Analiza cjelokupnog transkriptoma za istraživanje oštećenih imunoloških karakteristika kod kritično bolesnih starijih pacijenata sa sepsom

Abstract

Pozadina

Sepsa je česta komplikacija kod kritično bolesnih pacijenata, vrlo je heterogena i povezana je s visokim morbiditetom i mortalitetom, posebno u starijoj populaciji. Korištenje RNA sekvenciranja (RNA-Seq) za analizu bioloških puteva se široko koristi u kliničkim i molekularno-genetičkim studijama, ali još uvijek nedostaju studije na starijim pacijentima sa sepsom. Stoga smo istraživali biološke karakteristike i transkriptomske karakteristike relevantne za mortalitet kod starijih pacijenata koji su primljeni na jedinicu intenzivne njege (ICU) zbog sepse.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Metode

Učlanili smo 37 starijih pacijenata sa sepsom iz intenzivne bolnice u Taichung Veterans General Hospital. Prvog i osmog dana prikupljeni su klinički i laboratorijski podaci, kao i uzorci krvi za RNA-Seq analizu. Identifikovali smo dinamički transkriptom i obogaćene puteve različito eksprimiranih gena između 8. i 1. dana kroz analizu obogaćivanja DVID-a i analizu obogaćivanja genskog skupa. Zatim je različitost repertoara T ćelija analizirana pomoću MiXCR.

Rezultati

Sveukupno, 37 pacijenata je imalo sepsu, a oni koji su odgovorili i oni koji nisu odgovorili su grupirani kroz analizu glavnih komponenti. Značajno veći SOFA rezultati 7. dana, duži dani na respiratoru, dužina boravka na intenzivnoj intenzivnoj nezi i bolnička smrtnost pronađeni su u grupi koja nije odgovorila, nego u grupi koja je odgovorila. Osmog dana kod starijih pacijenata intenzivne nege sa sepsom, geni povezani sa urođenim imunitetom i upalom, kao što su ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 i PCSK9, bili su pojačani. Diferencijalno eksprimirani geni (DEG) obogaćeni su u regulaciji transkripcije, adaptivnom imunološkom odgovoru, proizvodnji imunoglobulina, negativnoj regulaciji transkripcije i imunološkom odgovoru. Štaviše, postojala je veća raznolikost T-ćelijskih receptora na dan-8 u grupi koja je odgovorila, nego na dan-1, što ukazuje da su imali bolje regulisan oporavak od sepse u poređenju sa pacijentima koji nisu odgovorili .

Zaključak

Smrtnost i incidenca sepse bili su visoki kod starijih osoba. Identifikovali smo biološke karakteristike relevantne za mortalitet i transkriptomske karakteristike sa funkcionalnim putem i MiXCR analizama na osnovu RNA-Seq podataka; i otkrili da je grupa odgovornih imala pojačan urođeni imunitet i povećanu raznolikost T-ćelija; u poređenju sa grupom koja nije odgovorila. RNA-Seq bi mogao ponuditi dodatne komplementarne informacije za tačno i rano predviđanje ishoda liječenja.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

Ključne riječi

Sepsa, RNA-Seq, Stariji pacijent na intenzivnoj nezi, Diferencijalno izraženi geni, T-ćelijski receptor

Uvod

Sepsa je klinički sindrom koji je potencijalno opasan po život. Proizveden je poremećenim odgovorom domaćina na infekciju i vrlo je heterogena i smrtonosna globalna prijetnja zdravlju, posebno u starijoj populaciji [1, 2]. Prethodne studije su otkrile da stariji pacijenti imaju veći rizik od sepse i da imaju veću težinu bolesti nego oni u općoj populaciji [3]. Broj starijih pacijenata koji su zbog sepse primljeni na odjel intenzivne njege (JIL) u posljednje dvije decenije u stalnom je porastu zbog stalnog porasta broja starijih osoba [4]. Naročito, uprkos visokom intenzitetu njege, smrtnost je i dalje visoka kod starijih pacijenata primljenih na intenzivnu negu, ali još uvijek nedostaju studije koje se bave biološkim putevima relevantnim za odgovor na liječenje kod starijih pacijenata sa sepsom [5]. Imuni sistem starijih osoba podliježe brojnim biološkim promjenama kako stare, koje utiču na imuni odgovor starijih osoba, što rezultira većom vjerovatnoćom imunokompromitovanih stanja [6]. Kompromitovani adaptivni imunitet smatra se ključnom karakteristikom imunosenescencije kod starijih [7, 8], ali transkriptomske karakteristike tokom sepse kod starijih ostaju neistražene. Ove promjene određuju ne samo osjetljivost na bakterijske infekcije već i progresiju sepse i kliničke ishode [6]. Stoga je kritično istražiti različite imunološke odgovore i biološke karakteristike relevantne za mortalitet kod starijih pacijenata primljenih na intenzivnu negu [9, 10].

Sepsa je vrlo heterogena i karakteriziraju je složene i dinamične imunološke reakcije, koje uključuju početni pretjerani upalni odgovor praćen nereguliranim/iscrpljenim adaptivnim imunitetom [11]. Nekoliko studija je pokazalo promijenjen adaptivni imunitet nakon sepse; čini se da je takozvana imunoparaliza jedna od ključnih imunoloških karakteristika koje dovode do trajnog narušenog imuniteta kod pacijenata sa sepsom [12]. RNA-Seq je korišten u prethodnim studijama za pronalaženje transkriptomskog potpisa ili "subendotipa" kod pacijenata sa sepsom. Subgenotipovi koji su povezani sa sepsom su rano poboljšanje disfunkcije organa nakon sepse, oslabljen adaptivni imunitet kod imunokompromitovanih pacijenata i odgovor na steroide kod pacijenata sa septičkim šokom [13, 14]. Koristeći RNA-Seq podatke, nedavno su razvijeni analitički alati, kao što je MiXCR, za kvantifikaciju raznolikosti T-ćelijskih receptora (TCR) [15, 16]. U ovoj studiji smo istražili dinamički transkriptom septičkih pacijenata ispitivanjem uparenih uzoraka od 1. i 8. dana i otkrili da imunokompromitovani septični pacijenti imaju smanjenu raznolikost T ćelija i ugroženu funkciju T ćelija. Ova studija imala je za cilj da istraži biološke karakteristike i transkriptomske karakteristike relevantne za mortalitet, kako bi se bolje razumjelo signaliziranje adaptivnog imuniteta kod starijih pacijenata koji su primljeni na intenzivnu terapiju zbog sepse.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materijali i metode Dizajn studije i prikupljanje podataka

Studiju je odobrio Institucionalni odbor za reviziju TCVGH (IRB br. CE20069B), a dobijen je informirani pristanak od svih učesnika. Od decembra 2018. do januara 2022. regrutovano je 37 starijih pacijenata intenzivne nege iz Opće bolnice veterana Taichung (TCVGH). U vrijeme upisa prikupljeni su demografski podaci, a uzorci krvi uzeti su 1. i 8. dana. transkriptoma, dva alikvota krvi od 4 ml sakupljena su u sterilne EDTA vakutejnere i odmah prebačena u bočice bez RNAze koje sadrže 10,5 ml RNAlater® (TermoFisher, Waltham, MA, SAD).

Ekstrakcija RNK i sekvenciranje

U ovoj studiji smo ekstrahovali RNK sa PAXgene Blood RNA Kit, a prosječan broj integriteta RNK (RIN) bio je 8,31±0.58. Uputstva proizvođača su poštovana prilikom izgradnje biblioteke, a 1,000 ng fragmentirane RNK je korišten u narednim eksperimentima. 150-bp upareni kraj čitanja su korištena za RNA-Seq na platformi NovaSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA, Sjedinjene Države), a svaki uzorak je imao najmanje 50-60 miliona čitanja. Skup podataka RNA-seq deponovan je u Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) pod pristupnim brojem GSE216902. Skup podataka je korišten za proporcije ćelija i analizu puteva.

Skor sekvencijalnog zatajenja organa (SOFA).

Skor sekvencijalnog zatajenja organa (SOFA) je numerička vrijednost zatajenja organa povezanog sa sepsom, tj. kvantifikuje broj i ozbiljnost zatajenja organa. Svaki rezultat se kreće od 0 do 4, s višim rezultatom koji ukazuje na pogoršanje disfunkcije organa [17]. Koristili smo dinamičku promjenu SOFA rezultata da definiramo osobe koje su odgovorile (R) i one koje nisu odgovorile (NR), a učesnik je klasifikovan kao NR ako je smanjenje SOFA rezultata od 1. do 7. dana bilo manje od 2 [13, 18, 19] .

Bioinformatičke analize RNA-Seq podataka 

Sekvenciranje je bilo visokog kvaliteta, korišteni su Phred rezultati od 30, a HISAT2 je mapirao sekvencu čitanja u referentni genom (GRCh38/hg38) [20]. R paket DEseq2 [21] korišten je za identifikaciju diferencijalno eksprimiranih gena (DEG), a broj očitavanja izračunat je korištenjem featureCounts [22]. Prosečna stopa mapiranja i broj čitanja bili su 87,6±4,8% i 65,5±17,6 miliona čitanja, respektivno. Profiler [23] R paket je korišten za obavljanje funkcionalnog obogaćivanja i analize puta na osnovu genoma (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/) i ontologije gena (GO, http://geneontology.org /) baze podataka. Korigirana p-vrijednost manja od 0,05 se smatrala značajno obogaćenom. Svi različito eksprimirani geni su funkcionalno označeni upotrebom Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [24], a kreirana je vizualizirana mapa obogaćivanja Cytoscape 3.9.0 [25]. Vizualizirali smo rezultate GSEA koristeći mapu obogaćivanja, koja organizira skupove gena u mrežu sličnosti. Čvor, veza i boja čvora predstavljaju skup gena, preklapanje gena članova i rezultat obogaćivanja [24], respektivno.

Raznolikost TCR analiza

Podaci RNA-Seq korišteni su u MiXCR v3.0.13 [15, 16] za kvantifikaciju klonotipova pacijenata sa sepsom na osnovu prethodno objavljenog protokola [14]. Softver VDJTools v 1.2.1 [26] je korišten za izračunavanje broja regiona koji određuje komplementarnost-3 (CDR3) i raznolikosti uzorka nakon akvizicije kvantitiranih klonotipova.

Statističke analize

Koristili smo Kolmogorov-Smirnov test da provjerimo normalnost i otkrili smo da je distribucija nekoliko varijabli, uključujući dan na respiratoru, dužinu boravka na intenzivnoj nezi i dužinu boravka u bolnici, iskrivljena ulijevo. Da bismo podatke prikazali u unificiranom formatu, predstavili smo učestalosti (procente) kategoričkih varijabli za kategoričke varijable i kontinuirane varijable kao medijanu (interkvartilni raspon, IQR). Razlike između ove dvije grupe analizirane su korištenjem Mann-Whitney U testa za kontinuirane varijable i Fisherovog egzaktnog testa za kategoričke varijable. Nivo značajnosti je postavljen na 0.05, a statističke analize su bile dvostrane. R verzija 4.1.0 je korištena za provođenje svih analiza podataka.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Rezultati Karakteristike pacijenata i SOFA rezultati

U ovu studiju smo uključili 37 starijih pacijenata sa sepsom [medijan starosti 83 godine (IQR: 79–87 godina)] (Tabela 1). Analizom glavnih komponenti, uočili smo da je razlika između dana{5}} i dana-8 bila bolja kod pacijenata koji su reagirali (grupa koja je reagirala, R) nego kod pacijenata koji nisu reagirali (grupa koja nije reagirala, NR), što ukazuje na regulisani oporavak od sepse u imunokompetentnoj grupi (Dodatni fajl 1: Slika S1). Sve u svemu, među 37 pacijenata, bilo je 23 pacijenata koji su reagovali (grupa koja je odgovorila, R) sa medijanom starosti 82 godine (IQR: 79,5–86,5 godina) i 14 pacijenata koji nisu reagovali (grupa koja nije odgovorila, NR) sa srednja starost 84 godine (IQR: 79–88 godina). Tabela 1 prikazuje osnovne karakteristike studijske grupe. Veći albumin (medijan 3,3 mg/dl, IQR: 3–3,7 mg/dl) i niži C-reaktivni protein (medijan 9,16 mg/dl, IQR: 3,9–17,5 mg/dl) su uočeni u tretmanu nego kod njihovih kolega. U poređenju sa grupom koja je reagovala, grupa koja nije odgovorila je imala značajno više SOFA rezultate 7. dana, duže dane na respiratoru, duže dužine boravka na intenzivnoj nezi i veći bolnički mortalitet.

Izraziti dinamički transkriptom kod starijih pacijenata na intenzivnoj intenzivnoj nezi sa sepsom

Kao što je ilustrovano na slici 1A, koristeći analizu glavnih komponenti na 500 najboljih varijabilnih gena iz svih uzoraka, otkrili smo da stariji pacijenti sa sepsom u jedinici intenzivne njege imaju značajno različite transkriptome prvog i osmog dana. Diferencijalni geni ekspresije ( DEGs) su zatim identifikovani upoređivanjem profila ekspresije gena između 8. i 1. dana kod starijih pacijenata na intenzivnoj nezi koristeći kriterijume p<0.01 and log fold change>0.25 ili<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

DAVID analiza obogaćivanja dinamičkog transkriptoma

Da bismo demonstrirali promjenu bioloških puteva kod starijih pacijenata intenzivne nege između 8. i 1. dana, demonstrirali smo obogaćeni put korištenjem DAVID v6.8 servera na mreži. Kao što je prikazano na slici 2, dijagrami genske ontologije (GO) su napravljeni za biološke procese gornjih 20 DEG iz skupa podataka. Otkrili smo da su DEG kod starijih pacijenata sa sepse na intenzivnoj intenzivnoj obogaćeni regulacijom transkripcije, adaptivnog imunološkog odgovora, proizvodnje imunoglobulina, negativne regulacije transkripcije i imunološkog odgovora. DAVID funkcionalna GO analiza je prikazana na slici 3. U poređenju sa kontrolama, funkcionalne oznake proteina kodiranih genima u DEG-ovima su pokazale značajno (P<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

Tabela 1. Karakteristike starijih pacijenata na intenzivnoj nezi sa sepsom

Slika 1 Analiza glavne komponente A i dijagram vulkana B transkriptoma između dana-1 i dana-8

Slika 2 Funkcionalne analize i analize obogaćivanja puteva diferencijalno eksprimiranih gena sa DAVID-om pomoću mjehurića

Slika 3 DAVID funkcionalna genska ontologija (GO) analiza biološkog procesa (BP), ćelijske komponente (CC) i molekularne funkcije (MF)

TCR analize sa MiXCR kod starijih pacijenata na intenzivnoj intenzivnoj nezi sa sepsom

Uzimajući u obzir da su se R i NR grupe oporavile od sepse putem specifičnog signalnog puta receptora T-ćelija, koristeći broj jedinstvenih CDR3, D50 i inverzni Simpsonov indeks, koristili smo MiXCR da odredimo raznolikost receptora T-ćelija (TCR ) (sl. 5A–C). Osmog dana, CDR3, D50 i inverzni Simpsonov indeks R grupe su bili značajno viši nego prvog dana. Štaviše, D50 indeks je bio značajno viši u R grupi nego u NR grupi 8. dana (Slika 5B). Konačno, procijenili smo raznolikost jedinstvenog CDR3 koristeći inverzni Simpsonov indeks, koji odražava obilje klonotipova. Uočili smo sličan obrazac, sa značajno povećanom raznovrsnošću TCR-a u R grupi, posebno 8. dana (slika 5C).

Diskusija

Ova studija pokazuje da biološke karakteristike relevantne za mortalitet i adaptivna signalizacija povezana sa imunitetom pomoću transkriptomike, upoređujući razlike između dana 1 i dana 8 (Dodatni fajl 1: Slika S1), mogu pouzdano identificirati starije pacijente na intenzivnoj intenzivnoj nezi sa sepsom i razlikovati one koji ne reagiraju od pacijenata koji ne reagiraju. . Prethodne studije koje su ispitivale biomarkere sepse zavisile su od odabira poznatih bioloških funkcija i puteva korišćenjem metoda zasnovanih na znanju [28], a samo mali broj studija je direktno ciljao gene čije funkcije nisu u potpunosti opisane [29]. U ovoj studiji usvojili smo RNA-Seq za identifikaciju bioloških i imunoloških karakteristika kod starijih pacijenata na intenzivnoj intenzivnoj nezi sa sepsom kroz analizu glavnih komponenti, analizu diferencijalne ekspresije gena i MiXCR. Urođeni imunitet i upala, kao što su ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 i PCSK9, pojačani su kod starijih pacijenata na intenzivnoj intenzivnoj njezi sa sepsom. ZDHHC19 je palmitoiltransferaza i posreduje u palmitoilaciji RRAS-a, što dovodi do povećane vitalnosti ćelija [30]. Analiza ekspresije gena na nivou genoma povezana je sa povećanom ekspresijom kod pacijenata na intenzivnoj nezi sa sepsom uzrokovanom fekalnim peritonitisom [31]. HDC (histidin dekarboksilaza, HDC) je član porodice dekarboksilaze grupe II i formira homodimer koji koristi piridoksal fosfat za pretvaranje L-histidina u histamin. Studija na životinjama koju su proveli Hattori et al. [32] su koristili HDC gen nokaut (HDC−/−) miševe. Nakon izazivanja sepse ligacijom i punkcijom cekusa (CLP), HDC-nokaut miševi su pokazali smanjene nivoe histamina u plazmi, a povećanje nivoa TNF, IL-1b, IL-6 i MCP1 u sepsi je oslabljeno kada je postojao nedostatak plazme. histamin [32]. Abnormalna proizvodnja citokina izazvana sepsom i višestruka povreda organa (pluća, jetra i bubrezi) značajno su smanjeni kod HDC-nokaut miševa u poređenju sa WT C57BL/6 J miševima. Inhibicija ekspresije HDC spriječila je inflamatornu ozljedu tkiva i poboljšala preživljavanje kod miševa sa sepsom izazvanom CLP-om [32]. Osim toga, histamin bi mogao promovirati proizvodnju proinflamatornih citokina, koji su regulirani transkripcijskim faktorom NF-κB. Pod CLP-indukovanom sepsom, HDC-nokaut miševi su imali značajno smanjenu aktivnost NF-κB u jezgru u poređenju sa WT miševima [32]. Ovaj rezultat ukazuje da histamin inducira sintezu proinflamatornih citokina i hemokina povećanjem aktivnosti NF-kB.

Nedavna istraživanja su pokazala da su ALOX15 i FCER1A ključni za patogenezu bakterijske sepse [33, 34]. ALOX15, enzim za peroksidaciju lipida, je funkcionalni gen za lipoksigenazu (LOX) [35], koji oksidira polinezasićene masne kiseline i povezan je s različitim fiziološkim procesima, kao i patogenezom neurodegenerativnih, upalnih i hiperproliferativnih bolesti [35, 36]. ALOX15 i njegovi metaboliti su uključeni u patofiziologiju višestrukih upalnih bolesti, kao što su sepsa, artritis, astma, cistična fibroza i ateroskleroza [36]. FCER1A (Fc fragment IgE receptora Ia, FCER1A), imuno vezan protein, je inicijacijski faktor alergijskih reakcija i igra ulogu u alergijskoj upali [37, 38]. FCER1A je u prethodnim studijama bio uključen u regulaciju metaboličkih procesa i imunološku regulaciju. [38, 39]. Osim toga, vjerojatnije je da će se astma pojaviti kada FCER1B i drugi inflamatorni geni povezani s imunoglobulinom interaguju [39]. Nadalje, PCSK9 (protein konvertaza subtilizin/keksin tip- 9, PCSK9) je identificiran kao centralni regulator nivoa LDL-C u plazmi svojom sposobnošću da se veže za LDL receptor (LDLR) i pokrene ga za lizozomsku degradaciju u stanicama , što dovodi do degradacije LDLR i povećanja nivoa LDL holesterola [40].

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

U ovoj studiji, koristili smo KEGG obogaćivanje i GO da odredimo funkcionalnu anotaciju ovih gena kako bismo istražili uključenost eksprimiranih DEG kod starijih pacijenata na intenzivnoj intenzivnoj pomoći sa sepsom u BP, MF i molekularne puteve FH. Ovi DEG su prvenstveno obogaćeni regulacijom transkripcije, adaptivnog imunološkog odgovora, proizvodnje imunoglobulina, negativne regulacije transkripcije i imunološkog odgovora (slika 2). Konstruisali smo funkcionalno uređenu mrežu GO/pathway termina koristeći Cytoscape dodatak ClueGO/CluePedia, poboljšanu interpretaciju bioloških pojmova. Ovaj dodatak nam je također pomogao da vizualiziramo mreže koje su funkcionalno grupisane iz većih genskih klastera [41]. Koristili smo dodatak ClueGO da identifikujemo različito regulisane molekularne puteve i njihove značajne interakcije gena na osnovu p-vrednosti i kappa statistike da bismo dobili sveobuhvatnu sliku DEG-ova uključenih u sepsu. Štaviše, DEG-ovi su značajno obogaćeni transkripcionom aktivnošću i vezivanjem proteina kada je analiziran MF iz GO (slika 3). Ovi rezultati ukazuju na to da se analize funkcionalnog obogaćivanja odnose posebno na signalne puteve imunoloških stanica koje se odnose na ćelijski odgovor na patogene motive ili citokine. Ovo su vjerovatno očekivani rezultati za septičke pacijente i potrebno je dodatno istraživanje kako bi se razjasnili putevi u sepsi. Na osnovu kappa statistike i p-vrednosti, otkrili smo da među obogaćenim biološkim procesima i molekularnim putevima, signalizacija citokina u imunološkom sistemu, adaptivni imunološki sistem, senzorna percepcija, urođeni imuni sistem i imunoregulatorne interakcije između limfoidnih i nelimfoidnih ćelije su bile disregulisane i bile su značajno povezane sa progresijom sepse kod starijih pacijenata sa sepse na intenzivnoj intenzivnoj njezi (slika 4).

Osim toga, pokazali smo raznolikost T ćelija kod starijih pacijenata sa sepsom i koristili MiXCR za analizu sirove sekvence RNA-Seq da bismo odredili klonotipove TCR-a, što nam je omogućilo da istovremeno ispitamo raznolikost TCR-a i cjelokupnog transkriptoma [ 15]. RNA-Seq i MiXCR su korišteni u ovoj studiji za identifikaciju signalizacije T ćelija i rezultati su otkrili da je TCR raznolikost R grupe na dan-8 bila veća od one na dan-1 (Slika 5) . U poređenju sa NR grupom, R grupa je imala značajno više vrijednosti CDR3, D50 i inverznog Simpsonovog indeksa na dan -8 nego na dan -1. Značaj inducirane raznolikosti TCR-a kod starijih pacijenata na intenzivnoj intenzivnoj njezi sa sepsom također je naglašen ovim dokazima, koji pokazuju održivost korištenja RNA-Seq i MiXCR podataka za rješavanje raznolikosti TCR-a kod pacijenata sa sepsom. Naša studija ima neka ograničenja koja treba napomenuti. Prvo, grupa pacijenata ispitanih u ovoj studiji bila je mala. Stoga bi istraživanja različitih populacija s većom veličinom uzorka pomogla u potvrđivanju naših podataka. Drugo, koristili smo masovnu RNA-Seq u ovoj studiji, a budući sc-RNA-Seq i funkcionalni eksperimenti su opravdani za validaciju na ćelijskom nivou. Štaviše, 5' brza amplifikacija krajeva cDNK (5'-RACE) pristup može se koristiti za istraživanje repertoara T-ćelija, što može dodatno potvrditi naše nalaze. Treće, procijenili smo biološke i molekularne funkcije upalnih odgovora kod pacijenata sa sepsom koristeći RNA-Seq podatke. Potrebne su daljnje funkcionalne studije kako bi se razjasnile uloge u sepsi.

Slika 4 Termini obogaćivanja genskom ontologijom (GO) vizualizirani su korištenjem dodatka ClueGO/CluePedia iz Cytoscapea

Slika 5 Raznolikost receptora T-ćelija na dan-1 i dan-8. Broji (A), jedinstveni CDR3 (B), D50 i (C) inverznog Simpsonovog indeksa. *<0.05, **<0.005

Zaključci

Učestalost i smrtnost od sepse su visoki kod starijih osoba. Naša studija je uključila kritično bolesne starije osobe sa sepsom i identifikovala biološke karakteristike relevantne za smrtnost i transkriptomske karakteristike sa funkcionalnim putem i MiXCR analizama zasnovanim na RNA-Seq podacima. U poređenju sa danom 1, otkrili smo pojačan urođeni imunitet i povećanu raznolikost T ćelija među pacijentima koji su reagirali 8. dana, što ukazuje da su pacijenti koji su reagirali imali bolje reguliran oporavak od sepse u usporedbi s pacijentima koji nisu reagirali. Za implementaciju preciznog i ranog predviđanja, korištenje testa RNA-Seq moglo bi ponuditi dodatne komplementarne informacije za rano predviđanje ishoda liječenja.

Reference

1. Seymour CW, Kennedy JN, Wang S, Chang CH, Elliott CF, Xu Z, et al. Derivacacija, validacija i potencijalne implikacije na liječenje novih kliničkih fenotipova za sepsu. JAMA. 2019;321(20):2003–17.

2. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R, et al. Nenadzirana analiza transkriptomije kod bakterijske sepse u više skupova podataka otkriva tri robusna klastera. Crit Care Med. 2018;46(6):915–25.

3. de Lange DW, Brinkman S, Flaatten H, Boumendil A, Morandi A, Andersen FH, et al. Kumulativni prognostički skor koji predviđa mortalitet kod pacijenata starijih od 80 godina primljenih na intenzivnu intenzivnu terapiju. J Am Geriatr Soc. 2019;67(6):1263–7.

4. Flaatten H, de Lange DW, Artigas A, Bin D, Moreno R, Christensen S, et al. Status istraživanja intenzivne medicine i budući program za veoma stare pacijente na intenzivnoj nezi. Intenzivna njega Med. 2017;43(9):1319–28.

5. Guidet B, de Lange DW, Boumendil A, Leaver S, Watson X, Boulanger C, et al. Doprinos slabosti, spoznaje, aktivnosti svakodnevnog života i komorbiditeta ishodu kod akutno primljenih pacijenata starijih od 80 godina u evropskim intenzivnim odjelima: VIP2 studija. Intenzivna njega Med. 2020;46(1):57–69.

6. Stahl EC, Brown BN. Strategije ćelijske terapije za borbu protiv nauke o imunogenima. Organogeneza. 2015;11(4):159–72.

7. Martin S, Perez A, Aldecoa C. Sepsa i imunosenescencija kod starijih pacijenata: pregled. Front Med (Lozana). 2017. https://doi.org/10. 3389/fmed.2017.00020.

8. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Antigen-specifičan adaptivni imunitet na SARS-CoV-2 kod akutnog COVID-a-19 i povezanost s godinama i težinom bolesti. Cell. 2020;183(4):996-1012 e1019.

9. Leblanc G, Boumendil A, Guidet B. Deset stvari koje treba znati o kritično bolesnim starijim pacijentima. Intenzivna njega Med. 2017;43(2):217–9.

10. Guidet B, Vallet H, Boddaert J, de Lange DW, Morandi A, Leblanc G, et al. Briga o kritično bolesnim pacijentima starijim od 80 godina: narativni pregled. Ann intenzivna njega. 2018;8(1):114.

11. Brady J, Horie S, Lafey JG. Uloga adaptivnog imunološkog odgovora u sepsi. Intenzivna njega Med Exp. 2020;8(1):20.

12. Martin MD, Badovinac VP, Grifth TS. Odgovori CD4 T ćelija i stanje imunoparalize izazvano sepsom. Front Immunol. 2020. https://doi.org/10. 3389/fmmu.2020.01364.

13. Barcella M, Bollen Pinto B, Braga D, D'Avila F, Tagliaferri F, Cazalis MA, et al. Identifikacija transkriptomskog profila povezanog s poboljšanjem funkcije organa kod pacijenata sa septičkim šokom nakon rane potporne terapije. Crit Care. 2018;22(1):312.

14. Cheng PL, Chen HH, Jiang YH, Hsiao TH, Wang CY, Wu CL, et al. Korištenje RNA-Seq za istraživanje karakteristika imunološkog metabolizma kod imunokompromitovanih pacijenata sa sepsom. Front Med (Lozana). 2021. https://doi. org/10.3389/fmed.2021.747263.

15. Bolotin DA, Poslavsky S, Mitrophanov I, Shugay M, Mamedov IZ, Putint‑seva EV, et al. MiXCR: softver za sveobuhvatno prilagodljivo profilisanje imuniteta. Nat Methods. 2015;12(5):380–1.

16. Bolotin DA, Poslavsky S, Davydov AN, Frenkel FE, Fanchi L, Zolotareva OI, et al. Profiliranje repertoara antigenskih receptora iz RNA-seq podataka. Nat Biotechnol. 2017;35(10):908–11.

17. Vincent JL, de Mendonca A, Cantraine F, Moreno R, Takala J, Suter PM, et al. Upotreba SOFA skora za procjenu incidence disfunkcije/zatajenja organa u jedinicama intenzivne njege: rezultati multicentrične, prospektivne studije Radna grupa za "probleme vezane za sepsu" Evropskog društva za intenzivnu medicinu. Crit Care Med. 1998;26(11):1793–800.

18. Garcia-Gigorro R, Saez-de la Fuente I, Marin Mateos H, Andres-Esteban EM, Sanchez-Izquierdo JA, Montejo-Gonzalez JC. Korisnost SOFA i Delta-SOFA rezultata za predviđanje ishoda kod kritično bolesnih pacijenata iz hitne pomoći. Eur J Emerge Med. 2018;25(6):387–93.

19. Jones AE, Trzeciak S, Kline JA. Skor sekvencijalnog zatajenja organa za predviđanje ishoda kod pacijenata sa teškom sepsom i dokazima hipoperfuzije u vrijeme prezentacije hitne pomoći. Crit Care Med. 2009;37(5):1649–54.

20. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: brzo spojeni aligner s malim zahtjevima za memorijom. Nat Methods. 2015;12(4):357–60.

21. Anders S, Huber W. Analiza diferencijalne ekspresije za podatke o broju sekvenci. Genome Biol. 2010;11(10):R106.

22. Liao Y, Smyth GK, Shi W. FeatureCounts: efikasan program opšte namene za dodeljivanje sekvenci čitanja genomskim karakteristikama. Bioinformat ics. 2014;30(7):923–30.

23. Raudvere U, Kolberg L, Kuzmin I, Arak T, Adler P, Peterson H, et al. g: Profiler: web server za analizu funkcionalnog obogaćivanja i konverzije genskih lista (ažuriranje 2019.). Nukleinske kiseline Res. 2019;47(W1):W191–8.

24. Merico D, Isserlin R, Stueker O, Emili A, Bader GD. Mapa obogaćivanja: metoda zasnovana na mreži za vizualizaciju i inter-predaciju obogaćivanja skupa gena. PLoS ONE. 2010;5(11):e13984.

25. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, et al. Cytoscape: softversko okruženje za integrisane modele biomolekularnih interakcijskih mreža. Genome Res. 2003;13(11):2498–504.

26. Andersen ES. Predviđanje i dizajn DNK i RNK struktura. N Bio-technol. 2010;27(3):184–93.

27. Le Gall JR, Lemeshow S, Saulnier F. Novi pojednostavljeni rezultat akutne fiziologije (SAPS II) zasnovan na evropskoj/sjevernoameričkoj multicentričnoj studiji. JAMA. 1993;270(24):2957–63.

28. Sutherland A, Thomas M, Brandon RA, Brandon RB, Lipman J, Tang B, et al. Razvoj i validacija novog dijagnostičkog testa molekularnih biomarkera za rano otkrivanje sepse. Crit Care. 2011;15(3):R149.

29. Lukaszewski RA, Jones HE, Gersuk VH, Russell P, Simpson A, Brealey D, et al. Presimptomatska dijagnoza postoperativne infekcije i sepse korištenjem potpisa genske ekspresije. Intenzivna njega Med. 2022. https://doi. org/10.1007/s00134-022-06769-z.

30. Niu J, Sun Y, Chen B, Zheng B, Jarugumilli GK, Walker SR, et al. Masne kiseline i ZDHHC19 pojačan rakom promovišu aktivaciju STAT3 putem S-palmitoilacije. Priroda. 2019;573(7772):139–43.

31. Burnham KL, Davenport EE, Radhakrishnan J, Humburg P, Gordon AC, Hutton P, et al. Zajednički i različiti aspekti transkriptomskog odgovora sepse na fekalni peritonitis i pneumoniju. Am J Respir Crit Care Med. 2017;196(3):328–39.

32. Hattori M, Yamazaki M, Ohashi W, Tanaka S, Hattori K, Todoroki K, et al. Kritična uloga endogenog histamina u promicanju ozljede tkiva krajnjeg organa u sepsi. Intenzivna njega Med Exp. 2016;4(1):36.

33. Reyes M, Filbin MR, Bhattacharyya RP, Billman K, Eisenhaure T, Hung DT, et al. Potpis imunoloških stanica bakterijske sepse. Nat Med. 2020;26(3):333–40.

34. Tang-Huau TL, Gueguen P, Goudot C, Durand M, Bohec M, Baulande S, et al. Ljudski in vivo generirani dendritični ćelije i makrofagi izvedeni iz monocita ukrštaju antigene kroz vakuolarni put. Nat Commun. 2018;9(1):2570.

35. Ivanov I, Kuhn H, Heydeck D. Strukturna i funkcionalna biologija 15-lipoksigenaze-1 arahidonske kiseline (ALOX15). Gene. 2015;573(1):1–32.

36. Singh NK, Rao GN. Nova uloga 12/15-lipoksigenaze (ALOX15) u ljudskim patologijama. Prog Lipid Res. 2019;73:28–45.

37. Baioumy SA, Esawy MM, Shabana MA. Procjena cirkulirajuće FCepsilonRIa u bolesnika s kroničnom spontanom urtikarijom i njena korelacija s kliničkim i imunološkim varijablama. Imunobiology. 2018;223(12):807–11.

38. Liao EC, Chang CY, Hsieh CW, Yu SJ, Yin SC, Tsai JJ. Istraživačka pilot studija genetskih markera za IgE posredovane alergijske bolesti sa ekspresijom FcepsilonR1alpha i Cepsilona. Int J Mol Sci. 2015;16(5):9504–19.

39. Hua L, Zuo XB, Bao YX, Liu QH, Li JY, Lv J, et al. Interakcija četiri lokusa gena između IL13, IL4, FCER1B i ADRB2 za astmu kod djece kineske Han. Pediatr Pulmonol. 2016;51(4):364–71.

40. Kosenko T, Golder M, Leblond G, Weng W, Lagace TA. Lipo-protein niske gustine se vezuje za proprotein konvertazu subtilizin/keksin tip-9 (PCSK9) u ljudskoj plazmi i inhibira PCSK9-posredovanu degradaciju receptora lipoproteina niske gustine. J Biol Chem. 2013;288(12):8279–88.

41. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A, et al. ClueGO: Cytoscape dodatak za dešifriranje funkcionalno grupisane ontologije gena i mreža za označavanje puteva. Bioinformatika. 2009;25(8):1091–3.