i rad.

Ukratko, odnos između kvantitativnog mjerenja i pamćenja je neodvojiv. Moramo da koristimo naučne metode da otkrijemo stanje našeg pamćenja, a zatim da sprovedemo efikasan trening zasnovan na specifičnim situacijama. Vjerujem da ćemo sve dok neumorno treniramo moći ojačati pamćenje i poboljšati kvalitet života. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer i Cistanche deserticola može regulisati ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta. Ove supstance su veoma važne za pamćenje i učenje. Osim toga, meso može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati suplemente za jačanje pamćenja

Ukratko, mikrobna genomska DNK ekstrahirana je iz fekalnih uzoraka pomoću innuPREP stolice DNK kompleta (Analytik Jena Biometra, Jena, Njemačka), a koncentracija i čistoća DNK određivani su pomoću Take 3Micro-Volume Plate (Biotek, Winooski, VT, SAD).

Apsolutno obilje rRNA gena mikrobiota16 je zatim kvantificirano putem qPCR-a korištenjem Termalnih ciklusa u realnom vremenu CFX96 TouchTM (Bio-Rad, Singapur) na osnovu specifičnih prajmera prikazanih u Tabeli S1.

Uslovi qPCR-a i procjene broja kopija mikrobiote izvedene su prema prethodnom protokolu [37]. Log10 16S rRNA broj kopija po gramu fecesa vlažne težine predstavljen je u našim Dodatnim podacima.

2.5. Statistička analiza

Distribucija podataka je ispitana kroz Shapiro–Wilkov test i Levenov test (stats paket verzija 4.0.3). Za vizualizaciju podataka korišten je R paket ggplot2 [38]. Benjamini-Hochberg (BH) korekcija p-vrijednosti je primijenjena za višestruku korekciju testiranja (q-vrijednost). Značajnost je određena na q < 0.05. Sve statističke analize obavljene su u R softveru verzije 4.0.3 [39].

Razlike u srednjim apsolutnim količinama crijevne mikrobiote između interventnih grupa za svaku vremensku tačku određene su t-testom ili Wilcoxon testom sume ranga prema normalnosti distribucije podataka.

Promjene u crijevnoj mikrobioti između vremenskih tačaka svake faze (unutar ispitanika) procijenjene su korištenjem parnih t-testova ili Wilcoxon potpisanih rang testova nakon značajnih rezultata iz jednosmjernih ponovljenih mjerenja ANOVA ili Friedmanovog testa (p < 0.05 ). Promjene u apsolutnom obilju crijevne mikrobiote između sedmica izražene su kao log2 transformirane promjene nabora (Log2FCs).

Odnosi između apsolutne količine crijevne mikrobiote i starosti djece školskog uzrasta određeni su korištenjem Pearsonovog ili Spearmanovog koeficijenta rang korelacije.

Povezanost između crijevne mikrobiote i intervencije u svakoj vremenskoj tački, prilagođavajući se demografskim varijablama (dob, spol, BMI z-score, način porođaja, evidencija rođenja i etnička pripadnost), procijenjena je permutacijskom multivarijantnom analizom varijanse (PERMANOVA) koristeći Adonisovu funkciju . Da bi se istražio učinak intervencije u sedmicama svake faze, PERMANOVA je provedena korištenjem učesnika kao slojeva i prilagođavanjem za kovarijate. Uslov homogenosti zasnovan na Euklidskoj udaljenosti mjeren je betadinskom funkcijom.

Permutacija je izvedena na 999 u R paketu vegan(2.6-2) [40]. Nadalje smo utvrdili utjecaj intervencije na mikrobiotu crijeva koristeći analizu redundanse (RDA) uz prilagođavanje za kovarijate.

Tretmani su korišteni kao ograničene objašnjavajuće varijable, a apsolutne količine crijevne mikrobiote korištene su kao varijable odgovora. Značaj ograničenja je procijenjen korištenjem ANOVA testa permutacije (permutacija=999). Korištenjem funkcije koraka na osnovu AIC kriterija izvršen je postupni odabir varijabli objašnjenja.

Kognitivni ishodi između interventnih grupa za svaku sedmicu upoređivani su korištenjem Welchovog t-testa sa dva uzorka ili Wilcoxon testa sume ranga. Razlika u kognitivnim performansama u sedmicama svake faze (unutar ispitanika) utvrđena je korištenjem Wilcoxon signed rang testa nakon značajnih rezultata Friedmanovog testa (p < 0.05).

Koristili smo RDA da odredimo efekat intervencije na kognitivne performanse dece školskog uzrasta uz prilagođavanje starosti i pola. Utjecaj vremenskih tačaka na obilje crijevne mikrobiote također je procijenjen putem RDA koristeći učesnike kao stratume.

Stanje RDA se nastavilo kako je gore opisano. Da bismo utvrdili vezu između kognitivnih performansi i crijevne mikrobiote, koristili smo Spearmanov koeficijent korelacije ranga.

Višefaktorska analiza (MFA) je izvršena kako bi se istražile varijacije u mikrobioti crijeva koje se mogu objasniti intervencijom i varijablama domaćina (starost i spol) korištenjem FactoMine R verzije 2.4 [41] i vizualizacijom sa Factoextra verzijom 1.0. 7 [42].

3. Rezultati

3.1. Karakteristike djece školskog uzrasta

Nakon kontrole kvaliteta podataka (slika 1), analizirali smo preostalih 85 i 57 djece u fazi I i II, respektivno. Djeca su na početku bila u prosjeku stara 7,02 i 10,52 godine za WR i SLR grupe, respektivno.

Osnovne karakteristike kontrolne i interventne grupe su se značajno razlikovale po godinama (p < {{0}}.0001), težini (p < 0,0001), visini (p < 0,0001), BMI z- rezultat (p=0.03) i tip hranjenja (p=0.02) (Tabela S2).
Sličan obrazac je također uočen u svim vremenskim tačkama studije, osim za BMI, koji se nije značajno razlikovao između grupa u sedmici 71 (Tabele S3-S7).

3.2. Učinak intervencije sinlek riže na crijevnu mikrobiotu djece školskog uzrasta

Uzimajući u obzir svaku od vremenskih tačaka, nije bilo značajnih razlika u apsolutnom obilju crijevne mikrobiote između kontrolne (WR) i Sinlek intervencijske (SLR) grupe u prvoj fazi intervencije (I faza; polazni, 4. i 15. sedmica ).

Multivarijantna poređenja koristeći PERMANOVA (po marginama) također su pokazala da intervencija u fazi I nije imala značajan utjecaj na promjene u mikrobioti crijeva nakon prilagođavanja za demografske varijable (dodatni fajl S1).

Nadalje smo utvrdili povezanost između obilja crijevne mikrobiote i starosti i otkrili da je Lactobacillus negativno korelirao sa starošću na početku (Pearsonova korelacija; R {{0}} −0.24, p {{ 3}}.026) i sedmica 4 (Pearsonova korelacija; R=−0,3, p=0.002) (Slika 2b,d). Za drugu fazu intervencije (Faza II), promjene u obilju mikroba su, međutim, označene u sedmicama 61 i 71. Obilje ukupnih bakterija (q=0.032) i Firmicutes (q=0.032 ) su značajno povećane, dok je nivo gamaproteobakterija (q < 0,0001) značajno smanjen nakon SLR intervencije u 61. sedmici (Slika 2e–g).

Ove bakterije su također bile značajno povezane sa starošću, gdje su obilje ukupnih bakterija (Pearsonova korelacija; R {{0}} −0.32, p=0.0 15) i Firmicutes (Pearsonova korelacija; R=-0,32, p=0.014, Slika 2h) opadali su sa porastom starosti, dok je apsolutna brojnost gamaproteobakterija bila u pozitivnoj korelaciji sa godinama (Pearsonova korelacija; R { {11}}.62, p < 0,0001, slika 2i).

U sedmici 71, nivo Bacteroidetes je značajno smanjen u SLR grupi (q < 0.0001) (Slika 2j), a njegova brojnost je u pozitivnoj korelaciji sa godinama (Spearmanova rang korelacija; R { {4}}.57, p < 0,0001, slika 2l).

Uzimajući u obzir promjene u obilju crijevne mikrobiote tijekom sedmica (unutar ispitanika) kontrolne i interventne grupe, uočili smo slične obrasce u dvije grupe učesnika. Činilo se da gamaproteobakterije jako fluktuiraju nakon intervencije: njihova brojnost je značajno smanjena u sedmici 4 i sedmici 61 (slike 3a, b, S1c i S2c, Dodatni fajl S2).

Međutim, činilo se da se nivoi ovih bakterija vraćaju nazad na kraju svake faze (15. i 71. sedmica). Štaviše, brojnost Bacteroidetes za SLR grupu bila je niža u 71. sedmici u odnosu na 56. i 61. sedmicu (Slike 3a i S2e). Postupno smanjenje brojnosti dva mikrobna taksona, naime, Ruminococcus i Bacteroides, također je uočeno tokom faze II, pri čemu je njihova zastupljenost bila najniža na krajnjoj točki ispitivanja (71. sedmica) (Slike 3b i S2f,g), bez obzira na intervenciju.

Nadalje, procijenili smo da li postoje razlike u obilju crijevne mikrobiote između tretmana i tokom sedmica koristeći učesnike kao slojeve. PERMANOVA je pokazala da prisustvo tretmana i/ili vremenska tačka ispitivanja (sedmica) tokom obje faze ima značajne marginalne efekte na obilje crijevne mikrobiote (p < 0.05).

Disperzije (varijanse) između grupa i modela koji uzima u obzir demografske varijable sa statističkom značajnošću sumirani su u Dodatnoj datoteci S3. Dalje smo istražili snagu povezanosti i varijacije crijevne mikrobiote objašnjene intervencijom korištenjem RDA. Značajne razlike nađene su samo u fazi II.

Obilje gamaproteobakterija je više obogaćeno u kontrolnoj grupi (WR) nego u SLR grupi, dok su veće ukupne bakterije, Firmicutes i Bacteroidetes bile povezane sa SLR intervencijom u 61. sedmici (RDA1 je objasnio 30,58% ukupne varijanse, R2adj {{5} }.29,p=0.001, slika 3c). Za sedmicu 71, brojnost Bacteroidetes bila je veća u kontrolnoj grupi nego u SLR grupi (RDA1 je objasnio 8,18% ukupne varijanse, R2adj=0.06,p=0.005, slika 3d) .

Zatim smo nastavili sa postepenim odabirom varijabli koje objašnjavaju (intervencijske i demografske varijable) na osnovu AIC-a. Model je otkrio da je samo intervencija značajno objasnila varijacije u profilima crijevne mikrobiote djece školskog uzrasta (q=0.035).

3.3. Kognitivni učinak između kontrolne i interventne grupe

U fazi I, pronašli smo značajne razlike između kontrolne i interventne grupe u kognitivnim ishodima. SLR grupa je pokazala značajno više rezultate na Corsi block-tapping testu (nazvan MMG, igra uparivanja memorije) i ukupne performanse (OVP) na testu psihomotoričke budnosti (PVT-B), dok su vrijeme reakcije (RT) i propusti bili niži od kontrolne. grupa (slika 4).

U fazi II, obrasci kognitivnih performansi ostali su nepromijenjeni. Također smo uporedili kognitivne performanse (unutar ispitanika) kroz sedmice svake faze i otkrili da je kontrolna grupa (faza I) imala bolje rezultate u vezi s propustima u 15. sedmici u odnosu na početnu liniju i sedmicu 4 (q=0.02) (Slika S3). RT je bio veći u 15. sedmici u poređenju sa sedmicom 4 (q=0.008), dok nisu otkrivene značajne razlike u MMG ili OVP. MMG je bio jedini kognitivni ishod koji je bio značajno viši za SLR grupu (faza I) u 15. sedmici u odnosu na početnu liniju (q=0.003) i sedmicu 4 (q=0.03) (Slika S4) .

U fazi II, nije bilo značajnih razlika tokom sedmica ni u jednom od mjerenja kognitivnih performansi u kontrolnoj ili SLR grupi. Osim toga, dob i spol su također uključeni u RDA, a rezultati nisu pokazali nikakav interventni efekat na kognitivne performanse djece u bilo kojoj grupi u bilo kojoj vremenskoj tački tokom 71 sedmice ispitivanja.

Međutim, utvrđeno je da dob značajno opisuje varijacije kognitivnih ishoda na početku (p=0.008), 4. sedmici (p=0.005) i 15. sedmici (p=0 .028) (Slika 5), ​​za koju je starost pozitivno korelirala sa MMG i OVP. Nisu pronađeni značajni efekti uzrokovani intervencijom, godinama ili spolom na kognitivne performanse u 56., 61. ili 71. sedmici.

Kada se razmatraju kognitivni profili kroz sedmice svakog tretmana u svakoj fazi, obje sedmice (p=0.001) i spol (p=0.001) značajno su opisali varijacije u kognitivnim performansama kontrolne grupe (faza I) , za koje su ženski spol i 15. sedmica bili u pozitivnoj korelaciji sa MMG i OVP (Slika S5a).

Djeca su imala bolje rezultate u MMG-u u 15. sedmici u SLR grupi (I faza), dok je ženski spol bio u pozitivnoj korelaciji sa propustima i RT (Slika S5b). Efekat tretmana prilagođavanja starosti i pola je takođe procenjen za svaku fazu uz kontrolu za nedelju (vremenske tačke). RDA je pokazao da je starost imala jaku vezu sa OVP i MMG u fazi I (Slika S6a), dok je u Fazi II učinak u vezi sa RT i propustima bio lošiji u SLR grupi nego u kontrolnoj grupi (Slika S6b).
Sve u svemu, dob i vremenske tačke su više povezane s kognitivnim učinkom djece školskog uzrasta nego sa intervencijom, a efekat intervencije je uočen samo kada su uzorci ograničeni unutar svake sedmice Faze II nakon prilagođavanja starosti i pola.

3.4. Povezanost između crijevne mikrobiote i kognitivnih performansi djece školskog uzrasta

Pronašli smo slabe korelacije između crijevne mikrobiote i kognitivnih ishoda u svim tačkama intervencije na temelju Spearmanovih koeficijenata korelacije. Nekoliko asocijacija je bilo značajno (p < {{0}}.05), ali samo jedna asocijacija, otkrivena u 4. sedmici za SLR grupu (Roseburia vs. Lapses, rho=-0,40, q {{6 }}.04), ostao je značajan nakon prilagođavanja za višestruka poređenja (Slika S7).

Nekoliko asocijacija koje su se približile značaju pronađeno je u 56. i 71. sedmici. Asocijacije identificirane u SLR grupi u 56. sedmici uključivale su Faecalibacterium–RT (rho=0.62, q=0.07 ), Prevotella–OVP(rho=−0.55, q {{10}}.08), Gammaproteobacteria–OVP (rho=−0.58, q=0.07), i Faecalibacterium–OVP (rho=−0.64, q=0.05). U sedmici 71, Faecalibacterium je bila u pozitivnoj korelaciji sa RT u kontrolnoj grupi (rho=0.62, q=0.07).

Uzimajući u obzir dob i spol, dalja analiza povezanosti između crijevne mikrobiote i kognitivnih performansi u svakoj vremenskoj tački obavljena je korištenjem MFA kako bi se otkrile varijacije između pojedinačnih profila tretiranih grupa (dodatni fajl S4).

Iako su pojedinačne varijacije objašnjene obiljem crijevne mikrobiote u Dim 1 obje faze (p < 0.0001), snažno razdvajanje između kontrolne i SLR grupe je zabilježeno u Dim 2 (Slike 6 i 7). Na kontrastni profil između ove dvije grupe utjecali su dob i OVP, koji su bili u pozitivnoj korelaciji sa Dim 2 (p < 0,0001), dok su i RT i lapsi bili negativno povezani (p < 0,0001).

Međutim, gamaproteobakterije su bile najuticajnije u opisivanju individualnih varijacija u ovoj dimenziji u sedmici 61 (p < 0.0001). Nivo ove bakterije bio je niži u SLR grupi (koordinata=−1,35, p < 0,0001).

Unatoč nejednakim veličinama uzoraka, MFA je naznačio da je razlika u profilima djece školskog uzrasta u ovom nerandomiziranom kliničkom ispitivanju bila više pod utjecajem dobi i kognitivnih performansi nego crijevne mikrobiote, što ukazuje na manji doprinos intervencije individualnim varijacijama u ovoj studiji.

4. Diskusija

Naša studija nije uočila značajne promjene u apsolutnom obilju crijevne mikrobiote nakon prve faze intervencije Sinlek riže kod djece školskog uzrasta. Međutim, značajne razlike između grupa su uočene u fazi II (61. i 71. sedmica) za totalbacteria, Firmicutes, Bacteroidetes i Gammaproteobacteria.

Također smo uočili značajne razlike u kognitivnim performansama između kontrolne i interventne grupe u obje faze. Ni u jednom trenutku nismo pronašli jaku korelaciju između crijevne mikrobiote i kognitivnih performansi.

Daljnje analize sugerirale su da u ovoj kohorti, Sinlek intervencija na riži nije doprinijela varijacijama u mikrobioti crijeva i kognitivnim profilima djece školskog uzrasta, jer su ishodi prvenstveno bili pod utjecajem dobi.

For more information:1950477648nn@gmail.com