Zerumbone, tropski đumbir seskviterpen iz Zingiber Officinale Roscoe, ublažava melanogenezu izazvanu -MSH u B16F10 ćelijama, 1. dio

sažetak:Pokazalo se da zerumbon (ZER), aktivni sastojak porodice Zingiberaceae, ispoljava nekoliko bioloških aktivnosti, kao što su protuupalno, antialergijsko, antimikrobno i antikancerogeno; međutim, nije proučavana anti-melanogena svojstva. U ovoj studiji, pokazali smo da su ZER i Zingiber oficinalni (ZO) ekstrakti koji značajno smanjuju akumulaciju melanina u -melanocit-stimulirajućim hormonom (-MSH)-stimuliranim mišjim melanogenim B16F10 stanicama. Nadalje, da bismo razjasnili molekularni mehanizam kojim ZER potiskuje akumulaciju melanina, analizirali smo ekspresiju transkripcionog faktora povezanog s melanogenezom, transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom (MITF) i njegovih ciljnih gena, kao što su tirozinaza, protein povezan s tirozinazom 1 ( TYRP1), i protein 2 povezan sa tirozinazom (TYRP2), u B16F10 ćelijama koje su stimulisane -MSH. Ovdje smo otkrili da ZER inhibira MITF posredovanu ekspresiju melanogenih gena nakon -MSH stimulacije. Osim toga, ćelije tretirane različitim koncentracijama zerumbona i ZO pokazale su povećanu fosforilaciju kinaza 1 i 2 (ERK1/2) reguliranih ekstracelularnim signalom, koje su uključene u mehanizam degradacije MITF. Farmakološka inhibicija ERK1/2 upotrebom U0126 dovoljno je preokrenula antimelanogeni učinak ZER-a, sugerirajući da je povećana fosforilacija ERK1/2 potrebna za njegovu antimelanogenu aktivnost. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da se ZER i ZO ekstrakti mogu koristiti kao aktivni sastojci u kozmetici za izbjeljivanje kože zbog njihovog antimelanogenog učinka.

Prema relevantnim studijama, cistanche je uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite efekte kao nprantioksidans,protuupalnoi unapređenje imunološke funkcije. Mehanizam izmeđucistancheiizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom dejstvu cistancheaglikozidi. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju kataliziratirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva učešće kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu.inhibiranje proizvodnje melanina.

Kliknite na Kako koristiti Cistanche

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ključne riječi:zerumbone; Zingiber officinal Roscoe; melanogeneza; MITF; ERK1/2

1. Uvod

Melanogenezu, proizvodnju melanina epidermalnim melanocitima, stimulira -melanocit stimulirajući hormon (-MSH) koji se luči iz keratinocita nakon izlaganja ultraljubičastom (UV) zračenju [1,2]. Faktor matičnih ćelija (SCF) je još jedan melanogen faktor koji striktno kontroliše migraciju melanocita, proliferaciju i diferencijaciju za održavanje postnatalne kožne melanogeneze [3]. Transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom (MITF), koji je melanogeni faktor transkripcije, aktivira se putem signalnog puta cAMP-PKA-CREB (ciklični adenozin monofosfat-protein kinaza A-cAMP odgovorni element koji vezuje protein) nakon -MSH stimulacije receptora melanokortina 1 (MC1R) u citoplazmatskim membranama epidermalnih melanocita [4]. Poznato je da nekoliko hemikalija, kao što su forskolin i IBMX (3-izobutil-1-metilksantin), aktiviraju cAMP-PKA-CREB signalni put, što dovodi do indukcije melanogeneze [5]. Nekoliko studija je otkrilo da trajna aktivacija ekstracelularno reguliranih kinaza 1 i 2 (ERK1/2), koja je uključena u molekularni mehanizam onkogeneze, potiče MITF fosforilaciju na Ser73 i njegovu kasniju degradaciju putem proteolize zavisne od ubikvitina [6,7 ]. Zaista, prijavljeno je da U0126, selektivni inhibitor ERK1/2 puta, povećava ekspresiju MITF-a i aktivnost tirozinaze, što dovodi do proizvodnje melanina [6]. Stabilizirani i aktivirani MITF povećava ekspresiju melanogenih gena, kao što su tirozinaza, protein 1 (TYRP1) povezan s tirozinazom i protein 2 (TYRP2). Transformaciju tirozina u 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), što je početni korak melanogeneze, katalizira tirozinaza. Proteini povezani s tirozinazom (TRPs) kataliziraju daljnje reakcije oksidacije i tautomerizacije [8]. Nakon sinteze melanina, zreli melanin se transportuje iz epidermalnih melanocita u citoplazmu bazalnih keratinocita kako bi zaštitio stanice od UV zračenja [2].

Abnormalno povećana melanogeneza uzrokuje više vrsta kožnih poremećaja, kao što su rak kože, kloazma i pjege [4]; stoga su male molekule ili prirodni proizvodi koji ciljaju ili na katalitičku aktivnost tirozinaze, ili na regulatore signalnih puteva u melanogenezi, uključujući ERK1/2, ili MITF posredovanu transkripciju melanogenih gena, identificirani kao aktivni sastojci koji se koriste u kozmetici industrija. Nekoliko malih molekula, kao što su kojična kiselina, arbutin i niacinamid, naširoko se koriste kao kozmetički sastojci zbog svojih antimelanogenih aktivnosti. Međutim, izvještaji su pokazali da kojična kiselina uzrokuje višestruke nuspojave, uključujući citotoksičnost, dermatitis, rak kože i hepatocelularni karcinom, zbog svoje genotoksične aktivnosti [9]. Iako se arbutin koji je izoliran iz biljke medvjeđeg bobica koristio za liječenje poremećaja hiperpigmentacije, nedavno je njegova upotreba kao kozmetičkog sastojka ograničena zbog nekoliko nuspojava [9]. Prijavljeno je da niacinamid ima antimelanogenu aktivnost i to djelovanje se provodi inhibiranjem prijenosa melanosa iz melanocita u okolne keratinocite [10]. Stoga se općenito koristi kao spoj za izbjeljivanje kože u kozmetičkoj industriji. Kako bi se prevazišla ograničenja uspostavljenih sredstava za izbjeljivanje kože koja imaju nekoliko nuspojava, važno je razviti sigurne sastojke za izbjeljivanje kože dobivene iz prirodnih izvora. Na primjer, -tujaplicin, linderanolid B, 4-butil resorcinol i plumbagin su identificirani kao antimelanogena jedinjenja zbog njihovog inhibitornog djelovanja na tirozinazu [4,11]. Nobiletin, withaferin A, sesamol i chaetocin pokazuju antimelanogena svojstva modulacijom signalnih intermedijara u putu melanogeneze [11].

Zerumbon (ZER) je prirodni proizvod, koji je izoliran iz hlapljivih eteričnih ulja biljaka koje pripadaju porodici Zingiberaceae, kao što su Zingiber zerumbet Smith i Zingiber officinal Roscoe [12]. Nekoliko studija je pokazalo da ZER ima širok spektar bioloških aktivnosti, uključujući antimikrobne, antioksidativne, antidijabetičke, antikancerogene, protuupalne, antialergene i antiangiogene aktivnosti [12]. Zanimljivo je da se pokazalo da ZER ispoljava zaštitni učinak protiv oksidativnog oštećenja keratinocita kože izazvanog ultraljubičastim A (UVA), zahvaljujući svojoj sposobnosti da hvata reaktivne vrste kisika (ROS) putem aktivacije nuklearnog faktora-E{{8} }povezani faktor-2 (Nrf2) [1,13]. To sugerira da se ZER može koristiti kao funkcionalni aditiv u kozmetici za njegu kože. Međutim, detaljan mehanizam antimelanogenih svojstava ZER djelovanja tek treba proučiti.

U ovoj studiji, proučavani su inhibitorni efekti ZER-a i Zingiber officinal (ZO) ekstrakta na melanogenezu stimulisanu -MSH i njihovi osnovni mehanizmi. Ovdje pokazujemo da ZER značajno potiskuje melanogenezu izazvanu -MSH tako što povećava fosforilaciju ERK1/2 i inhibira MITF posredovanu ekspresiju melanogenih gena.

2. Rezultati

2.1. Zerumbone (ZER) potiskuje -MSH indukovanu melanogenezu u B16F10 ćelijama melanoma miša

Za proučavanje antimelanogenog efekta zerumbona (ZER), prvobitno smo procijenili njegovu citotoksičnost u B16F10 i HaCaT ćelijama. Hemijska struktura ZER-a prikazana je na slici 1A. Uočeno je da ZER pri koncentracijama iznad 20 µM pokazuje snažan citotoksični učinak, dok kod onih ispod 20 µM ZER nije pokazao citotoksičnost u obje ćelijske linije (Slika 1B). Zatim smo istraživali inhibitorne efekte ZER-a na akumulaciju i lučenje melanina u B16F10 ćelijama izazvane hormonom stimulacije melanocita (-MSH). Pokazalo se da ZER snažno potiskuje intracelularnu akumulaciju melanina izazvanu -MSH-om i njegovu sekreciju u kultivirani medij (Slika 1C, D). Štaviše, otkrili smo da ZER slabije melanogenezu efikasnije od 1 mM arbutina ili 0,2 mM kojične kiseline, dobro poznatih aktivnih sastojaka kozmetike za izbjeljivanje kože (slika 1D). Da bismo razjasnili da li je ZER dovoljan za suzbijanje melanogeneze u ljudskim ćelijama, koristili smo ćelije humanog melanoma G361 koje proizvode melanin. Kao što je prikazano na slici 1E, ZER značajno smanjuje sadržaj ekstra- i intracelularnog melanina izazvan faktorom matičnih ćelija (SCF). Ovi rezultati potvrđuju antimelanogenu aktivnost ZER-a u melanogenim mišjim B16F10 i ljudskim G361 ćelijama.

2.2. Zerumbone potiskuje ekspresiju gena transkripcionog faktora melanogeneze, MITF-a i njegovih ciljnih gena u G361 ljudskim ćelijama melanoma 

Izvještava se da endotelin{0}} i SCF signalizacija igraju bitnu ulogu u melanogenezi u ljudskim melanocitima i nekoliko podtipova melanoma [3,14–16]. U ovoj studiji smo otkrili da ZER potiskuje melanogenezu na melanogene stimuluse, -MSH i SCF, u ćelijama melanoma miša B16F10 i humanog G361 (Slika 1).

Stoga smo mjerili promjene u nivoima ekspresije gena i proteina povezanih s melanogenezom nakon SCF stimulacije u ćelijama humanog melanoma G361. Otkrili smo da ZER smanjuje ekspresiju MITF-a izazvanu SCF-om i proteina tirozinaze 2-4 h, odnosno 24-48 h nakon SCF stimulacije (Slika 2A). Osim toga, genska ekspresija gena povezanih s melanogenezom, kao što su MITF, tirozinaza i protein 1 povezan s tirozinazom (TYRP1) je potisnut u ZER-tretiranim G361 ćelijama (Slika 2B, C). Ovi rezultati su otkrili vršno vrijeme za ekspresiju gena povezanih s melanogenezom nakon SCF stimulacije; maksimalna indukcija MITF mRNA je uočena u roku od 1-2 h, a uočeno je da nivoi mRNA tirozinaze i TYRP1 dostižu svoj maksimum 24-48 h nakon SCF stimulacije.

2.3. Zerumbone potiskuje ekspresiju melanogenih gena i enzima u B16F10 ćelijama miša

Da bismo istražili molekularni mehanizam kojim ZER potiskuje melanogenezu, izmjerili smo ekspresiju gena transkripcionog faktora melanogeneze, MITF, i njegovih ciljnih gena, kao što su protein 1 povezan s tirozinazom (TYRP1), tirozinaza i protein 2 povezan s tirozinazom (TYRP2). u odsustvu ili prisustvu ZER-a. Budući da je vrijeme vrhunca ekspresije gena povezanih s melanogenezom nakon stimulacije SCF i -MSH poznato za ljudske G361 (Slika 2) i mišje B16F10 melanomske ćelije [4], dalje smo mjerili ekspresiju MITF, tirozinaze, TYRP1 i TYRP2. u ZER tretiranim ćelijama melanoma miša B16F10 nakon 2 h ili 48 h inkubacije sa -MSH. Slika 3A pokazuje da je ZER dovoljan da oslabi ekspresiju MITF, TYRP1, TYRP2 i tirozinaze izazvanu -MSH u B16F10 ćelijama. Slično, nivoi ekspresije MITF, tirozinaze i TYRP2 proteina su smanjeni nakon tretmana ZER. Fosforilacija CREB posredovana protein kinazom A (PKA) je glavni signalni put koji povećava MITF na nivou transkripcije nakon -MSH stimulacije [4]. Stoga smo ovdje analizirali da li smanjena fosforilacija CREB-a pomoću ZER-a može posredovati u supresiji MITF-a. Otkrili smo da -MSH-indukovana CREB fosforilacija nije bila pod uticajem ZER tretmana, što sugeriše da ZER potiskuje -MSH-indukovanu MITF ekspresiju nezavisno od ose signalnog puta PKA-CREB (Slika 3B). Budući da je tirozinaza enzim koji ograničava brzinu, koji reguliše sintezu melanina [2,4,11], dalje smo analizirali nivoe intracelularnog proteina tirozinaze i njegovu enzimsku aktivnost nakon tretmana arbutinom, kojičnom kiselinom i ZER-om. Slika 3C pokazuje da ZER u dovoljnoj meri smanjuje nivoe proteina tirozinaze izazvane -MSH u B16F10 ćelijama. Osim toga, slika 3D otkriva da 10 µM ZER učinkovitije suzbija oksidaciju L-DOPA od inhibitora tirozinaze, arbutina i kojične kiseline, što sugerira da je oksidacija L-DOPA u dopakinon putem enzimske aktivnosti tirozinaze potisnuta u stanicama tretiranim ZER-om. . Ovi rezultati pokazuju da ZER atenuira melanogenezu posredovanu -MSH supresijom genske ekspresije MITF-a, transkripcionog faktora povezanog s melanogenezom, i njegovih ciljnih gena.

2.4. Anti-melanogeni efekat Zerumbone-a je kroz fosforilaciju ERK1/2

Poznato je da aktivacija protein kinaze B (AKT) i kinaza reguliranih ekstracelularnim signalom (ERK1/2) faktorima rasta ili melanogenim stimulansima potiskuje melanogenezu kroz smanjenu ekspresiju MITF-a i njegovih ciljnih gena [11]. Fosforilacija MITF-a na Ser73 i Ser409 kao odgovor na ERK1/2 signalni put promoviše njegovu proteazom zavisnu degradaciju [17,18]. Stoga smo istražili da li ZER reguliše fosforilaciju ERK1/2 u ćelijama B16F10 miša i G361 humanog melanoma. Povećana fosforilacija ERK1/2 (p-ERK1/2), ali ne i ukupna ERK1/2 (T-ERK1/2) uočena je nakon tretmana ZER na način ovisan o vremenu i dozi (Slika 4A, B). Zanimljivo je da je uočeno da se fosforilacija ERK1/2 brzo povećava u roku od 10-30 minuta i 1-2 h nakon ZER tretmana u ćelijama melanoma miša B16F10 i humanog G361 (Slika 4A). Međutim, fosforilacija AKT i MEK nije uočena nakon tretmana ZER, što sugerira da ZER-indukovana ERK1/2 fosforilacija može potisnuti MITF (slika 4B). Budući da ERK1/2 fosforilacija potiče fosforilaciju i proteazomsku degradaciju MITF-a [17,18], istražili smo da li inhibitor proteasoma sprječava smanjenje MITF-a pomoću ZER-a. Supresija MITF-a od strane ZER-a nije uočena u prisustvu MG132, što potvrđuje da ZER smanjuje ekspresiju MITF-a kroz proteazomalnu degradaciju (slika 4C). Zatim smo istražili da li ZER fosforilira MITF na Ser73, koji je ciljni ostatak ERK1/2. Da bi se otkrio fosforilirani MITF, ćelije su bile izložene -MSH i MG132. Ovdje smo otkrili da je fosforilirani MITF (Ser73) značajno povećan sa ZER u prisustvu -MSH i MG132 (Slika 4D). U0126, selektivni inhibitor protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) [19], ukinuo je ZER-indukovanu MITF fosforilaciju (slika 4D). Štaviše, ukupni nivoi MITF proteina u lizatima celih ćelija (WCL) nisu izmenjeni od strane ZER i U0126 u prisustvu MG132 (slika 4D). Ovi rezultati ukazuju da je ERK1/2-posredovana MITF (Ser73) fosforilacija i proteazomska degradacija kritičan mehanizam u ZER-posredovanoj supresiji MITF-a. Pored toga, Slika 4E pokazuje da je U0126 značajno obnovio smanjene nivoe MITF proteina u ćelijama tretiranim ZER. Konzistentno, smanjeni intracelularni sadržaj melanina pomoću ZER-a je obnovljen do U0126 na približno 40 posto (slika 4F), što sugerira da je aktivacija ERK1/2 potrebna za anti-melanogeni učinak ZER-a.

2.5. Anti-melanogeni efekat ekstrakta Zingiber officinale (ZO).

ZER je fitokemikalija izvedena iz nekoliko biljnih vrsta porodice Zingiberaceae, kao što su Zingiber zerumbet i Zingiber officinal [12]. Stoga smo inicijalno mjerili vitalnost ćelija u odsustvu ili prisustvu ZO ekstrakta u B16F10 i HaCaT ćelijama. Slika 5A pokazuje da vijabilnost ćelija nije promijenjena tretmanom ZO ekstraktom. Dalje smo analizirali antimelanogene efekte Zingiber officinal (ZO) ekstrakta. Budući da je ekspresija MITF-a i njegovih ciljnih melanogenih gena smanjena od strane ZER-a kroz aktivirani ERK1/2 signalni put (Slike 2 i 3), provjerili smo da li ekstrakt ZO potiskuje -MSH-induciran MITF i ekspresiju njegovih ciljnih melanogenih proteina u B16F10 stanicama. Slično antimelanogenom učinku ZER-a, -MSH-inducirani MITF, tirozinaza i TYRP2 su značajno smanjeni ZO ekstraktom na način ovisan o dozi (slika 5B). Zanimljivo je da je fosforilacija ERK1/2 također povećana u ćelijama tretiranim ekstraktom ZO (Slika 5B). Ekspresija MITF-a i njegovih ciljnih gena, kao što su tirozinaza, TYRP1 i TYRP2, značajno je smanjena nakon tretmana sa 5 µg/µL ZO ekstraktom (slika 5C). Štaviše, i ekstracelularni i intracelularni sadržaj melanina je značajno smanjen na otprilike 40 posto nakon tretmana 5 µg/µL ZO ekstraktom (slika 5D). Osim toga, smanjena aktivnost tirozinaze uočena je u ćelijama koje su tretirane ZO ekstraktom (slika 5E). Ovi rezultati sugeriraju da ekstrakt Zingiber officinala (ZO) potiskuje melanogenezu slabljenjem ekspresije melanogenog gena posredovanog MITF-om.

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501