Kako kalcijum liječi oštećenje bubrega uzrokovano luoridom?

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Ključne riječi: Kalcijum, Bubreg, Apoptoza

SAŽETAK

Dugotrajno prekomjerno uzimanje fluorida (F) može uzrokovati oštećenje koštanog i ne-koštanog tkiva. Thebubregje glavni organ za izlučivanje fluora u tijelu. Ova studija imala je za cilj da istraži da li je dijetetskikalcijumsuplementacija može ublažitibubregoštećenja uzrokovana fluorozom i za dalje istraživanje učinakaKalcijumo mehanizmu ublažavanjabubregćelijaapoptozapokrenuo F. Procijenili smo histopatološku strukturu,bubregindikatori funkcije i nivoi ekspresije gena i proteina posredovane receptorom smrtiapoptozaputevi kod Sprague Dawley (SD) štakora tretiranih natrijum fluoridom (NaF) i/ilikalcijumkarbonata (CaCO3) 120 dana. Rezultati su pokazali da 100 mg/L NaF indukujebubreghistopatološke povrede iapoptoza, povećane koncentracije kreatinina (CRE), mokraćne kiseline (UA), azota uree u krvi (BUN), kalija (K), fosfora (P) i F (p < {{0}}}.05)="" ,="" i="" smanjiti="" nivo="" serumskog="" magnezijuma="" (mg)="" (p="">< 0,05).="" štaviše,="" naf="" je="" povećao="" nivoe="" ekspresije="" mrna="" i="" proteina="" fas="" receptora="" smrti="" na="" površini="" ćelije="" (fas),="" faktora="" tumorske="" nekroze="" (tnf),="">apoptoza-indukujući ligand (TRAIL), kaspazu 8, kaspazu 3 i poli ADP-riboza polimerazu (PARP) (p < 0.01),="" koji="" su="" konačno="" aktivirali="" put="" receptora="" smrti.="">Kalcijumsuplementacija je preokrenula smanjenje nivoa CRE, BUN, UA, F i P izazvanog F, ublažila histopatološka oštećenja iapoptozai smanjili nivoe ekspresije gena i proteina markera vezanih za put receptora smrti. Zaključno, 1 postoKalcijumublažava F-indukovanububregapoptozakroz FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL signalne puteve.

Thebubregje glavni organ za izlučivanje fluora u tijelu,cistanchemože zaštititibubregi poboljšatibubregfunkcija.

Uvod

Fluor je široko prisutan u zemljištu, vodi i hrani. Međutim, neki prirodni faktori (trošenje minerala i stijena, formiranjekalcijumi magnezijeve soli, infiltracija podzemnih voda, itd.) i ljudske aktivnosti (industrijske otpadne vode, agrohemikalije, proizvodi za domaćinstvo, itd.) uzrokuju zagađenje okoliša fluorom (Daiwile et al., 2019). Trenutno, najveći faktor izloženosti fluoridu (F) je voda za piće, a preporučena koncentracija F u vodi za piće od strane Svjetske zdravstvene organizacije je manja od 1,5 mg/L (Smjernice za kvalitet vode za piće, 2017). Epidemiološki dokazi sugeriraju da veća od ove koncentracije povećava rizik od dentalne fluoroze, a povećana koncentracija povećava rizik od fluoroze skeleta (Smjernice za kvalitet vode za piće, 2017; Nacionalni savjet za istraživanje, 2006). Dugotrajno izlaganje visokim koncentracijama fluorida može povećati apsorpciju fluora u tijelu kroz respiratorne organe

i digestivni trakt. Prekomjeran unos F može uzrokovati oštećenje koštanih i ne-koštanih organa tijela. Oštećenje mekog tkiva izvan kosti općenito se naziva oštećenjem bez kostiju. Trenutno je utvrđeno da oštećenje nekoštanog tkiva uzrokovano F uključuje probavni trakt, jetru,bubreg, mozak itd. (Jha et al., 2011; Perumal et al., 2013).

Thebubreg, glavni organ za izlučivanje tijela, odgovoran je za metabolizam toksičnih tvari i egzogenih toksina u tijelu. Istraživanja su objavila da se oko 50-80 posto fluorida unesenog u tijelo filtrira i reapsorbuje od stranebubrezi, a preostali fluor se nakuplja u drugim tkivima i organima (Chen et al., 2013; Dharmaratne, 2019). Mnoge vrste literature su pokazale da izlaganje 50 i 100 mg/LF može dovesti do povećanja šupljine bubrežne kapsule, atrofijebubregtubuli, nepravilan raspored papilarnih ćelija, suženje lumena, što rezultiraapoptozaofbubregćelije i pogoršanje biohemijskih funkcija kao što su kreatinin (CRE), mokraćna kiselina (UA),kalcijum(Ca) i fosfor (P) (Song et al., 2014; HW Wang et al., 2020; Wei et al., 2018a).

Apoptoza, vrsta ćelijske smrti koju kontroliraju geni, koja se dijeli na endogenuapoptozai egzogeneapoptoza. Nedavni izvještaji su to ukazivaliapoptozauzrokovano visokim F uglavnom uključuje posredovanje mitohondrijama, endoplazmatski retikulum je posredovan stresom, a putevi posredovani receptorima smrti (Wei et al., 2018a). Prethodni eksperimenti u našoj grupi pokazali su da NaF inducira kosti i jetruapoptozakroz put intracelularnog endoplazmatskog retikuluma (ER) i mitohondrijski put (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Osim toga, studije su također pokazale da je mitohondrijski put uključen u NaF-indukovanuapoptozaod mišabubrezi(Wei et al., 2018b). Međutim, ne postoji sistematska studija o putu posredovanom receptorom smrti kod F-indukovanogbubregapoptoza. Put receptora smrti dominira svakim stadijem egzogenogapoptoza, uključujući put receptora smrti na površini ćelije Fas (FAS), put faktora tumorske nekroze (TNF) i put povezan s TNF-omapoptoza-put induciranja liganda (TRAIL) (Grunert et al., 2012; Lu et al., 2017; Wang i Su, 2018). FAS put je primitivni sistem za transdukciju signala koji posredujeapoptoza. FAS ima karakteristike membranskog receptora i formira trimer nakon vezivanja sa FAS ligandom (FAS-L). Zatim se specifična domena trimera vezuje za domen smrti (DD) odgovarajućeg molekula koneksina FAS-povezanog proteina domene smrti (FADD) kako bi formirao signalni kompleks izazvan smrću (DISC) (Wang i Su, 2018). U sljedećem procesu biološke transdukcije signala, FADD može istovremeno aktivirati kaspazu 8 i familiju kaspaza i na kraju dovesti doapoptozakroz učešće efekta kaspaze 3 i poli ADP-riboza polimeraze (PARP) (Kischkel et al., 2000; Meynier i Rieux-Laucat, 2019). Nedavne studije su pokazale da FAS put posredujeapoptozau T ćelijama i tokombubregneuspjeh izazvan cisplatinom (Djiadeu et al., 2017; Linkermann et al., 2011). Osim toga, studija je također objavila da NaF indukujeapoptozakod miševa kroz FAS put (Sun et al., 2017). TRAIL je priznati citokin u TNF superfamiliji. Veže se za svoje homologne receptore agonista, odnosno receptore smrti (DR4 i DR5). Postoji DD u svojoj ćelijskoj regiji. DD je neophodan za regrutovanje adaptivnog proteina FADD. FADD zauzvrat inducira oslobađanje kaspaza u citoplazmu, aktivirana kaspaza 3 cijepa PARP i inhibira njegov potencijal popravke DNK, što rezultiraapoptoza(Bodmer et al., 2000; Micheau, 2018). Pretpostavlja se da je TRAIL/DR5 put uključen u NaF-indukovanuapoptozakod miševa (Song et al., 2021). Osteoprotegerin (OPG) je slobodni rastvorljivi receptor koji nema transmembranski domen. Može obuzdati posredovano TRAIL-omapoptozainhibiranjem vezivanja TRAIL-a i drugih receptora smrti (Duiker et al., 2006; Kiraz et al., 2016; Micheau, 2018). Vezivanje TNF i TNF receptora (TNF-R1) može aktivirati regrutovanje TNFR-asociranog proteina domene smrti (TRADD) preko njegovog DD. Nakon toga, TRADD stupa u interakciju sa FADD-om, što dovodi do regrutacije pro-kapaze 8, koja se proteolitičkim enzimima cijepa u aktivnu kaspazu 8. Kaspaza 8 tada aktivira kaspazu 3, koja je odgovorna za ćelijuapoptoza(Kiraz et al., 2016; Sedger i McDermott, 2014). Prijavljeno je da NaF inducira hepatociteapoptozakod miševa kroz signalni put TNF-R1 (Lu et al., 2017.)

Kalcijumigra različite uloge u sastavu kostiju i zuba, a takođe može da kontroliše prenos nerava i oslobađanje materijala (Cao et al., 2016), učestvuje u sistemskimkalcijumhomeostaze (Carmeliet et al., 2003; Yang et al., 2016), mijenjaju propusnost membrane (Lappe et al., 2017.), aktiviraju lučenje raznih enzima i hormona (Kim et al., 2012.) itd. Mnoge prethodne studije su otkrile da F i Ca imaju antagonistički učinak u biologiji (Dure-Smith et al., 1996; Nobrega et al., 2019). Nakon što tijelo apsorbira F, on će ući u krv i formirati nerastvorljive precipitate CaF2. Ako je ishrana Ca nedovoljna, a Ca u krvi ne dostigne potrebnu količinu, dolazi do patoloških promena kao što su hipokalcemija i osteoliza, tako da dodatak prehrani Ca igra važnu ulogu u prevenciji i poboljšanju fluoroze (Dure-Smith et al. al., 1996; Li i sur., 2021; Yang i sur., 2021). Naša grupa je potvrdila da je dijetakalcijummože ublažitiapoptozakosti i jetre putem signalnog puta PI3K-AKT, ER puta i mitohondrijalnog puta (Li i sur., 2021.; J. Wang i sur., 2020.; Wang et al., 2019.; Yang et al., 2021.). Da bi se dodatno dokazalo da liKalcijumsmanjuje nefrotoksičnost F putem receptora smrtiapoptozaPutem, uspostavili smo pacovski model ishrane sa visokim sadržajem fluorakalcijumi oceniobubregindeks povrede, stepenapoptozai promjene ekspresije marker gena i proteina u posredovanju receptorom smrtiapoptozaput.

materijali i metode

Hemikalije i instrumenti

Destilirana voda je pripremljena Heal Force sistemom za prečišćavanje vode (Šangaj, Kina). Pufer za lizu radio imunoprecipitacije (RIPA) i natrijum fluorid (NaF) obezbedila je Sigma-Aldrich (Šangaj, Kina). 10 posto formalina, glicina, natrijum dodecil sulfata (SDS), TRIS, fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF), CaCO3, nitrocelulozne (NC) membrane, kompleta bicinhoninske kiseline (BCA) i kompleta za bojenje hematoksilin-eozinom (H&E) Technology Co. ., Ltd. (Peking, Kina). Trizol reagens je nabavljen od Takara Biological Engineering Company (Dalian, Kina). Kompleti CRE, UA, azota uree u krvi (BUN), magnezijuma (Mg), P i kalijuma (K) su kupljeni od Nanjing Jiancheng Bioinženjering Instituta (Nanjing, Kina). In situapoptozakomplet za detekciju, FAS zečje poliklonsko antitelo (BA0484) i FAS-L zečje poliklonsko antitelo (PB0042) kupljeno je od Boster Biotechnology (Wuhan, Kina). -aktin zečje poliklonsko antitelo (20536-1-AP), FADD zečje poliklonsko antitelo (14906-1-AP), kaspaza 8 zečje poliklonsko antitelo (13423-1-AP), kaspaza 3 zečje poliklonsko antitelo ({{9 }}AP) i HRP konjugirani Affinipure kozji anti-zečji IgG(H plus L) (SA00001–2) nabavljeni su od Proteintech Group (Wuhan, Kina). TRAL zečje poliklonsko antitijelo (bs-1214R), TNF alfa zečje poliklonsko antitijelo (bs2081R), PARP zečje poliklonsko antitijelo (bs-55164R) kupljeno je od Bioss-a (Peking, Kina). Elektrohemijska luminiscencija (ECL) i 3,3′-diaminobenzidin (DAB) su kupljeni od KeyGen Biotech (Jiangsu, Kina). PrimeScript® RT Master Mix i SYBR® Premix Ex Taq™ II komplet su obezbeđeni od strane Promega Biotechnology (Peking, Kina).

Životinje i tretmani

Četrdeset zdravih {{0}}sedmica starih mužjaka Sprague-Dawley (SD) pacova (120 ± 20 g) dobijeno je iz Centra za eksperimentalne životinje Medicinskog univerziteta Shanxi (Shanxi, Kina). Štakori su aklimatizovani nedelju dana, nasumično podeljeni u četiri grupe (10 pacova po grupi): Kontrolna grupa (C), NaF grupa (F), NaF plus 0,5% CaCO3 grupa (F plus 0,5% Ca), NaF plus 1% CaCO3 grupa (F plus 1 postoKalcijum) i tretirani kao u tabeli 1. Svi pacovi su smešteni u plastične kaveze na 22–25 ◦C (55 ± 5 procenata vlažnosti, 12 h ciklus svetlosti/tama), hrana i voda za piće su slobodno dostupni.

Nakon 17 sedmica uzgoja, pacovi su postili 24 sata, a voda je bila slobodna za piće. Zatim su pacovi anestezirani natrijum pentobarbitalom i žrtvovani dislokacijom grlića materice nakon što je krv sakupljena iz očnih jabučica. Nešto krvi je prikupljeno u epruvetama koje su sadržavale antikoagulant heparin natrijum za BUN test. Dio krvi je stavljen u uobičajene epruvete, stavljen na sobnu temperaturu 2 h, a zatim centrifugiran na 3000 rpm/min 10 minuta da se odvoji serum. Serum je odvojen za CRE, UA, Mg, P, K i F testove. Osam uzorakabubreziiz svake grupe su nasumično odabrani i brzo zamrznuti u tekućem dušiku, a zatim pohranjeni na -80 ◦C za qRT-PCR i Western blotting eksperimente. Ostali uzorcibubrezifiksirani su u 10 posto formalina za histopatološki pregled i eksperimente s terminalnim deoksinukleotidil transferazom posredovanim dUTP nick end labeling (TUNEL). Sve eksperimentalne operacije vezane za životinje striktno su sprovedene u skladu sa propisima Institucije za brigu o životinjama i Komiteta za upotrebu Poljoprivrednog univerziteta Shanxi, Shanxi, Kina.

Bubregkoeficijent

Prvo su izvagani pacovi; zatim thebubregtkivo je uklonjeno i izvagano. Thebubregkoeficijent je dobijen po sljedećoj formuli.

Bubregkoeficijent=[bubregmokra težina (g) / tjelesna težina (g)] ×100 posto .

Histopatološki pregled

Bubreguzorci su stavljeni u parafin. Presjek (debljina 5 μm) odbubregje obojen od strane H&E. Zatim su predmeti posmatrani pomoću svetlosnog mikroskopa (Olimp, Tokio, Japan). Ozbiljnostbubregpovreda je ocijenjena histopatološkim rezultatom.Bubregtubularna ozljeda se definira kaobubregtjelešca atrofiraju i deformišu,bubregšupljina kapsule proširena,bubregtubule koje formiraju gips, a epitelne ćelije otpadaju. Pri povećanju od 200 puta korišteni su sljedeći kriteriji za procjenu stepena oštećenja jetre. 1: 0–25 posto oštećenja; 2: 25–50 posto oštećenja; 3: 50–75 posto oštećenja; 4: 75–100 posto oštećenja (Baranova et al., 2016).

Određivanjebubreg-povezani indikatori

Nivo F mjeren je elektrodom specifičnom za F jon (Quadri et al., 2018). Nivoi CRE, UA, BUN, Mg, P i K mjereni su korištenjem komercijalno dostupnih kompleta. Svi povezani postupci izvedeni su prema uputama proizvođača.

Detection ofapoptozanivo od strane TUNEL

U cilju kvantifikacijeapoptozainbubregćelija, eksperimentalna analiza je izvršena korištenjem situapoptozakomplet za detekciju. Thebubregsekcije su deparafinizovane i zatim podvrgnute varenju pomoću proteinaze K. Terminalna deoksinukleotidil transferaza može označiti dUTP (DIG-dUTP) obeležen digoksinom do 3′-OH kraja, a DIG-dUTP se vezuje za tačku prekida DNK nakon reakcije sa biomarkerom anti -dig-biotin. U kombinaciji sa DAB-om je dodat prikaz. Za vizualizaciju

sva jezgra, preseci su obojeni hematoksilinom. Tamnosmeđi signali ukazuju na pozitivne ćelije, a plavi na ćelije koje ne reaguju. Theapoptozaindeks je izračunat prema sljedećoj formuli.

Udio apoptotičkih ćelija=(broj apoptotičkih ćelija po čvoru / ukupan broj ćelija po čvoru) ×100 posto.

Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR)

Ukupna RNK izbubregekstrahovan je upotrebom Trizol reagensa. Koristili smo ND{{0}} spektrofotometar (nano-drop, SAD) i elektroforezu u agaroznom gelu da provjerimo kvalitet i kvantitet RNK. Reverzna transkripcija (RT) je izvedena na 500 ng ukupne RNK pomoću PrimeScript® RT Master Mixa. Specifični prajmeri za -aktin i FAS, TRAIL, TNF i druge gene dizajnirao je softver Primer Premier 7.0 (Tabela 2) i sintetizirao Sangon Biotech (Šangaj, Kina). Quantstudio 7 flex PCR sistem u realnom vremenu (thermo-fisher, SAD) i SYBR® Premix Ex Taq™ II komplet korišćeni su za RT-PCR. Volumen PCR reakcije bio je 20 μL, a RT-PCR uslovi su bili: 95 ◦C 10

min, 40 ciklusa od 95 ◦C 15 s, 55 ◦C 30 s, 72 ◦C 30 s, i konačno jedan ciklus od 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 15 s, 95 ◦C 15 s. Sve reakcije su ponovljene tri puta. Relativna 2-ΔΔCt metoda je korištena za izračunavanje relativnih nivoa ekspresije mRNA, a -aktin je korišten kao kalibrator. U procesu, razlika u efikasnosti je manja od 5 posto.

Ukupna ekstrakcija proteina i Western blotting analiza

Thebubregtkivo je isprano PBS, osušeno filter papirom i razloženo RIPA lizom (sadrži PMSF), pri 12,000 o/min, 4^◦C za 10 min. Koncentracija proteina je određena korištenjem kompleta bicinhoninske kiseline (BCA) (Solarbio Science & Technology, Peking, Kina). Uzorak proteina od 35 ng je uspješno ekstrahiran i odvojen na 8 postotnom SDS-poliakrilamidnom gelu elektroforezom. Ciljni protein je prebačen na NC membranu, a NC membrana je blokirana sa 5 posto nemasnog mlijeka na sobnoj temperaturi 2 h. Nakon toga, NC membrana je inkubirana sa primarnim antitelima na -aktin (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), Caspase 8 (1:500), Caspase 3 (1:500) i PARP (1:1000) na 4 stepena preko noći. Nakon 3 puta ispiranja sa PBST, NC membrana je inkubirana sa HRP-konjugiranim sekundarnim kozjim anti-zečjim IgG antitelima (1:2000) na sobnoj temperaturi 2 h. ECL je korišten za vizualizaciju ciljnih proteinskih traka. Optička gustina je izračunata softverom AlphaView (verzija: 3.2.2.0) na FluorChem Q sistemu (Alpha Innotech, Kalifornija, SAD).

Statistička analiza

Za organizaciju i analizu eksperimentalnih podataka korišten je softver GraphPadPrism{{0}}, a svaki podatak je predstavljen srednja vrijednost ± SEM. Značajnost razlike između srednjih vrednosti određena je analizom varijanse (ANOVA) praćeno Tukeyjevim testom sa P < 0,05="" koji="" se="" smatra="">

Rezultati

Izmjene ububregindikatori koeficijenta i biohemijske funkcije

Thebubregkoeficijent i nivoi F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K prikazan je na slici 1. U poređenju sa grupom C,bubregkoeficijent je značajno smanjen u F grupi (p < 0.05).="" međutim,="" koeficijent="" bubrega="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijumgrupa je pokazala značajan porast u poređenju sa F grupom (p < {{0}}.05).="" nivo="" f="" u="" f="" grupi="" bio="" je="" značajno="" viši="" nego="" u="" c="" grupi="" (p="">< 0,001).="" zanimljivo="" je="" da="" je="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" f="" nivo="" f="" u="" grupi="" sa="" f="" plus="" 1="" posto="" ca="" značajno="" smanjen="" (p=""><>

CRE, BUN i UA su ocijenjeni da odražavaju stepenbubregoštećenja i funkcionalne promjene. Nivoi CRE, BUN i UA su značajno povećani u F grupi u poređenju sa onima u C grupi (p < 0.05),="" međutim,="" u="" odnosu="" na="" f="" grupu,="" gornja="" tri="" indikatora="" su="" bila="" značajno="" smanjen="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijumgrupa (p < 0.05).="" mg,="" p="" i="" k="" su="" bili="" indikatori="" elektrolita="" usko="">bubregfunkcija. U poređenju sa C grupom, nivo serumskog Mg je značajno smanjen, nivoi P i K su dramatično povećani u F grupi (p < 0.05).="" ipak,="" dodajući="" 1="">kalcijumna dijetu značajno povećao nivoe Mg u serumu za 15,3 posto (p < 0.05)="" i="" značajno="" smanjio="" nivoe="" p="" u="" serumu="" za="" 16,9="" posto="" (p="">< 0,05).="" sadržaj="" seruma="" k="" pokazao="" je="" opadajući="" trend="" bez="" značaja="" nakon="" tretmana="" dodatkom="" 1="" posto="">

Promjene ububregmorfologija

Morfološke promjenebubregtkiva su pregledane H&E (sl. 2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ). U C grupi,bubregtubularne ćelije su bile kompaktno raspoređene, morfologija pravilna, a morfologija glomerula netaknuta. Međutim, granice između ćelija bile su nejasne, tjbubregtjelešca su atrofirana i deformisanabubregšupljina kapsule proširena,bubregtubuli su formirali gips, a epitelne ćelije su se odvojile u F grupi. U poređenju sa F grupom, sa povećanjem odKalcijumkoncentracija, rasporedbubregćelije su postepeno postajale sve uređenije, morfologijabubregtjelešca su se postepeno oporavljala, a stepen ozljede je postepeno ublažavan. Osim toga, procijenili smo štetu korištenjembubregrezultat (slika 2Ⅴ). Skor F grupe je bio značajno viši od skora C grupe (p < 0.01);="" ipak,="" rezultat="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijumgrupa je značajno smanjena u poređenju sa F grupom (p < 0.05).

TUNEL otkrivabubregćelijaapoptoza

Izvršili smo TUNEL test kako bismo otkrili i analizirali da libubregćelije su pretrpeleapoptozau ovoj studiji (sl. 3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ).Bubregtkiva u C grupi su bila uredno raspoređena, sa manje apoptotičkih ćelija (4,67 ± 1,15 procenata). F grupa je pokazala veliki broj TUNEL pozitivnihbubregtubularne epitelne ćelije (48,17 ± 3,94 posto). Nasuprot tome, F plus 1 postoKalcijumgrupa je pokazala dramatičan pad u broju TUNEL-pozitivnih ćelija (28,83 ± 4,81 posto) (slika 3Ⅴ).

Efekti odKalcijumo F-indukovanim promjenama u genima vezanim za put receptora smrti

Relativni nivoi ekspresije mRNA uzvodnih faktora koji se odnose na posredovanje receptora smrtiapoptozaput (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) otkriveni su na slici 4a. U odnosu na C grupu, nivoi ekspresije mRNA TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS i FAS-L bili su značajno povećani kod pacova tretiranih F (p < 0.01).="" nasuprot="" tome,="" relativna="" ekspresija="" mrna="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas="" i="" fas-l="" bila="" je="" značajno="" smanjena="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijumgrupa u poređenju sa F grupom (p < {{0}}.05).="" u="" poređenju="" sa="" c="" grupom,="" uočeno="" je="" očigledno="" smanjenje="" nivoa="" ekspresije="" mrna="" opg-a="" u="" f="" grupi="" (p="">< 0,01).="" međutim,="" u="" odnosu="" na="" f="" grupu,="" opg="" u="" f="">Kalcijumgrupe su povećane. Nizvodni faktori FADD, TRADD, kaspaza 8, kaspaza 3 i PARP relativni nivoi ekspresije mRNA prikazani su na slici 4b. Ekspresija proteina FADD, TRADD, kaspaze 8, kaspaze 3 i PARP je očigledno bila poboljšana u F grupi u poređenju sa C grupom (p < 0.01),="" ali="" je="" očigledno="" smanjena="" u="" f="">Kalcijumgrupe, u poređenju sa F grupom (p < 0.05).

Efekti odKalcijumo F-indukovanim promjenama uapoptoza-srodni proteini

Ekspresija proteina TRAIL-a, FAS-a, FAS-L, TNF-a, FADD-a, kaspaze 8, kaspaze 3 i PARP-a otkrivena je Western blot-om (slika 5a, b). U poređenju sa C grupom, ekspresije proteina TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspaze 8, kaspaze 3 i PARP u F grupi su bile značajno povišene (p < 0.01).="" ekspresija="" proteina="" svih="" gore="" navedenih="" faktora="" je="" značajno="" smanjena="" u="" f="" plus="" 1="">Kalcijumgrupa u poređenju sa F grupom (p < 0.05).

Diskusija

Najnoviji dokazi su pokazali da F može uzrokovati lezije na mekim tkivima, a stupanj oštećenja F ovisi o koncentraciji F, vremenu izlaganja i tipu organa (Wei et al., 2019). U ovoj studiji, 100 mg/L NaF je korišteno tokom 17 sedmica za uspostavljanje životinjskog modela subakutne izloženosti NaF u vodi za piće. Doziranje NaF se bira prema stepenu zagađenja F u okolini i nesigurnim faktorima različitih vrsta. S obzirom da je prirodna koncentracija F-a izmjerena u lokalnoj podzemnoj vodi oko 4,5 mg/L, destilirana voda sa 100 mg/L NaF korištena u ovoj studiji (koncentracija F-a je oko 45 mg/L) izračunata je prema neizvjesnom faktoru za ekstrapolacija sa životinje na čovjeka na 10 (Smjernice za kvalitet vode za piće, 2017; Mukherjee i Singh, 2021; Wen et al., 2013; Zhang et al., 2020). Rane studije su otkrile da je dijetakalcijummože uticati na apsorpciju fluora, pospješiti izlučivanje fluora u tijelu, smanjiti brzinu apsorpcije fluora i na taj način smanjiti toksičnost F (Harrison et al., 1984; Larsen et al., 1981). Naše nedavne eksperimentalne studije su pokazale da Ca ublažava F-indukovane povrede kostiju i jetre inhibiranjem unutrašnjeg putaapoptoza(Li et al., 2021.; J. Wang et al., 2020.; Wang et al., 2019.). Međutim, dosadašnja istraživanja o zaštitnom učinku Ca na F-indukovanu nefrotoksičnost i srodni mehanizam su bez presedana. Ovdje izvještavamo da Ca ublažava F-indukovanebubregoštećenja. Osim toga, također smo otkrili da Ca preokreće F-induciranobubregćelijaapoptozaposredstvom receptora smrtiapoptozaput (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL putevi). Dugotrajna akumulacija F ububregmože dovesti do strukture tkiva i funkcionalnog oštećenja. U ovoj studiji smo otkrili da je izloženost NaF uzrokovalabubregćelijaapoptozakod štakora, praćeno glomerularnom atrofijom i deformacijom,bubregproširenje šupljine kapsule,bubregtubule koje formiraju izljevke, a epitelne ćelije otpadaju. Kako god,bubregoštećenje je značajno ublaženo nakon suplementacije od 1 posto Ca. Ovi rezultati su bili slični rezultatima dobijenim u prethodnim izvještajima (Cao et al., 2015; HW Wang et al., 2020).

CRE je metabolit mišića, UA je konačni proizvod metabolizma purina, a BUN je glavni krajnji proizvod metabolizma proteina u tijelu, koji se izlučuje glomerularnom filtracijom i obično se koristi za otkrivanjebubregfunkcija (Myers et al., 2006; HW Wang et al., 2020). Biohemijsko istraživanje visokog F regiona pokazalo je da su stope glomerularne filtracije značajno smanjene, a F, UA i BUN su se značajno promijenile (Malin et al., 2019). Testovi na životinjama su pokazali da serum CRE,Kalcijum, a koncentracije P su značajno smanjene kod miševa izloženih 100 mg/L NaF, što sugerira da je F poremećenbubregfunkcije, kao i metabolizam Ca i P (HW Wang et al., 2020). F-indukovana nefrotoksičnost je povezana sabubregdisfunkcija. Kadabubregfunkcija pogoršava, izlučivanje F u tijelu je smanjeno, što dovodi do prekomjernog nakupljanja fluora ububregi pogoršavajuća F toksičnost (Kido et al., 2017). Kada jebubrezisu ozbiljno oštećeni,

izlučivanje F u urinu se smanjuje, a koncentracija F u serumu dodatno raste (Dharmaratne, 2019). U ovoj studiji smo uočili da su se nivoi BUN i serumskih CRE, UA, P, K kod pacova tretiranih sa 100 mg/L NaF značajno povećali, što sugerira da je visoka izloženost F uzrokovala promjene ububregbiohemijskih pokazatelja kod pacova i dovela dobubreginsuficijencija. Nadalje, također smo istakli da različiti indikatoribubregimaju tendenciju da budu normalni posleKalcijumsuplementacija. Pokazuje da Ca (posebno 1 postoKalcijum) ima značajan ublažujući efekat na F-indukovanebubregoštećenja kod pacova.

Cistanchemogu pomoći sabubregoštećenja.

Apoptozaje autonomna i uredna ćelijska smrt kontrolirana genima, koju karakterizira degradacija DNK bez očite ćelijske lize. Ova studija je uočila da je uzrok fluorozebubregćelijaapoptozakod pacova. FAS igra veliku ulogu u nastankuapoptozai razne bolesti. Novija literatura otkriva da FAS posredujeapoptozaububregizazvana ishemijom-reperfuzijom i ljudskim leukocitimaapoptozainduciran N-nitrozodimetilaminom (Iwaniuk et al., 2019; Xu

et al., 2019.). Kada se FAS i FAS-L kombinuju da formiraju trimer, aktivira se pro-apoptotički signal. Nedavna studija je pokazala da F indukuje ćelijuapoptozakroz FAS/FAS-L put (Xu et al., 2011). U ovoj studiji, F je značajno povećao ekspresiju mRNA i proteina FAS i FAS-L ububreg. Povećana regulacija nivoa FAS i FAS-L sugerira da apoptotski putevi povezani s FAS/FAS-L mogu biti uključeni u F-induciraneapoptoza. Regrutiranje FADD trimera FAS/FAS-L dovodi do cijepanja Pro-Caspase 8 kako bi se proizvela aktivna kaspaza 8, koja zauzvrat aktivira kaspazu 3, a zatim dovodi doapoptoza(Li et al., 2011; Xu et al., 2011). Ova studija je potvrdila da 100 mg/L NaF indukujeapoptozakod pacovabubrezikroz FAS/FAS-L put. Najvažniji rezultat je da dijetetski dodatak Ca umanjujeapoptoza-indukujući efekat F, koji se pripisuje smanjenoj regulaciji FAS/FAS-L aktivacije i sekundarnoj aktivaciji kaspaza.

TNF je pleiotropni citokin koji učestvuje u širokom spektru ćelijskih odgovora, uključujući diferencijaciju, proliferaciju, upalu i ćelijsku smrt. TNF signal pokreće obaapoptozai anti-apoptotički putevi. Mnoge vrste literature izvještavaju da TNF dominira lipopolisaharidimabubregoštećenje i akutni uzrokovani cisplatinombubregpovreda (Lee et al., 2016; Li et al., 2018). TNF se veže za TNF-R1, njegov DD regrutuje TRADD, a zatim TRADD stupa u interakciju sa FADD, što dovodi do formiranja DISC-a (Kiraz et al., 2016; Sun et al., 2003). Studije su otkrile da F može inducirati jetru, neurone ibubregleukocitaapoptozakroz signalni put TNF-a (Lu et al., 2017; Singh et al., 2017; Yan et al., 2016). Slično rezultatima ovih izvještaja, relativna ekspresija TNF, TNF-R1, TNF-R2 i TRADD u F grupi je značajno povećana u ovom eksperimentu. Nasuprot tome, ekspresija ovih gena značajno se smanjila nakon 1 postoKalcijumdodatak, sugerirajući intervenciju odKalcijumu TNF putu.

TRAIL je uključen u regulacijuapoptoza, proliferaciju, imuno-upalni odgovor, itd. Trenutno se vjeruje da je TRAIL usko povezan sa pojavom i prognozombubregbolesti (Candido, 2014). Sve više literature potvrđuje da TRAIL regulišeapoptozaofbubregtubularne epitelne ćelije kod glomerulonefritisa povezanog s HBV ibubregapoptozau Uromodulin-vezanobubregbolesti (Johnson et al., 2017; Yang et al., 2018). Nadalje, studija je objavila da je ekspresija TRAIL-a općenito promijenjena tokom homeostaze i različitabubregpovrede (Devarapu et al., 2017). TRAIL se veže za receptor smrti DR5 i regrutuje FADD kroz interakciju DD, a zatim se vezuje za pro-Caspase 8 kroz domen efekta smrti koji postoji u FADD-u da bi formirao DISC (Yuan et al., 2018). Ova studija je pokazala da je ekspresija TRAIL-a i DR5 značajno povećana u F grupi. Nakon dopune saKalcijum, ekspresija TRAIL-a i DR5 je inhibirana. Predlaže se daKalcijuminhibira TRAIL put za smanjenje F-induciranogapoptoza.

Zaključak

Izlaganje 100 mg/L NaF aktivirano putem receptora smrtiapoptozaput (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL putevi), a zatim induciranibubregćelijaapoptozakod pacova, uzrokujućibubregmetabolički poremećaji ibubreginsuficijencije, što rezultirabubregtjelešca su atrofirana i deformisanabubregšupljina kapsule proširena,bubregtubuli su formirali gips. Međutim, dodatak od 1 postoKalcijumna dijetu smanjio sadržaj fluorida u krvi, dodatno ublažiobubregmetabolički poremećaj ibubreginsuficijencije kroz put posredovane receptorom smrti i značajno smanjiobubregpovreda (komponenta slika 6).

Reference

Izvor je Haojie Li, College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, PR China itd.