Učinkovitost izbjeljivanja ginsenozida F1 kroz inhibiciju prijenosa melanina u kokultiviranim ljudskim melanocit-sekeratinocitima i trodimenzionalnom ekvivalentu ljudske kože

Ginsenozidi su glavni aktivni sastojci ginsenga. U fiziologiji kože, ginsenozidi utiču na regulaciju pigmenta i pokazuju aktivnost protiv starenja. Prema nedavnim izvještajima, ginsenozid Rg1 povećava melanogenezu i aktivnost tirozinaze u ljudskim melanocitima [1]. Nasuprot tome, ginsenozid F1 (GF1) (sl. 1), metabolit proizveden hidrolizom Rg1, navodno inhibira vidljivu pigmentaciju. Klinička studija koju su proveli Han i saradnici pokazala je učinak GF1 na izbjeljivanje kože na umjetno preplanulu ljudsku kožu uzrokovanu produkcijom interleukina 13 iz humanih epidermalnih gd T stanica [2]. Kim i suradnici su pokazali da GF1 smanjuje lučenje melanina kroz retrakciju dendrita bez utjecaja na sadržaj unutarćelijskog melanina i ekspresiju tirozinaze u ćelijama mišjeg melanoma stimuliranih melanocit-stimulirajućim hormonom (MSH) [3]. Do danas, međutim, nisu dobijeni direktni nalazi o efektima izbjeljivanja GF1 u ljudskom epidermalnom okruženju koje se sastoji od melanocita i keratinocita u in vitro eksperimentalnom sistemu.

Interpolacijom, istovremeno smo utvrdili da u Cistanche deserticola postoji i tirozinaza, a metodom brzine oksidacije tirozinaze-dope izvršeno je istraživanje regulacije aktivnosti tirozinaze na ekstraktu feniletanoidnog glikozida u Cistanche deserticola, rezultati pokazuju da: ukupni feniletanoid glikozidi Cistanche deserticola Ekstrakt može značajno smanjiti aktivnost tirozinaze. Feniletanoid glikozid u Cistanche deserticola takođe može efikasno apsorbovati ultraljubičasto zračenje na sunčevoj svetlosti. Molekularna struktura feniletanoidnog glikozida ima više konjugiranih sistema. Nakon ultraljubičastog skeniranja, utvrđeno je da ima jaku apsorpciju između 280nm i 380nm, a maksimalna talasna dužina apsorpcije je 281nm i 333nm. , što ukazuje da feniletanoidni glikozid Cistanche deserticola ima dobar učinak apsorpcije na ultraljubičaste zrake, te može bolje spriječiti i ublažiti oštećenja kože od ultraljubičastog zračenja.

Click jing herbs cistanche ekstrakt u prahu proizvod

Slika 1. Utjecaj GF1 na sadržaj melanina i ekspresiju tirozinaze u ljudskim melanocitima. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) je tretiran sa MNT-1 ćelijama tokom 24 h, 48 h i 72 h. (A) Zatim je analiziran sadržaj melanina. (B) Analiziran je nivo ekspresije tirozinaze. Pored toga, GF1 (10, 50, 100 uM) je tretiran sa MNT-1 ćelijama stimulisanim a-MSH (500 nM) tokom 48 h i 72 h. (C) Zatim je analiziran sadržaj melanina. (D) Analiziran je nivo ekspresije tirozinaze. Tretirali smo primarne normalne ljudske epidermalne melanocite (NHEM) sa GF1 (50 mM i 100 mM) u prisustvu ili odsustvu a-MSH stimulacije tokom 48 sati. (E) Zatim je analiziran sadržaj melanina. (F) Analiziran je nivo ekspresije tirozinaze. MNT-1 ćelije su tretirane sa GF1 (50 mM i 100 mM) tokom 48 sati u medijumu kulture koji sadrži 100 mM ili 500 mM L-tirozina. (G) Zatim je analiziran sadržaj melanina. GADPH, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza; GF1, ginsenozid F1.

Ovdje smo istraživali antimelanogene efekte GF1 na ćelije kokulture MNT-1/HaCaT i trodimenzionalni (3-D) ekvivalent ljudske kože. Osim toga, fokusirali smo se na formiranje dendrita u melanocitima i prijenos melanosoma u keratinocite nakon tretmana GF1. Zajedno, naši nalazi pokazuju po prvi put da je GF1 pokazao efekte izbjeljivanja u ljudskoj epidermi koji koegzistiraju s melanocitima i keratinocitima.

Za ovu studiju, MNT-1 ćelije su uzgajane u minimalnom esencijalnom mediju (MEM) koji sadrži 20 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1 posto gentamicina i 20 mM hidroksietil piperazinetansulfonske kiseline (HEPES). HaCaT ćelije su uzgajane u Dulbecco-ovom modifikovanom orlovom medijumu (DMEM) koji sadrži 10 procenata FBS, 1 procenat gentamicina i 20 mM HEPES. Normalni humani epidermalni melanociti (NHEM) su nabavljeni iz (Lonza, Basel, Švicarska) i uzgajani su u mediju za rast melanocita-4 (MGM-4) ​​mediju. Ćelije su inkubirane na 37 C u atmosferi od 5 posto CO2.

Da bi se izmjerio sadržaj melanina, ćelije (2 105) su kultivirane u 6-ploči sa bunarima 24 h. Ćelije su tretirane naznačenim koncentracijama GF1. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS), a zatim odvojene tripsinom/EDTA. Ćelije su lizirane inkubacijom u 200 mL 1 N NaOH na 80 C tokom 2 h. Ćelijski lizati su prebačeni u ploču sa 96-jažicom, a apsorbanca je izmjerena na 405 nm.

Za izvođenje Western blottinga, ćelije su dva puta isprane hladnim PBS-om i zatim lizirane u puferu za radioimunoprecipitacijski test (RIPA) modificiranim ledom (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 posto Nonidet P-40 , 0.5 posto natrijum deoksiholata, 150 mM NaCl) koji sadrži inhibitore proteaze i koktel inhibitor fosfataze (Calbiochem, San Diego, Kalifornija, SAD). Proteini su odvojeni natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE) i prebačeni na nitrocelulozne membrane. Membrane su inkubirane sa primarnim antitijelima na 4 C tokom 24 sata, zatim isprane tris puferiranim fiziološkim rastvorom uključujući 0,1 posto Tween-20, izložene sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom 1 h na sobnoj temperaturi, isprane i zatim vizualizirane koristeći Odyssey sistem za snimanje.

Da bi se analizirao prijenos melanozoma, MNT{{0}}/HaCaT ćelije su uzgajane u 12-jažici u omjeru 1 prema 10 tokom 24 h, a zatim, GF1 tretiran je naznačenom koncentracijom. Ćelije su dva puta isprane hladnim PBS-om i fiksirane sa 3,5 posto paraformaldehida 10 minuta. Ćelije su isprane i tretirane sa 0,1% Triton X-100 tokom 10 minuta, a zatim 0,5% goveđim serumskim albuminom (BSA) tokom 1 h. Antitijela protiv proteina 1 povezanog s tirozinazom (1:200, crvena) i citokeratina-18 (1:200, zelena) korištena su za detekciju melanocita i keratinocita.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) je održiv rekonstituisan {{0}}D ekvivalent ljudske kože koji sadrži normalne melanocite i keratinocite (MatTek Corp., Ashland, MA). Koristili smo MelanoDerm TM (MEL-300-A) koji je izveden od azijskih donatora. Održavani su u novom mediju za održavanje-113 prema preporuci proizvođača. GF1 je primijenjen na MelanoDerm TM dana 0, 4, 6, 8, 11, 13 i 15. Prije tretmana GF1, tkiva su isprana sa 1 mL PBS-a da bi se uklonilo bilo kakvo zaostalo jedinjenje. Tkiva su fiksirana 18. dana za histološku analizu. Histološka procjena je obavljena pod svjetlosnim mikroskopom (Bx-41; Olympus, Tokyo, Japan), a fotomikrografije su napravljene digitalnom kamerom (DP72; Olympus). Melanoderm je fiksiran u 4-postotnom puferskom rastvoru formaldehida za bojenje. Uzorci su ugrađeni u parafinski vosak, izrezani na debljinu od 3 mm i obojeni hematoksilinom i eozinom i otopinom za bojenje Fontana i Mason. Svi podaci su izraženi kao srednje vrijednosti SD (standardne devijacije), a za statistička poređenja korišten je Studentov t-test. P-vrijednost < 0,05 smatrana je statistički značajnom (pojedinačne p-vrijednosti su date u legendama slika).

Da bismo utvrdili efekat GF1 na ljudske melanocite, tretirali smo visoko pigmentirane ćelije humanog melanoma (MNT-1) sa GF1 tokom 24, 48 i 72 h, nakon čega je uslijedila analiza intracelularnog sadržaja melanina i ekspresije proteina tirozinaze. . Kao što je prikazano na slici 1A, GF1 nije imao inhibitorni efekat na sadržaj melanina u opsegu koncentracije od 10 do 100 mM. Osim toga, ekspresija tirozinaze nije smanjena za GF1 u MNT-1 ćelijama (slika 1B, sslika 2A). Tretman a-MSH stimuliranih MNT-1 ćelija sa GF1 tokom 48 h i 72 h nije rezultirao supresijom sadržaja melanina (Slika 1C) ili ekspresije tirozinaze (Slika 1D, sSlika 2B). Da bismo dalje potvrdili efekat GF1 na ljudske melanocite, tretirali smo primarni NHEM sa GF1 u prisustvu ili odsustvu a-MSH stimulacije tokom 48 sati. Slično podacima dobijenim sa MNT-1 ćelijama, GF1 nije uticao na sadržaj melanina (slika 1E) ili ekspresiju tirozinaze (slika 1F, sslika 2C) u NHEM. Konačno, procijenili smo da li nivo L-tirozina u mediju kulture utiče na aktivnost GF1 jer je L-tirozin supstrat tirozinaze za sintezu melanina. Shodno tome, MNT-1 ćelije su tretirane sa GF1 tokom 48 sati u medijumu kulture koji sadrži 100 mM ili 500 mM L-tirozina. Kao što je prikazano na slici 1G, GF1 nije inhibirao sadržaj melanina u MNT-1 ćelijama, bez obzira na koncentraciju L-tirozina.

Slika 2. Utjecaj GF1 na formiranje dendrita i prijenos melanozoma u MNT-1/HaCaTcokultiviranim ćelijama i 3-D ekvivalentu ljudske kože. Kokultivisane MNT-1/HaCaT ćelije su tretirane sa 100 mM GF1 u prisustvu ili odsustvu a-MSH (500 nM) stimulacije tokom 48 sati. (A) Nakon fiksacije, uočili smo formiranje dendrita u melanocitima pomoću optičke mikroskopije (Scale bar; 50 mm). (B) Za imunobojenje, bojili smo melanozome TRP{11}} antitijelom (crvena boja) i keratinocite citokeratinom-18 (zelena boja). Bijele strelice pokazuju prenijeti melanosom na HaCaT iz MNT-1 ćelija (Scale bar; 20 mm). Ekvivalent ljudske kože (MelanoDerm; n=3) tretiran je sa 1 procentom kojične kiseline kao referentnim jedinjenjem za izbjeljivanje i GF1 (10 i 50 ug/ml) tokom 18 dana. (C) Nakon tretmana, snimljeni su ekvivalenti kože. (D) Izračunata je vrijednost od 6 L (stepen svjetline u poređenju sa kontrolom tretiranom vozilom) za svaki ispitni uzorak. (E) Bojenje preseka tkiva hematoksilinom i eozinom (H&E). (F) Fontana-Mason (F&M) bojenje presjeka tkiva. Stakalca su fiksirana u otopini formaldehida i stavljena u parafinski vosak za bojenje (Scale bar; 50 mm). Crne strelice pokazuju preneseni melanosom iz melanocita u bazalnom sloju na keratinocite u gornjem sloju. Plave strelice označavaju melanocite koji formiraju proširene dendrite. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, kontrola; GF1, ginsenoside F1; KA, Kojića kiselina.

Nakon nalaza da GF1 ne ispoljava antimelanogen učinak u monokulturnim ljudskim melanocitima, dalje smo analizirali da li GF1 utječe na sintezu melanina u melanocitima u eksperimentalnom sistemu koji sadrži i keratinocite i melanocite s mogućnošću komunikacije stanica-ćelija. MNT-1 i HaCaT (besmrtna ljudska normalna ćelijska linija keratinocita) ćelije su kultivirane sa 100 mM GF1 u prisustvu ili odsustvu UV-B zračenja. Nakon 48 h (sl. 3A) ili 72 h (sl. 3B), procijenili smo sadržaj melanina iz izolovanih MNT-1 i kokultiviranih ćelija. Naši podaci su pokazali da GF1 ne inhibira sintezu melanina u izolovanim MNT-1 i kokultiviranim grupama ćelija.

Pored sinteze melanina, fokusirali smo se na inhibitornu efikasnost GF1 na transfer melanosa iz melanocita u keratinocite. Konkretno, kokultivisane MNT-1/HaCaT ćelije tretirane su sa 100 mM GF1 u prisustvu ili odsustvu a-MSH stimulacije (slika 2A), nakon čega je uslijedilo ispitivanje formiranja dendrita u melanocitima, što je potrebno za prijenos melanozoma . Zanimljivo je da su rastegnuti dendriti izazvani aMSH povučeni nakon tretmana GF1. Zatim smo bojili TRP-1-pozitivne melanozome (crveno) za MNT1 ćelije i citokeratin-18 (zeleno) za HaCaT ćelije u kokulturama. Kao što je prikazano na slici 2B, TRP-1-pozitivni melanosomi u MNT-1 ćelijama su prebačeni u HaCaT ćelije nakon a-MSH stimulacije, koja je bila značajno inhibirana GF1. Ovi rezultati pokazuju da GF1 potiskuje transfer melanosoma, uzrokujući povlačenje dendrita melanocita.

Da bismo proširili ovo istraživanje na fiziološkiji sistem, ispitali smo sposobnost izbjeljivanja GF1 u ekvivalentu 3-D ljudske kože, koji je epidermalni sloj koji se sastoji od melanocita i keratinocita. Na slici 2C, tkivo tretirano GF1- izgledalo je svjetlije od kontrolnog tkiva, a L vrijednost (indeks svjetline/tamnosti) je promijenjena nakon tretmana GF1 (slika 2D). Osim toga, hematoksilinom i eozinom bojenje dijelova tkiva nije otkrilo kolaps tkiva ili toksičnost (slika 2E). Eksperimenti bojenja Fontane i Masona pokazali su da GF1 inhibira formiranje dendrita melanocita u bazalnom sloju i istovremeno potiskuje prijenos melanosa iz melanocita bazalnog sloja u keratinocite diferenciranog gornjeg sloja (slika 2F). Ovi nalazi zajedno podržavaju inhibitornu efikasnost GF1 u transferu melanosoma, što dovodi do promocije izbjeljivanja u modelu tkiva ljudske kože.

U ovoj studiji, GF1 nije inhibirao sintezu melanina i ekspresiju tirozinaze; umjesto toga, GF1 je neznatno povećao intracelularni sadržaj melanina i ekspresiju tirozinaze u MNT-1 ćelijama i kokultivisanim ćelijama (sl. 1A i 1B i ss. 3A). Međutim, istovremeno smo otkrili da GF1 inhibira prijenos melanosoma kroz smanjenu formaciju dendrita melanocita. Pretpostavljamo da bi povećani intracelularni sadržaj melanina od strane GF1 mogao biti uzrokovan akumulacijom melanozoma zbog blokade prijenosa melanozoma i indukcije ekspresije tirozinaze. Vidljiva pigmentacija kože određena je količinom disperzije melanozoma iz različitih područja proširenih dendrita melanocita do okolnih keratinocita [4]. Nekoliko jedinjenja, kao što su centaureidin i metilofiopogonanon B, pokazalo je efikasnost izbeljivanja, što je dovelo do povlačenja dendrita melanocita bez uticaja na ekspresiju melanogenog enzima ili sintezu melanina [5]. Stoga se blokada transfera melanosoma u keratinocite iz melanocita smatra efikasnim pristupom za izazivanje efekta izbjeljivanja, iako biosinteza melanina nije inhibirana. Stoga smo smatrali da povećani sadržaj melanina od strane GF1 ima mali utjecaj na efikasnost izbjeljivanja GF1. Osim toga, akumulirani melanozomi bi se razgradili autofagijom za homeostazu kože, iako je sudbina melanozoma nejasna [6].

Po prvi put smo pokazali da GF1 potiskuje formiranje dendrita izazvano a-MSH, što rezultira inhibicijom prijenosa melanosoma u keratinocite u kokulturama ljudskih stanica. Osim toga, GF1 je poremetio prijenos melanina od melanocita u bazalnom sloju do keratinocita u gornjem sloju, ispoljavajući efekat izbjeljivanja u ekvivalentu ljudske kože. Nedavni eksperimenti kokulture pokazuju da melanociti isporučuju pigment keratinocitima putem promjena dendritske morfologije, kao što je dezorganizacija mikrofilamenata b-tubulina u intracelularnom citoskeletu [7,8]. Ciklični adenozin monofosfat, induktor melanogeneze, posreduje u formiranju dendrita kroz regulaciju Rac i smanjenje aktivnosti Rho [9,10]. Stoga će se buduće studije naše grupe fokusirati na sveobuhvatnu procjenu ciljnih proteina GF1, kao što su molekuli uključeni u signalni put cikličkog adenozin monofosfata.

Naši rezultati zajedno pružaju preliminarne dokaze da GF1 ima potencijal za razvoj kao efikasan reagens za izbjeljivanje za liječenje pigmentnih poremećaja i posvjetljivanje potamnjele boje kože kao kozmetičkog sastojka.

Sukobi interesa

Svi autori koji doprinose izjavljuju da nemaju sukob interesa.

Priznanja

Ovo istraživanje je podržao i finansirao Amorepacific R&D centar.

Reference

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenozidi Rb1 i Rg1 stimulišu melanogenezu u humanim epidermalnim melanocitima putem PKA/CREB/MITF signalizacije. Evid. Na osnovu. Dopuna. Alternativni med 2014;2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Uloga interleukina 13 iz epidermalnog gd T-ćelija u efektu izbjeljivanja kože ginsenozida F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenozid F1 ublažava hiperpigmentaciju u stanicama melanoma B16F10 indukujući retrakciju dendrita i aktivirajući Rho signalizaciju. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Melanosomi se prenose iz melanocita u keratinocite kroz procese pakovanja, oslobađanja, uzimanja i disperzije. Invest Dermatol 2012;132:1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Mehanizmi koji reguliraju pigmentaciju kože: porast i pad boje tena. Int J Mol Sci 2009;10:4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Poremećaj transporta melanosa u melanocitima tretiranim teofilinom uzrokuje njihovu degradaciju autofagijom. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Utjecaj signalnog puta ovisnog o NMDA receptoru na morfologiju stanica i prijenos melanosoma u melanociti. J Dermatol Sci 2016;84:296e304.

[8] Scott G. Rac i rho: priča iza formiranja dendrita melanocita. Pigment Cell Res 2002;15:322e30

[9] Scott G, Leopardi S. cAMP signalni put ima suprotne efekte na Rac i Rho u B16F10 ćelijama: implikacije za formiranje dendrita u melanocitnim ćelijama. Pigment Cell Res 2003;16:139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. a-Melanocit stimulirajući hormon (MSH) i prostaglandin E2 (PGE2) pokreću prijenos melanosoma promovišući isporuku filopodije i izbacivanje sferoidnih granula: dokazi iz posmatranja mikroskopije atomske sile. J Dermatol Sci 2014; 76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2,*

1 Amorepacific CO Centar za istraživanje i razvoj, Yongin-si, Republika Koreja

2Odsjek za inženjersku hemiju, Nacionalni univerzitet Chungbuk, Cheongju-si, Chungbuk, Republika Koreja

3Odsjek za ljepotu i kozmetičke nauke, Fakultet zdravstvenih nauka, Univerzitet Eulji, Seongnam-si, Republika Koreja

For more information:1950477648nn@gmail.com