Sekvenciranje cijelog genoma za dijagnozu neuroloških poremećaja ponavljanja ekspanzije u UK: retrospektivna dijagnostička točnost i prospektivna studija kliničke validacije

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Sažetak

Pozadina

Poremećaji ekspanzije ponavljanja pogađaju oko 1 od 3000 osoba i klinički su heterogene bolesti uzrokovane ekspanzijama kratkih tandemskih ponavljanja DNK. Genetsko testiranje je često lokusno specifično, što dovodi do nedovoljne dijagnoze ljudi koji imaju atipične kliničke prezentacije, posebno kod pedijatrijskih pacijenata bez prethodne pozitivne porodične anamneze. Sekvenciranje cijelog genoma se sve više koristi kao test prve linije za druge rijetke genetske poremećaje, a cilj nam je bio procijeniti njegovu učinkovitost u dijagnostici pacijenata saneurološkiponavljajući poremećaji ekspanzije.

Metode

Retrospektivno smo procijenili dijagnostičku točnost sekvenciranja cijelog genoma kako bismo otkrili najčešće ponavljajuće lokuse ekspanzije povezane sneurološkiishode (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT i TBP) koristeći uzorke dobijene u Nacionalnoj zdravstvenoj službi u Engleskoj od pacijenata za koje se sumnjalo da imajuneurološkiporemećaji; prethodni rezultati PCR testa korišćeni su kao referentni standard. Klinička tačnost sekvenciranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija prospektivno je ispitana kod prethodno genetski testiranih i nedijagnosticiranih pacijenata regrutovanih 2013–17. u 100 000 Genomes Project u UK, za koje se sumnjalo da imaju genetskineurološkiporemećaj (porodični ili rani oblici ataksije, neuropatija, spastična paraplegija, demencija, bolest motornih neurona,parkinsonovacpokretporemećaji, intelektualni invaliditet ili neuromišićni poremećaji). Ako je poziv za ponovljeno proširenje napravljen korištenjem sekvenciranja cijelog genoma, PCR je korišten za potvrdu rezultata.

Nalazi

Dijagnostička tačnost sekvenciranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija procijenjena je u odnosu na 793 PCR testa prethodno obavljena u okviru NHS-a od 404 pacijenta. Sekvenciranje cijelog genoma ispravno je klasificiralo 215 od 221 proširenog alela i 1316 od 1321 neproširenog alela, pokazujući 97,3 posto osjetljivosti (95 posto CI 94,2–99,0) i 99,6 posto specifičnosti (99,1–99 ·9) u 13 lokusa povezanih sa bolešću u poređenju sa rezultatima PCR testa. U uzorcima 11 631 pacijenata u projektu Genomes 100 000 sekvenciranjem cijelog genoma je identifikovana 81 ponovljena ekspanzija, koja je također testirana PCR-om: 68 je potvrđeno kao ponovljena ekspanzija u punom patogenom rasponu, 11 nije bilo -patogene intermedijarne ekspanzije ili permutacije, a dva su bila ne-proširena ponavljanja (16 posto lažnog otkrića).

Interpretacija

U našoj studiji, sekvenciranje cijelog genoma za detekciju ponovljenih ekspanzija pokazalo je visoku osjetljivost i specifičnost, što je dovelo do identifikacijeneurološkiponavljajućih poremećaja ekspanzije kod prethodno nedijagnosticiranih pacijenata. Ovi nalazi podržavaju implementaciju sekvenciranja cijelog genoma u kliničkim laboratorijama za dijagnozu pacijenata koji imajuneurološkiprezentacija u skladu s poremećajem ponavljanja ekspanzije.

Finansiranje

Vijeće za medicinska istraživanja, Odsjek za zdravstvo i socijalnu skrb, Nacionalna zdravstvena služba Engleske, Nacionalni institut za zdravstvena istraživanja i Illumina.

Uvod

Uprkos nedavnom napretku u našem razumijevanju genetske osnove rijetkihneurološkiporemećaja, do 70 posto pacijenata sa takvim poremećajima ostaje genetski nedijagnostikovano.1–3 Djelomično je to zbog tehničkih izazova testiranja složenih i repetitivnih genetskih varijanti, uključujući ponovljene ekspanzije; Procjenjuje se da takve ekspanzije pogađaju oko 1 od 3000 ljudi (dodatak p 1) i da su vodeći uzrok više od 40 neurogenetskih poremećaja,4 uključujući Huntingtonovu bolest i krhki X sindrom. Poremećaji ponovnog širenja su klinički i genetski heterogeni, a ponovljena ekspanzija može biti povezana s različitim bolestima. Na primjer, ekspanzije u C9orf72 mogu se predstaviti ili kao amiotrofična lateralna skleroza ili frontotemporalna demencija.5 Ponovljene ekspanzije u različitim lokusima također mogu dovesti do sličnih fenotipskih karakteristika, što ih čini teškim za kliničko razlikovanje: ponavljanje ekspanzije u najmanje deset spinocerebelarne ataksije kao gena za odrasle često -početna ataksija,6 i ona u C9orf72 i AR mogu uzrokovati bolest motornih neurona.7,8

Poremećaji ekspanzije ponavljanja uzrokovani su povećanjem broja ponavljajućih kratkih tandemskih sekvenci DNK, a pragovi patogenosti za svaki poremećaj su specifični za lokus. Veličina proširenja varira od manje od 30 ponavljanja (npr. u CACNA1A) do nekoliko hiljada jedinica ponavljanja (npr. u FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN, koje se mogu proširiti do 5 kb u veličini). Ekspanzije ponavljanja pokazuju molekularnu nestabilnost, što može dovesti do promjena u veličini ponavljanja (generalno povećanje dužine) kroz generacije i tkiva.4 U ovim uvjetima, povećanje broja ponavljanja često dovodi do ranijeg početka i teže bolesti u uzastopnim generacije.4 Pedijatrijski početak poremećaja ponovljene ekspanzije može se prikazati kao multisistemski sindromi bez specifičnih fenotipskih potpisa,9 i stoga je vjerojatnije da će djeca s ovim poremećajima biti nedovoljno dijagnosticirana kada izostane porodična anamneza poremećaja ponovljene ekspanzije nego kada je prisutna.10– 12

Laboratorijska procjena ponovljenih ekspanzija obično je ograničena na ciljanu molekularnu procjenu pojedinačnog lokusa vođenu sumnjom na kliničku dijagnozu korištenjem PCR-baziranih ili Southern blot metoda,13 što može biti skupo i dugotrajno. Dodatno, zbog raznolikih i preklapajućih fenotipskih karakteristika ovih poremećaja, lokusi ponovljene ekspanzije povezani sa bolešću mogu ostati neprovjereni.14

Sekvenciranje cijelog genoma pojavljuje se kao dijagnostički alat prve linije kod pacijenata s rijetkim bolestima15, ali se do nedavno smatralo da ima ograničenu sposobnost procjene lokusa koji sadrže ponovljene ekspanzije.16 Napredak bioinformatike, međutim, učinio je izvodljivim otkrivanje bolesti - izazivanje ponovljenih ekspanzija iz podataka o sekvenciranju sljedeće generacije.17–22 Ovdje izvještavamo o dijagnostičkoj procjeni pristupa sekvenciranju cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija korištenjem retrospektivnih PCR podataka i njegovoj kliničkoj validaciji kod pacijenata u Projektu 100 000 genoma koji imao sumnju na neurološki poremećaj, koji nije dijagnosticiran prethodnim genetskim testiranjem.

Metode

Dizajn studije i učesnici

Ova evaluacija sekvenciranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija uključivala je i dijagnostičku tačnost i procjenu kliničke tačnosti. Dijagnostička tačnost je procijenjena korištenjem podataka pacijenata koji su prethodno bili testirani PCR-om na ponovljene ekspanzije za koje je poznato da uzrokuju neurološke bolesti.4 Pacijenti su identificirani iz dva izvora: Genomes Project 100 000 i Genomska laboratorija sa sjedištem u Univerzitetskim bolnicama Cambridge ( Cambridge, UK). Za oba skupa pacijenata, PCR testiranje je obavljeno na uzorcima pacijenata od strane laboratorija u Nacionalnoj zdravstvenoj službi (NHS) kao dio rutinske kliničke procjene: za uzorke u Projektu 100 000 genoma, PCR testovi su urađeni prije nego što je regrutacija u projekat od strane University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (London, UK); uzorci sa PCR-potvrđenim ponovljenim ekspanzijama su dobijeni od pacijenata testiranih u Genomskoj laboratoriji sa sedištem u Kembridžu. Pacijenti sa PCR-pozitivnim i PCR-negativnim rezultatima testova za ponavljanje poremećaja ekspanzije identifikovani su za uključivanje u našu studiju putem sistema laboratorijskih zapisa; svi pacijenti su dali pismeni informirani pristanak za korištenje njihovog uzorka u svrhu osiguranja kvaliteta i istraživanja i obuke, kao dio optimizacije i validacije kliničke usluge.

Sekvenciranje cijelog genoma svakog uzorka obavljeno je u jednoj od dvije laboratorije: Genomics England (Hinxton, UK) za uzorke projekta 100000 Genomes (n=254) i Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, SAD) za uzorke dobijene od strane Genomske laboratorije sa sjedištem u Cambridgeu (n=150). Sveukupno, ovaj skup podataka korišten je za dio studije o dijagnostičkoj preciznosti, a sastojao se od PCR i podataka sekvenciranja cijelog genoma od 404 pacijenta, pokrivajući 13 lokusa koji predstavljaju najčešće neurološke poremećaje ponavljanja: 11 lokusa povezanih s ataksijom i kasnim početak neurodegenerativnih poremećaja (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 i FXN), jedan lokus povezan s intelektualnim invaliditetom (FMR1) i jedan lokus povezan s miotoničnom distrofijom (DMPK). Za svaki lokus, podaci PCR testa bili su dostupni za najmanje jedan prošireni alel (dodatak p 24).

Klinička tačnost procijenjena je ispitivanjem podudarnosti ponovljenih ekspanzija, otkrivenih sekvenciranjem cijelog genoma, sa sumnjom na kliničku dijagnozu nakon PCR potvrde kod pacijenata sa sumnjom na genetske neurološke poremećaje (porodični ili rani oblici ataksije, neuropatije, spastične paraplegije, demencije , bolest motornih neurona,parkinsonovacporemećaji kretanja, intelektualni invaliditet ili neuromišićni poremećaji) regrutovani u Projekt 100 000 genoma 2013–17. Projekat 100 000 genoma je britanski program za procjenu vrijednosti sekvenciranja cijelog genoma kod pacijenata sa nezadovoljenim dijagnostičkim potrebama rijetkih bolesti i raka. Nakon etičkog odobrenja za projekat 100000 genoma od strane Etičkog odbora East of England South Research Ethics Committee (referenca 14/EE/1112), uključujući analizu podataka i vraćanje dijagnostičkih nalaza pacijentima, ove pacijente su angažovali zdravstveni radnici i istraživači iz 13 centara za genomsku medicinu u Engleskoj i bili su uključeni u projekat ako su oni ili njihov staratelj dali pismeni pristanak da se njihovi uzorci i podaci koriste u istraživanju, uključujući ovu studiju. Probandi i, ako je to izvodljivo, ostali članovi porodice, upisani su prema kriterijumima podobnosti postavljenim za specifična stanja retkih bolesti (prilog str. 5–11). Pacijenti su regrutovani u Projekt 100.000 genoma nakon standardnog genetskog testiranja u NHS-u, kao što je navedeno u kriterijima podobnosti. Standardizovani osnovni klinički podaci su zabeleženi korišćenjem ontologije humane fenotipizacije (HPO)23 u odnosu na modele podataka specifičnih za bolest.24 Status bolesti članova porodice, u odnosu na kliničku indikaciju probanda za testiranje, takođe je prikupljen.

Da bismo identificirali uzročne ponovljene ekspanzije kod pacijenata s genetski nedijagnostikovanom bolešću, testirali smo pacijente sa sumnjivim genetskim poremećajima koji su u skladu s bolešću ponovljene ekspanzije. Pacijenti su odabrani na osnovu podudarnosti njihove bolesti i termina HPO sa ponovljenim poremećajima povezanim sa ekspanzijom. Podaci sekvencioniranja cijelog genoma pacijenata ispitivani su kako bi se tražila ekspanzija u određenim skupovima ponavljanja koristeći četiri različita panela za proširenje ponavljanja prema njihovim kliničkim karakteristikama (Dodatak p 5). Ponovljene ekspanzije odabrane za uključivanje na ove panele su najčešći lokusi ponavljanja ekspanzije koji uzrokuju neurološke bolesti. Pacijenti s kliničkim karakteristikama potencijalno kompatibilnim s više od jednog poremećaja ponovljene ekspanzije testirani su na više panela. Ako je poziv za ponovljeno proširenje napravljen korištenjem sekvenciranja cijelog genoma, izvršeno je potvrdno testiranje PCR-om.

Za svakog pacijenta s potvrđenom ponovljenom ekspanzijom, lokalni kliničar je obaviješten o potencijalnom dijagnostičkom rezultatu i procijenjen je doprinos ponovljene ekspanzije kliničkim karakteristikama pacijenta. Za ponovljene ekspanzije koje su u potpunosti ili djelimično objasnile kliničke karakteristike pacijenta, izdat je dijagnostički izvještaj prema lokalnim standardnim procedurama.

Procedure

Za historijske uzorke NHS koji su korišteni u dijelu naše studije o dijagnostičkoj tačnosti, ponovljene ekspanzije su prethodno testirane korištenjem PCR amplifikacije i analize fragmenata. Southern blotting je izveden za velike ekspanzije C9orf72. U dijelu naše studije o kliničkoj tačnosti, ponovljene ekspanzije otkrivene sekvenciranjem cijelog genoma kod pacijenata iz 100 000 Genomes projekta su testirane PCR-om u uzorcima pohranjenim u genetskim laboratorijama NHS-a. Dodatni detalji, uključujući sekvence prajmera, date su u dodatku (str. 2–3, 25–26).

DNK je pripremljena za sekvenciranje cijelog genoma korištenjem TruSeq DNA PCR-Free pripreme biblioteke, a sekvenciranje uparenih krajeva od 150 bp ili 125 bp je izvedeno na HiSeq 2000 ili HiSeq X platformama u postrojenju za genome visoke propusnosti za Genomics England i na ICSL-u. . Genomi su sekvencionirani do prosječne dubine od 35× (31× do 37×; dodatak p 27). Genotipizacija sa kratkim tandemom je izvedena korišćenjem softverskog paketa ExpansionHunter verzije 3.1.2.25,26 Ukratko, ExpansionHunter preusmjerava sekvenciranje čitanja preko unaprijed definiranog skupa kratkih tandem ponavljanja kako bi se procijenila veličina oba alela od pojedinca (Dodatak p 3).

ExpansionHunter izlaz uključuje procjenu broja ponavljajućih elemenata, ukupne veličine i granice pouzdanosti za svaki procijenjeni lokus. Smjernice Udruženja za medicinsku patologiju i Koledža američkih patologa preporučuju vizuelnu inspekciju varijantnih poziva tokom rutinske procjene visokopropusnih varijanti sekvenciranja.27

Međutim, kratke tandemske varijante ponavljanja ne mogu se adekvatno vizualizirati uobičajenim alatima za vizualizaciju kao što je Integrative Genomics Viewer.28 Da bi se ispitali cijeli podaci sekvenciranja genoma koji su u osnovi svakog poziva genotipa, korišten je alat za vizualizaciju grafa, koji omogućava direktnu vizualizaciju haplotipova i odgovarajućeg čitanja. genotipova ExpansionHunter (dodatak str. 3, 15). Vizuelna inspekcija grafa gomilanja obavljena je na svim kratkim tandemskim ponovljenim pozivima sekvenciranja cijelog genoma kako bi se potvrdilo da je predviđanje ExpansionHunter za alele u potpunosti sadržano u svakom čitanju (tj. sekvenca ponavljanja bila je manja od dužine čitanja sekvenciranja); da se potvrdi prisustvo monoalelne ili bialelne ekspanzije; za otkrivanje navodnih lažno pozitivnih poziva; i za otkrivanje lažno negativnih alela u bialelnim ekspanzijama ponavljanja, kao što je FXN (dodatak, str. 4, 16).

ExpansionHunter procjenjuje veličinu ponavljanja iz podataka sekvenciranja cijelog genoma analizirajući očitanja sekvenciranja koja u potpunosti ili djelomično sadrže kratko ponavljanje u tandemu. Ako je kratki tandemski ponavljajući alel kraći od dužine čitanja, ExpansionHunter predviđa tačnu veličinu; ako je kratki alel tandemskog ponavljanja duži od dužine čitanja, ExpansionHunter procjenjuje veličinu ponavljanja unutar CI, ovisno o sastavu sekvence lokusa, dubini sekvenciranja i kvaliteti sekvenciranja.

Statistička analiza

Klasificirali smo ponavljanja kao proširena sekvenciranjem cijelog genoma ako je veličina koju je predvidio ExpansionHunter bila iznad granične vrijednosti premutacije, ili kao neproširene ako je predviđena veličina bila ispod granične vrijednosti (dodatak p 28).

Osetljivost i CI za otkrivanje ekspanzije ponavljanja sekvenciranja cijelog genoma izračunati su kao udio alela sa proširenim ponavljanjima među prethodno potvrđenim PCR alelima sa proširenim ponavljanjima. Specifičnost je procijenjena kao udio neproširenih alela među prethodno testiranim neekspandiranim ponavljanjima PCR-om. Potpuni opis statističkih formula dat je u dodatku (p 1).

Da bi se uporedile veličine ponavljanja pomoću PCR-a sa procenama veličine ponavljanja sekvenciranjem celog genoma, PCR-kvantifikovani aleli su upoređeni sa veličinama ponavljanja koje je predvideo ExpansionHunter za alele kraće od čitane dužine u svih 13 kratkih tandemskih lokusa ponavljanja. Konkordancija je izračunata na osnovu procenta veličina ponavljanja koje je predvideo ExpansionHunter koje su bile u saglasnosti sa PCR-kvantifikovanom veličinom, uzimajući u obzir PCR grešku od plus ili minus jedno ponavljanje. Statistička analiza je izvršena korištenjem R statističkog softvera verzije 3.6.3.

Uloga izvora finansiranja

Dizajn studije, upis pacijenata, prikupljanje podataka i sekvenciranje vodili su zaposleni u Genomics England-u i akademski istraživači. Zaposleni u Illumini izvršili su sekvenciranje 150 uzoraka pacijenata kao planiranu komponentu dijagnostičke tačnosti sekvenciranja cijelog genoma i razvili ExpansionHunter. Zaposlenici Genomics England, akademski istraživači i koautori RTH, ED i MAE izvršili su analizu i interpretaciju ponovljenih ekspanzija kod pacijenata regrutovanih u 100 000 Genomes Project. Izvori finansiranja nisu imali nikakvu ulogu u tumačenju podataka ili pisanju izvještaja.

Rezultati

Dijagnostička tačnost sekvenciranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija procijenjena je u odnosu na 793 PCR testa prethodno obavljena u okviru NHS-a od 404 pacijenta (64 pacijenta su testirana za više od jednog ponavljanja; slika 1). Od ovih testova, 183 su klasifikovana kao sa proširenim ponavljanjem, a 610 kao bez ponovljene ekspanzije pomoću PCR-a, što je dalo ukupno 221 prošireni i 1321 neprošireni individualni alel u 13 lokusa bolesti (Dodatak, str. 24, 28). Sekvenciranje cijelog genoma ispravno je klasificiralo 215 od 221 proširenog alela i 1316 od 1321 neproširenog alela u poređenju s rezultatima PCR testa (dodatak str. 27, 29), pokazujući početnu osjetljivost od 97,3 posto (95 posto CI 94·2–99 ·0) i specifičnost od 99·6 procenata (99·1–99·9; tabela 1). Nakon vizuelne korekcije svih poziva na osnovu kvaliteta očitavanja, osjetljivost se povećala na 99,1 posto (96,8–99,9), a specifičnost na 100 posto (99,7–100; slika 2A, tabela 1). Vizualizacija proširenih alela omogućila je detekciju lažno pozitivnih rezultata i reklasifikaciju svih lažno negativnih alela u FXN, od kojih je samo jedan alel ispravno klasifikovan kao proširen u uzorcima sa bialelnim ekspanzijama (prilog str. 17, 18).

Dužina ponavljanja je kvantifikovana pomoću PCR-a u 509 PCR testova koji su ispitivali 945 alela u 13 lokusa ekspanzije ponavljanja. Korelacije između ExpansionHunter i PCR-a za veličine ponavljanja kraće i veće od dužine čitanja sekvencioniranja (tj. 150 bp) prikazane su u dodatku (dodatak str. 19). Visoka podudarnost je uočena za ponavljanja kraća od dužine čitanja, sa 92,7 posto (836 od 902) slaganja između PCR-a i ExpansionHunter-a. Uočena je varijabilnost lokusa, uz visoku podudarnost između ExpansionHunter i PCR za ATXN2, ATXN7, CACNA1A i HTT, i nisku podudarnost za DMPK ili TBP (dodatak str. 30). ExpansionHunter je potcijenio dužine alela većih od čitane, što je uticalo na tačnost pozivanja u DMPK, FMR1 i FXN (slika 2B, dodatak str. 19, 31).

Iako je ExpansionHunter uspio ispravno identificirati velike proširene alele u FMR1, DMPK, C9orf72 i FXN (dodatak p 29), predviđene procjene veličine su imale tendenciju da budu niže od onih dobivenih PCR-om kako se veličina ponavljanja povećavala unutar patogenog raspona, što je uticalo na sposobnost razlikovanja između velikih i malih proširenja u DMPK, C9orf72 i FXN, ili između potpunih proširenja i permutacija u FMR1 (dodatak p 31). Na primjer, lokusi sa PCR procijenjenom dužinom ponavljanja većom od 200 ponavljanja u FMR1 i klasifikovanim kao puna mutacija imali su srednju veličinu ponavljanja koju je ExpansionHunter procijenio od 92,6 (SD 17,8; dodatak p 31).

Kako bismo testirali sposobnost otkrivanja ponovljene ekspanzije sekvenciranjem cijelog genoma kako bi se riješila dijagnoza prethodno testiranih i genetski nedijagnosticiranih pacijenata, testirali smo 11 631 pacijenata sa sumnjom na genetski neurološki poremećaj angažovanih u Projektu 100000 genoma (slika 1). Podaci sekvencioniranja cijelog genoma procijenjeni su korištenjem četiri različita panela za ponovljeno proširenje prema kliničkim karakteristikama pacijenta. Broj pacijenata testiranih sa svakim od četiri panela prikazan je u tabeli 2.

Sve u svemu, otkrili smo i vizuelno potvrdili ponovljene ekspanzije u uzorcima od 105 pacijenata (tabela 2, dodatak str. 20, 33). Od toga je 81 uzorak bio dostupan za potvrdno testiranje PCR-om, a za 68 je potvrđeno da imaju ponovljeno širenje (0·6 posto prinosa): 45 (1·2 posto) od 3692 u panelu A, osam ({ {18}}·3 procenta ) od 2743 na panelu B, pet (0·6 procenata) od 860 na panelu C i deset (0·1 procenat) od 6731 na panelu D. Trinaest od 81 poziva proširenja nisu potvrđene kao patogene ponovljene ekspanzije (16 posto lažnih otkrića). Od toga, dva su bila neprošireni aleli u ATXN1 i ATXN2, četiri su bila FMR1 pozivi srednje veličine (dodatak p 21), a sedam su bile FMR1 permutacije.

Klinički detalji 68 pacijenata sa ponovljenim ekspanzijama potvrđenim PCR-om, uključujući njihovu kliničku sliku, identifikovanu ponovljenu ekspanziju i doprinos ponovljene ekspanzije kliničkim karakteristikama pacijenta dati su u tabeli 3; HPO termini, veličina ponavljanja koju je procijenio ExpansionHunter i da li je izdat dijagnostički izvještaj navedeni su u dodatku (p 33).

Ekspanzije su primijećene kod pacijenata sa širokim spektrom preklapajućih kliničkih prezentacija testiranih na panelu A (tabela 3, dodatak p 22), uključujući ponovljeno širenje ATXN2 kod pacijenta s ranom pojavom Parkinsonove bolesti koja reagira na levodopu i istorijom progresivne cerebelarne ataksije i proširenja AR kod četiri pacijenta s klinički dijagnosticiranom Charcot-Marie-Tooth bolešću, uključujući i jednog s genetski potvrđenom demijelinizirajućom neuropatijom (tj. Charcot-Marie-Toothova bolest tip 1, pacijent 42; dodatak p 33). Širok raspon prethodnih kliničkih dijagnoza primijećen je kod pacijenata s patogenim ponovljenim ekspanzijama.

Na primjer, kod sedam pacijenata sa amiotrofičnom lateralnom sklerozom ili drugom bolešću motornih neurona, ekspanzije su identificirane u AR (n=4) i C9orf72 (n=3). Kod pacijenata sa sumnjom na naslednu ataksiju, identifikovali smo ekspanzije u lokusima koji nisu bili procenjeni kao deo rutinske dijagnostičke obrade unutar NHS-a u vreme regrutovanja, uključujući ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP i HTT ( tabela 3). Također smo otkrili ponovljene ekspanzije kod pacijenata s kliničkim karakteristikama koje su u skladu s alternativnim poremećajima ponavljanja, uključujući ekspanziju C9orf72 kod rane pojave i porodične Parkinsonove bolesti (pacijent 24, tabela 3) i ponovljene ekspanzije u smanjenom rasponu penetracije u HTT (38 ponavljanja) kod dvije sestre s poremećajem kretanja, demencijom, depresijom i poteškoćama u govoru (pacijenti 44 i 45), što naglašava dijagnostički izazov koji predstavljaju ovi poremećaji ponavljanja.

Utvrđeno je da osmoro djece testirane na panelu B ima veliku ekspanziju ponavljanja CAG-a (slika 3), od kojih sedmoro u potpunosti objašnjava kliničke karakteristike pacijenta. Šest pacijenata nije imalo informativnu porodičnu anamnezu i nije im ponuđeno ponovno testiranje ekspanzije kao dio njihove kliničke procjene u vrijeme regrutovanja (pacijenti 48–53; tabela 3, dodatak p 33). Dvoje od ove djece imalo je velike HTT ekspanzije (90-100 CAG ponavljanja). Treba napomenuti da je jedno dijete naslijedilo ponavljanje od roditelja koji nije zaražen u porodici bez porodične istorije Huntingtonove bolesti. Porodično testiranje je u toku, ali je u proširenoj porodici identifikovan alel smanjene penetracije, što ukazuje da se ponavljanje proširilo za preko 60 ponovljenih jedinica u jednoj generaciji (pacijent 52). U vrijeme pisanja ovog teksta, niko u porodici nije pokazivao znakove Huntingtonove bolesti, a genetsko savjetovanje i testiranje roditelja su u toku. Dvoje djece mlađe od 5 godina imalo je velike ponovljene ekspanzije u ATXN7 i imalo složenu multisistemsku bolest. Za jedno od ove djece (pacijent 50), njihov roditelj je pokazao probleme u hodu 2 godine nakon upisa u projekat 100 000 genoma. Slično, utvrđeno je da djevojčica od 10 godina sa intelektualnim invaliditetom ima 99-ponovnu ekspanziju u ATXN2, uprkos činjenici da su oba roditelja označena kao nepromijenjena, a djevojčica od 18 godina sa demencijom ima { {19}}ponovno proširenje u ATN1 (dodatak p 33).

Detektovano je pet ekspanzija u DMPK (panel C), uključujući kod djeteta i majke s kliničkom dijagnozom mišićne distrofije, kod dvoje braće i sestara sa sumnjom na distalnu miopatiju i kod adolescenta s kongenitalnom miopatijom (pacijenti 54-58). Ekspanzije FMR1 (panel D) otkrivene su kod devet dječaka i jedne djevojčice, a dijagnoza Fragile X sindroma je u potpunosti ili djelimično objasnila prisutne kliničke karakteristike (pacijenti 59-68).

Diskusija

Dijagnoza poremećaja ponovljene ekspanzije je izazovna u zdravstvenoj zaštiti zbog heterogenih i preklapajućih kliničkih karakteristika i nespecifičnih kliničkih nalaza, čija težina može povećati s godinama i u svakoj sljedećoj generaciji. Poremećaji ponovljene ekspanzije su među najčešćim uzrocima nasljednih neuroloških bolesti.4 Ipak, pacijentima se može nedovoljno dijagnosticirati, bilo zato što nije obavljeno dovoljno genetskog testiranja ili zato što uzročne genetske varijante tek treba da budu otkrivene. Pristupi testiranju su trenutno fragmentirani, a pacijenti bi mogli imati testiran netačan ponovljeni lokus ekspanzije29 ili dobiti molekularni test za drugu klasu varijanti zbog preklapanja kliničkih karakteristika s drugim neurološkim genetskim poremećajima.30

Sekvenciranje cijelog genoma korišteno je u više okruženja kao dijagnostički test prve linije za rijetke neurološke poremećaje, ali se ranije smatralo da ima nisku sposobnost otkrivanja ponovljenih ekspanzija.16 Razvijeno je nekoliko alata za identifikaciju ponovljenih ekspanzija iz cijelog genoma sekvencioniranje u istraživačkom okruženju,31 ali nijedan od ovih pristupa nije primijenjen na podatke sekvenciranja cijelog genoma prikupljene od velikog broja pacijenata u jednoj zdravstvenoj službi. Predstavljamo dokaze da algoritam dizajniran za otkrivanje ponovljenih ekspanzija iz sekvenciranja cijelog genoma može pouzdano procijeniti najčešća ponovljena proširenja koja izazivaju bolesti i riješiti prethodno genetski nedijagnostikovane slučajeve u velikoj skupini pacijenata s neurološkim poremećajima. Naši rezultati pokazuju da sekvenciranje cijelog genoma može razlikovati između neproširenih i proširenih alela s visokom osjetljivošću i specifičnošću preko 13 ponavljajućih lokusa ekspanzije (koji se mogu dodatno poboljšati vizualnom inspekcijom), može precizno izračunati veličinu alela manjih od očitane dužine , i može potcijeniti veličinu velikih proširenja u FMR1, DMPK, FXN i C9orf72.

Kada je otkrivanje ponovljenih ekspanzija sekvenciranjem cijelog genoma procijenjeno u odnosu na pozitivne i negativne rezultate prethodno dobijene u kliničkim dijagnostičkim genomskim laboratorijama koristeći metode zlatnog standarda, pronašli smo minimalno 97,3 posto osjetljivosti i 99,6 posto specifičnosti. Nadalje, pokazali smo da se i specifičnost i osjetljivost mogu poboljšati ručnim kuriranjem gomile čitanja, omogućavajući detekciju lažno pozitivnih rezultata i reklasifikaciju lažno negativnih alela u uzorcima s bialelnim ekspanzijama. Od 6731 pacijenta testiranog na FMR1 (panel D), predviđeno je da će 124 poziva biti prošireno. Vizuelnim pregledom smo uspjeli isključiti 97 kao vjerovatne lažne pozitivne rezultate. Ovo ukazuje da bi 1 od 54 testa sekvenciranja cijelog genoma imao FMR1 poziv koji bi trebao biti vizualno pregledan da bi se odbacio potencijalni lažno pozitivan poziv. U toku je rad na poboljšanju ExpansionHunter metode genotipizacije kako bi se smanjio broj lažno pozitivnih poziva za FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 ponavljanja) uzrokuju težu bolest i spinocerebelarna ataksija tipa 36 (NOP56), za koju se širenja veća od 650 ponavljanja smatraju patogenim, a veličine ponavljanja od 15-650 smatraju se srednjim i varijantama neizvjesnog značaja.

Identificirano je više od 40 ponovljenih lokusa ekspanzije; mnogi od ovih lokusa su tek nedavno identificirani i sada su povezani s prethodno neobjašnjivim stanjima, uključujući cerebelarnu ataksiju s neuropatijom i sindromom vestibularne arefleksije (RFC1) 32 i miokloničnu epilepsiju (SAMD12).33 Najčešći lokusi ponavljane ekspanzije koji izazivaju neurološke bolesti bili su odabrani za našu studiju na osnovu dostupnosti uzoraka pozitivne i negativne kontrole.

Nalazi predstavljeni ovdje sugeriraju da bi ExpansionHunter trebao biti u stanju precizno klasificirati neproširene i proširene alele na bilo kojem ponovljenom lokusu ekspanzije ako su neprošireni aleli manji od očitane dužine (tj. 150 bp). Iako većina ponavljajućih lokusa ekspanzije ima alele koji su manji od 150 bp kada nisu ekspandirani, neke lokuse za koje je veličina neproširenog alela blizu 150 bp (npr. NOTCH2NLC)34 može biti teže genotipizirati korištenjem ovog pristupa. Za lokuse u kojima je prošireno ponavljanje značajno veće od dužine očitavanja, sekvenciranje cijelog genoma može otkriti patogene ekspanzije (npr. NOP56,35 RFC120,32). Nove tehnologije sekvenciranja koje se dugo čitaju mogu ponuditi komplementarne pristupe prilikom genotipizacije velikih ekspanzija.36

Procjena ponovljenih ekspanzija korištenjem sekvenciranja cijelog genoma kod 11 631 nedijagnosticiranih pacijenata regrutovanih u 100 000 Genomes Project dala je 68 pacijenata sa objašnjenjima. Pacijenti su regrutovani u 100 000 Genomes Project nakon standardnog genetskog testiranja; stoga, udio ponovljenih ekspanzija identificiranih u ovoj kohorti predstavlja povećanje dijagnostičkog prinosa u odnosu na standardno NHS testiranje, koje uključuje testiranje specifično za lokus za poremećaje ponovljene ekspanzije kao što su FXN ili DMPK. Treba napomenuti da se na neke dijagnoze nije sumnjalo na osnovu kliničkih karakteristika pacijenta, uključujući šest pedijatrijskih pacijenata koji nisu imali poznatu porodičnu anamnezu o poremećaju ponavljanja. Prosječne veličine ponovljene ekspanzije predviđene sekvenciranjem cijelog genoma kod pedijatrijskih pacijenata opisanih u ovoj studiji su znatno veće od prosjeka kod odraslih, u skladu s očekivanjem da su veće ekspanzije povezane s ranijim i težim početkom, čak i kod djece. Potreban je daljnji rad, ali ovaj nalaz sugerira da bi procjena patogenosti ovisno o dobi i ponovljenoj veličini mogla podržati pedijatrijsku dijagnozu smanjujući potencijalni rizik od identifikacije alela rizika kod odraslih, što dovodi do neželjenog prediktivnog testiranja kod djece.

Naši nalazi omogućavaju uspostavljanje kliničkog dijagnostičkog procesa za sekvenciranje cijelog genoma (dodatak str. 23). Predlažemo da se vizuelna inspekcija uradi za sve pozive klasifikovane kao proširene radi otkrivanja lažnih pozitivnih rezultata, i za bialelne ekspanzije za koje je otkriven samo jedan prošireni alel (npr. FXN). Preporučujemo da laboratorije koriste ExpansionHunter za procjenu prisutnosti proširenja bez pridržavanja procjene veličine i da izvrše potvrdno PCR testiranje kao standardnu ​​komponentu toka rada testiranja.

Rijetke nasljedne bolesti uključuju širok spektar kliničkih karakteristika, čineći genomsko testiranje specifično za lokus neefikasnim, napornim i skupim. Predstavljamo dokaze da se sekvenciranje cijelog genoma kliničkog stupnja s potencijalom za dijagnosticiranje niza rijetkih neuroloških bolesti koje se tipično prikazuju s jednom bazom, indelom ili varijantom broja kopija sada može proširiti na ponovljene ekspanzije. Budući da sekvenciranje cijelog genoma pruža jedan test koji može identificirati najčešće ponovljene ekspanzije, kao i istovremeno omogućavanje testiranja tačkastih mutacija i varijanti broja kopija u genima povezanim s ovim stanjima, nudi mogućnost da se identificira većina pacijenata s ovim heterogenim poremećajima. kojima nije dijagnosticirana lokus-specifičnim testiranjem. U eri novih terapija za ove poremećaje, rano otkrivanje moglo bi postati ključno.37 Ovi rezultati podržavaju implementaciju sekvenciranja cijelog genoma za otkrivanje ponovljenih ekspanzija u kliničkim dijagnostičkim laboratorijama, pristup koji je već uključen u NHS England National Genomic Test Directory,38 za istraživanje nedijagnosticirane rijetke neurološke bolesti.

Reference

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Dijagnostički plafon za sekvenciranje egzoma kod cerebelarne ataksije i povezanih neuroloških poremećaja. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Nasljedna spastična paraplegija u Grčkoj: karakterizacija ranije neistražene populacije korištenjem sekvenciranja sljedeće generacije. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Dijagnostički prinos ciljanog panela gena za sekvenciranje sljedeće generacije za poremećaje kretanja kod djece: 3-godišnja kohortna studija. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Bolesti ponovljene ekspanzije. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporalna demencija i/ili amiotrofična lateralna skleroza. Sijetl, Vašington: Univerzitet Vašingtona, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebelarna ataksija. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klinička neurogenetika: autosomno dominantna spinocerebelarna ataksija. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Spinalna i bulbarna mišićna atrofija. U: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, ur. GeneReviews. Seattle, WA: Univerzitet Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Smrtonosni oblik spinocerebelarne ataksije tip 7 sa ranim početkom u djetinjstvu. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Agregacija i ubikvitinacija ataksin-7 kod infantilnog SCA7 sa 180 CAG ponavljanja. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebelarna ataksija tip 2 sa kognitivnom regresijom u djetinjstvu. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Spinocerebelarna ataksija s početkom u djetinjstvu 3: distonija jezika kao rana manifestacija. Tremor Ostalo Hyperkinetic Mov 2019; objavljeno na internetu 13. septembra.

13 Bird TD. Miotonična distrofija tip 1. U: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, ur. GeneReviews. Sijetl, Vašington: Univerzitet Vašingtona, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Učestalost ekspanzija ponavljanja SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS i C9orf72 kod pacijenata sa SCA negativnim na najčešće podtipove SCA. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Sekvenciranje cijelog genoma pacijenata sa rijetkim bolestima u nacionalnom zdravstvenom sistemu. Priroda 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Ka preciznoj medicini. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Dijagnostička i klinička korisnost sekvenciranja cijelog genoma u kohorti nedijagnosticiranih kineskih porodica s rijetkim bolestima. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiliranje pejzaža tandemskih ponavljanja u cijelom genomu. Nukleinske kiseline Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Deteciranje ekspanzije tandemskih ponavljanja u kohortama sekvenciranim s podacima sekvenciranja kratkog čitanja. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Identifikacija proširenih ponavljanja zasnovana na bioinformatici: nereferentna ekspanzija introničnog pentamera u RFC1 uzrokuje CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Varijante broja kopija u sekvenciranju kliničkog genoma: primjena i interpretacija rijetke i nedijagnosticirane bolesti. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Detekcija tandemskih DNK ponavljanja koja su proširena kod autizma u cijelom genomu. Priroda 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ontologija ljudskog fenotipa: alat za označavanje i analizu ljudskih nasljednih bolesti. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomics England. Modeli kliničkih podataka stanja rijetkih bolesti. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (pristupljeno 4. avgusta 2021.).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Detekcija dugog ponavljanja ekspanzija iz podataka sekvence cijelog genoma bez PCR-a. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: alat baziran na sekvenci grafa za analizu varijacija u kratkim tandem regionima ponavljanja. Bioinformatika 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Standardi i smjernice za validaciju bioinformatičkih cijevi sljedeće generacije za sekvenciranje: zajednička preporuka Udruženja za molekularnu patologiju i Koledža američkih patologa. J Mol Diagn 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrativni preglednik genomike. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Fenotipska homogenost prikaza nalik Huntingtonovoj bolesti u porodici SCA17. Neurology 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtonova bolest, sličice Huntingtonove bolesti i benigna nasljedna koreja: šta je novo? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Nedavni napredak u otkrivanju ponovljenih proširenja sa sekvenciranjem sljedeće generacije kratkog čitanja. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Bialelna ekspanzija introničnog ponavljanja u RFC1 je čest uzrok ataksije sa kasnim početkom. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Ekspanzije introničkih TTTCA i TTTTA ponavljanja kod benigne odrasle porodične mioklonične epilepsije. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Nekodirajuće ekspanzije CGG ponavljanja kod neuronske intranuklearne inkluzivne bolesti, okulofaringodistalne miopatije i bolesti preklapanja. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Brza dijagnoza spinocerebelarne ataksije 36 u porodici od tri generacije koristeći kratko čitane podatke sekvenciranja cijelog genoma. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Dugo čitano sekvenciranje koje se pojavljuje u medicinskoj genetici. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Poremećaji ekspanzije ponavljanja: mehanizmi i terapije. Neurotherapeutics 2019; 16: 924–27.

38 Nacionalni zdravstveni sistem. Nacionalni direktorijum genomskih testova: kriterijumi testiranja za retke i nasledne bolesti. Oktobar, 2021.