Kakav je efekat Cistanche Tubulosa, Efekti vodenog ekstrakta Cistanche Tubulosa na mikrobiotu crijeva miševa s crijevnim poremećajima

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više

Poremećaji mikrobiote crijevapovezuju se sa mnogim bolestima. *Izvještava se da vodeni ekstrakt iz Cistanche tubulosa (CT), tradicionalne kineske biljne formule, igra ulogu u zaštiti ljudskog crijeva. Međutim, malo se zna o njegovom učinku na mikrobiotu crijeva. *Sadašnja studija je provedena kako bi se utvrdilo može li CT vodeni ekstrakt modulirati crijevni mikrobiom kod miševa s crijevnim poremećajima. Otkrili smo da se oštećena crijevna morfologija koja je rezultat liječenja cefiksimom može spasiti korištenjem CT vodenog ekstrakta. *Upoređivanje mikrobne raznolikosti između miševa tretiranih CT ekstraktom i kontrolnih miševa također je pokazalo da se poremećaj u zajednici mikrobioma modelskih grupa može obnoviti tretmanom visokim i srednjim koncentracijama vodenog ekstrakta. Liječenje cefiksimom dovelo je do značajnog smanjenja mliječne kiselinekisele bakterije; međutim, suplementacija CT vodenog ekstrakta oporavila je rast ovih bakterija mliječne kiseline. Nadalje, CT vodeni ekstrakt uspio je ublažiti dramatične promjene u metaboličkim putevima crijevnog mikrobioma izazvane cefiksimom. *Ovi nalazi su pružili uvid u blagotvorne efekte CT vodenog ekstrakta na mikrobiotu crijeva, a također su pružili važnu referencu za razvoj srodnih lijekova u budućnosti.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod

Crijevni mikroorganizmi uglavnom koloniziraju crijevni lumen i mukozni sloj i međusobno se povezuju s domaćinom kroz razmjenu materijala i energije, transformaciju i druge procese [1]. *Oni su signalna čvorišta koja integrišu poruke iz životne sredine, kao što je ishrana, sa genetskim i imunološkim signalima, što posljedično utiče na metabolizam domaćina, imunitet, nervni sistem i odgovor na infekcije [2]. Normalno, postoji dinamička ravnoteža između crijevne flore i domaćina; međutim, crijevna disbioza može rezultirati promjenama u ravnoteži zdravlja/bolesti, imunološkim poremećajima i mnoštvom bolesti [3]. Umjerene promjene u crijevnoj mikrobioti su prihvatljive za domaćina; međutim, ovo još uvijek može pružiti prilike za pojačavanje promjena u drugim otežavajućim faktorima, kao što su bakteriofagi, bakteriocini i oksidativni stres [4]. Prethodne studije su pokazale da etanolni ekstrakt Cistanche tubulosa (CT), tradicionalne kineske biljne formule, može regulirati mikrobiološki sastav crijeva kod pacova [5], a ukupni glikozidi CT-a su prilagodili poremećenu mikrobiotu crijeva [6]. Vrste Cistanche, koje uglavnom parazitiraju na korijenu vrste Tamarix, nazivaju se i "pustinjski ginseng" i tonik koji se sastoji od stabljikaCistanchedeserticola(CD) iCistanche tubulosa(CT) se koristi kao anbiljni lijek[7]. *e glavne hemijske komponente CTfeniletanol glikozidi(PHG), koje su antioksidativne supstance [8, 9], utvrđeno je da poboljšavaju reproduktivnu disfunkciju [10], potiskuju aktivaciju jetrenih zvezdastih ćelija, blokiraju provođenje signalnih puteva u TGF- 1/SMAD [11], i spriječiti fibrozu jetre izazvanu albuminom u goveđem serumu kod pacova [12]. Među više od 100 komponenti u CT, polisaharid je također jedna od važnih supstanci sa obilnim sadržajem [13, 14]. Prethodne studije su pokazale da polisaharidi C. deserticola induciraju melanogenezu u melanocitima, smanjuju oksidativni stres[15], ublažavaju kognitivnu disfunkciju regulacijom antioksidativnih i protuupalnih procesa kod štakora [16], štite PC12 stanice od OGD/RP-induciranih [17] u , pojačavaju apsorpciju ehinakozida in vivo i utiču na mikrobiotu crijeva [18]. Probiotici su živi nepatogeni mikroorganizmi koji imaju zdravstvene prednosti i daju mikrobnu ravnotežu u gastrointestinalnom traktu kada se daju u adekvatnim količinama [19]. * mogu poboljšati nespecifične ćelijske imune odgovore karakterizirane aktivacijom makrofaga, prirodnih stanica ubica (NK) i antigen-specifičnih citotoksičnih T limfocita i oslobađanjem različitih citokina na soj-specifičan način i način ovisan o dozi [20]. Probiotički sojevi poboljšavaju svojstva intestinalnog epitela putem TJ modulacije, a pokazalo se da specifični probiotički sojevi regulišu ekspresiju mucina, čime utiču na svojstva sluznog sloja i indirektno regulišu imunološki sistem crijeva [21]. Sojevi bakterija mliječne kiseline (LAB) i Bifidobacterium su glavni probiotici koji se koriste u mnogim područjima [22-26]. *Njihove zdravstvene prednosti su brojne, a njihov antioksidativni kapacitet je važan faktor u njihovim zdravstvenim funkcijama[27]. Probiotici mogu kelirati metalne ione kako bi spriječili da kataliziraju oksidaciju [28, 29]; oni također mogu povećati ekspresiju antioksidativnih enzima [30, 31], proizvoditi različite metabolite s antioksidativnim djelovanjem [32, 33], posredovati antioksidativnim signalnim putevima [34-36] i regulirati enzime koji proizvode reaktivne vrste kisika (ROS) i odgovor crijevnih mikroorganizama na oksidativni stres[37]. Nedavna studija je pokazala da polisaharidi CD-a mogu stimulirati rast nekih bakterija mliječne kiseline, što bi moglo biti od koristi za ljudsko zdravlje [38]. Međutim, sadržaj polisaharida u CD-u je drugačiji od onog u CT [7, 39] i ta razlika može dovesti do različitih efekata na crijevne mikroorganizme. Nadalje, iako CD polisaharidi mogu smanjiti oksidativni stres aktivacijom NRF2/HO{40}} puta [15], efekti jednog polisaharida mogu se razlikovati od ukupnog efekta višestrukih kompozicija u CT. *nas, potrebno je precizno definirati djelovanje CT vodenih ekstrakata na crijevne mikroorganizme. Osim toga, obožavatelji se također mogu oduprijeti oksidativnom stresu [40] i potisnuti upalne odgovore posredovane lipopolisakom aktiviranjem Keap1/Nrf2/HO-1 puta [41]. *prije je određivanje efekta CT vodenog ekstrakta od velike vrijednosti. Osim toga, učinci određenih sastojaka vodenog CD ekstrakta na oksidativni stres i crijevnu floru sugeriraju da bi otpornost na oksidativni stres mogla biti u korelaciji s promjenama crijevne flore. Kako bismo popunili praznine u znanju o gore navedenim temama, istražili smo Učinci vodenog ekstrakta na mikrobiotu crijeva miševa s poremećajima crijevne flore. *Ovi rezultati će pružiti vrijedne informacije o mogućim mehanizmima putem kojih se mijenja crijevna flora i daje crijevna otpornost na oksidativni stres.https://www.xjcistanche.com/news/what-s-the-effect-of-cistanche-tubulosa-effec-54312367.html

2. Materijali i metode

davao se dnevno u 12:00 h, a druge supstance su davane dnevno u 15:00 h. Tokom eksperimenata, grupe C, D, E i F držane su u modelnom stanju crijevnih poremećaja. *Izmet je sakupljan svakih sedam dana na sterilnom operabilnom stolu i čuvan na -20 stepeni .2.4. Histopatološko promatranje debelog crijeva miševa. Na kraju eksperimenta, miševi su ubijeni cervikalnom dislokacijom, a njihov sadržaj debelog crijeva je sakupljen na sterilnom operabilnom stolu i pohranjen na -80 stepeni; u isto vrijeme, uzorci tkiva debelog crijeva su fiksirani u 10 posto neutralnom formalinu.*en, uzorci su dehidrirani korištenjem gradijentne koncentracije etanola, hijalinizirani korištenjem ksilena, ugrađeni u parafin, izrezani i obojeni hematoksilin-eozinom. Optičkim mikroskopom uočene su i upoređene morfološke promjene na sluznici debelog crijeva. Izmjerena je dužina resica i dubina kripte u debelom crijevu i izračunat je omjer dužine resica i dubine kripte (V/C vrijednost) (51).2.5. Ekstrakcija DNK i izgradnja biblioteke. DNK je ekstrahovan iz fecesa pomoću EZNA ®Soil DNK kompleta (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, SAD) prema protokolu proizvođača. Kvalitet DNK je određen pomoću fluorometra (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, USA). Upareni prajmeri u V3-V4 regionu 16s rDNK dizajnirani su da amplificiraju regiju i proizvode 466 bp DNK fragmenata. *prednji prajmer je bio 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-), a obrnuti prajmer je bio 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Svaki PCR volumen je bio 25 μL, sadržavao je 2,5 μL 10 × PCR pufera, 2 μL dNTP, 1 μL svakog prajmera i 20-30 ng šablonske DNK. *en, indeksirani adapteri su pričvršćeni na kraj amplikona za generiranje biblioteka sekvenciranja. *biblioteke su validirane pomoću QuantiFluor™ fluorometra i kvantificirane na 10 nmol.2.6. Sekvenciranje gena 16s rRNA i analiza mikrobne zajednice. *e Illumina platforma (Illumina MiSeq) je korištena za dobivanje 2 × 250 bp podataka uparenog kraja. Operativne taksonomske jedinice (OTU) su dobijene korištenjem softvera Uparse kroz standardno grupiranje sa 97 posto sličnosti. *Naivni Bayesian algoritam dodjeljivanja RDP klasifikatora korišten je za usklađivanje OTU-a sa Greengene bazom podataka izdanje 13.5 i izvođenje komentara vrsta. *e alfa raznolikost crijevne mikrobiote izračunata je korištenjem Shannon i Simpson indeksa, a razlike između grupa analizirane su linearnom diskriminantnom analizom Effect Size (LEfSe). *e beta raznolikost je analizirana analizom glavnih koordinata (PCoA) Brady-Curtis razlika. PICRUSt2 je korišten za procjenu mikrobnog metaboličkog kapaciteta crijevnog mikrobioma [42].2.7. Statistička analiza podataka. SPSS 20 je korišten za jednosmjernu ANOVA-u, a eksperimentalni podaci su izraženi kao X ± S; X označava prosječnu vrijednost, a S označava standardnu ​​devijaciju.

3. Rezultati

3.1. 8e Utjecaj CT vodenog ekstrakta na morfologiju debelog crijeva.*e reprezentativna jedinjenja (ehinakozid i acetonid) i njihove koncentracije CT ekstrakta validirane su HPLC (slika S1). Da bismo utvrdili učinak vodenog ekstrakta na crijeva, istražili smo dužinu resica debelog crijeva i dubinu udubljenja nakon tretmana vodenim ekstraktom. *resice debelog crijeva u normalnim i grupama s visokim dozama (A, B i D) bile su duže i slične prstima, dok su resice debelog crijeva u grupama modela i niske doze (C i F) bile kratke, a vrhovi resice debelog crijeva su slomljene (Slika 1). Shodno tome, visoka doza CT vodenog ekstrakta značajno je povećala dužinu resica debelog crijeva i smanjila dubinu udubljenja kod miševa sa crijevnim poremećajima u poređenju s miševima u grupi modela (P < 0.01).="" nasuprot="" tome,="" dubina="" udubljenja="" nije="" se="" značajno="" razlikovala="" između="" grupe="" sa="" visokom="" dozom="" i="" normalne="" grupe="" (p=""> 0,05) (Tabela S1). *Ovi rezultati su pokazali da visoka doza CT vodenog ekstrakta može poboljšati morfologiju unutar debelog crijeva miševa sa crijevnim poremećajima.3.2. 8e Utjecaj CT vodenog ekstrakta na raznolikost crijevne mikrobiote. Izvršili smo sekvenciranje gena 16s rRNA da bismo istražili potencijalni uzrok morfoloških promjena unutar debelog crijeva i istražili promjene u mikrobioti crijeva nakon tretmana CT vodenim ekstraktom. Prosjek od 100.553 efektivne oznake, u rasponu od 77.734 do 125.144, dobijen je iz sirovih podataka (Tabela S2). *stagovi su grupirani u 4932 OTU-a (Tablica S3). Zatim smo analizirali raznolikost crijevne mikrobiote na osnovu Tezeja. *e Shannon i Simpson indeksi nisu pokazali razliku između A grupe (normalno sa CT vodenim ekstraktom) i B grupe (normalno bez CT vodenog ekstrakta) (Slika 2(a)). *naznačeno je da kod miševa bez tretmana cefiksimom, CT vodeni ekstrakt možda nije imao dodatne korisne ili štetne učinke na -raznovrsnost crijevne mikrobiote. Međutim, -raznolikost u grupi modela (C) pokazala je opadajući trend u odnosu na onu u normalnim grupama. *miševi tretirani visokim i srednjim dozama CT vodenog ekstrakta pokazali su znakove oporavka diverziteta, dok takav fenomen nije uočen kod miševa tretiranih niskom dozom CT vodenog ekstrakta (Slika 2(a)). U međuvremenu, PCoA je otkrio da normalne grupe (A i B) i grupe s crijevnim poremećajima kojima su primijenjene visoke doze (D) i srednje doze (E) CTaqueous ekstrakti imaju tendenciju da imaju kraće udaljenosti između uzoraka od onih u grupi modela i u grupi s niskim dozama. -doza CTaqueous ekstrakt grupe dodataka (F) (Slika 2(b)). *rezultati su pokazali da CT vodeni ekstrakt može pomoći u poboljšanju raznolikosti crijevne mikrobiote kod miševa s crijevnim poremećajima.3.3. Promjene u sastavu crijevne mikrobiote tretirane CT vodenim ekstraktom. *profili sastava mikrobiote upoređeni su među različitim grupama. Na nivou tipa, relativna brojnost Proteobacteria u modelnoj grupi bila je veća nego u ostalim grupama.https://www.xjcistanche.com/news/protective-effects-of-taxifolin-on-pazopanib-i-54206149.html

(Slika 3(a)). * Povećanje proteobakterije sugerira da je mikrobiom modelnih miševa promijenjen cefiksimom i da bi CT vodeni ekstrakt mogao imati koristi za crijevnu mikrobiotu jer je povećana prevalencija proteobakterija glavni marker poremećene crijevne flore [43–45]. Pored toga, na nivou roda, relativna brojnost Lactobacillusa u grupi modela smanjena je u poređenju sa onim u normalnim i grupama sa visokim dozama; međutim, povećao se u poređenju sa onim u grupi sa srednjom i niskom dozom (Slika 3(b)). *Ovi rezultati su pokazali da visoka doza CTaqueous ekstrakta može potaknuti rast nekih bakterija iz roda Lactobacillus. Diferencijalna mikrobiota između ispitivanih grupa dalje je određena prema LEfSe analizi. *analiza je pokazala da je nakon tretmana cefiksimom značajno povećana relativna zastupljenost Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales i Chloroflflexi, dok je relativna zastupljenost lactobacillusa, Eubacterium{8}{9} Grupe Pseudono cardiales i Christensenellaceae_R-7_ značajno su smanjene u poređenju sa onima u normalnoj grupi (Slika 4(a)). Zapanjujuće je da kada je grupa modela dopunjena visokim dozama CT vodenog ekstrakta, relativna zastupljenost Muribaculaceae, Lactobacillus, Kin eosporiaceae, Eubacterium no datum grupe i Pedobacter je značajno povećana u poređenju sa onima u modelnoj grupi. U međuvremenu, relativna zastupljenost Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 i Candidatus Stoquefifichus značajno se smanjila u poređenju sa onima u grupi modela (Slika 4(b)).

3.4. Funkcije crijevne mikrobiote povezane s liječenjem CT vodenim ekstraktom. Koristili smo softver PICRUSt2 za predviđanje metaboličkih puteva crijevne mikrobiote, a normalna grupa je korištena kao referenca za analizu promjena u drugim grupama. Pod tretmanom cefiksimom, povećana je relativna količina degradacije etilbenzena, biosinteza neribozomalnih peptida grupe siderofora i metabolizam ksenobiotika putem citokroma P450; nakon tretmana visokim i srednjim dozama vodenih ekstrakata, njihova relativna zastupljenost se vratila na normalne nivoe. U međuvremenu, relativna količina metabolizma cijanoaminokiselina smanjila se pod tretmanom cefiksimom; međutim, povećao se nakon tretmana sa visokom dozom CT vodenog ekstrakta. Nadalje, općenito, promjene u različitim putevima metabolita nakon tretmana cefiksimom bile su značajne u poređenju sa onima u normalnoj grupi; međutim, dodavanje vodenog ekstrakta bilo je u stanju spriječiti pretjerane promjene (Slika 5).

4. Diskusija

grupe su dominantne u ljudskim crijevima; Utvrđeno je da je omjer Bacteroidetes/Firmicutes smanjen kod gojaznih ljudi u poređenju sa onim kod mršavih ljudi, a utvrđeno je da se ovaj omjer povećava s gubitkom težine kod ljudi na dvije vrste niskokalorične dijete [38, 41, 43–45, 48 , 53, 54]. U međuvremenu, Turicibacter, koji je povezan sa gojaznošću [55], bio je značajno povišen u grupi modela u poređenju sa onim u drugim grupama. Značajno je da je raznolikost crijevne mikrobiote kod modelnih miševa poboljšana dodatkom vodenog ekstrakta. Zabilježili smo neke specifične crijevne bakterije kod miševa pod različitim tretmanima; na primjer, Lactobacillus i Muribaculaceae su bili dva glavna bakterijska roda koji su se povećali u grupi tretiranoj visokim dozama vodenog ekstrakta u poređenju sa onima u modelnoj grupi (Slika 4). Nedavne studije su pokazale da polisaharidi CT vodenih ekstrakata posjeduju značajne antioksidativne aktivnosti in vitro [56] i mogu promovirati rast nekih bakterija mliječne kiseline, što bi moglo biti od koristi za zdravlje domaćina [43]. Paralelno, Muribaculaceae su probiotički organizmi povezani sa dugovječnosti [57]. *ese je sugerirao da mehanizam kojim CT vodeni ekstrakt poboljšava mikrobiotu crijeva može biti promocija ili zaštita rasta probiotskih organizama. Još jedna bakterija vrijedna pažnje bila je bakterija YE57. Iako je visoka doza CTaqueous ekstrakta promovirala relativnu brojnost bakterije YE57 u ovoj studiji (Slika 4), prethodne studije su otkrile da je njena zastupljenost veća u normalnom crijevu nego u crijevima tretiranim ostatkom biljnog čaja visoke koncentracije [ 58] i da je njegova brojnost smanjena nakon intervencije s Bacillus licheniformis u kombinaciji s XOS (ksilooligosaharidima) [59]. *nas, uloga ove bakterije u crijevnoj mikrobioti zaslužuje dalje proučavanje. Osim toga, relativno mali broj uzoraka u ovoj studiji može uzrokovati mjeru lažno pozitivnih i lažno negativnih, a buduća studija na većim uzorcima sugerira se kako bi se potvrdili identificirani bakterijski markeri.

Sastav CT vodenog ekstrakta mogao bi biti važan zbog njegovih učinaka na sastav i funkcionalne promjene u mikrobioti crijeva miševa s crijevnim poremećajima. PSG su uobičajene aktivne komponente pronađene u CD i CT, a ehinakozid je identificiran kao glavni PNG u [60]. Posljednjih desetljeća pokazalo se da ehinakozid posjeduje mnoge farmakološke aktivnosti, kao što su antiaging i neuroprotektivni efekti, poboljšanje srčane funkcije, smanjenje hiperlipidemije i hiperglikemije, te prevencija dijabetesa i metaboličkog sindroma uzrokovanog pretilošću [53, 61–65]. . U stvari, otkrili smo promjene u metaboličkim putevima crijevne mikrobiote.* Tretman cefiksimom doveo je do obogaćivanja bakterija vezanih za razgradnju etilbenzena i biosintezu neribozomalnih peptida grupe siderofora, dok su tretmani visokim i srednjim dozama CT-a vodeni ekstrakt mogao bi ublažiti ove promjene, što ukazuje da je ovaj ekstrakt umanjio bakterijsku zajednicu koja je povezana s ovim funkcijama. Osim toga, povećano obogaćivanje bakterijama povezano s putem metabolizma cijanoaminokiselina pod tretmanom s visokim dozama vodenog ekstrakta i njegovo smanjeno obogaćivanje kod modelnih miševa ukazuju na to da CT vodeni ekstrakt može promovirati metabolizam cijanoaminokiseline. *Promjene relevantnih metabolita mogu ovom vodenom ekstraktu pružiti farmakološke aktivnosti.

Iako je mehanizam kojim CT vodeni ekstrakt mijenja sastav i funkciju crijevne mikrobiote složen, postoje neki tragovi za spekulaciju o potencijalnom mehanizmu. Prijavljeno je da i bakterije mliječne kiseline i CT vodeni ekstrakti mogu antagonizirati oksidativni stres. Oksidativni stres koji se javlja tijekom upale je čest faktor koji pogoršava crijevne poremećaje snažnim smanjenjem mikrobne raznolikosti crijeva i promicanjem porasta specifičnih bakterija (4). Naprotiv, reaktivne vrste kisika također pospješuju selektivni rast bakterijskih grupa putem nitratnog i tetracionatnog disanja [66–68]; na primjer, bakterije iz familije Enterobacteriaceae mogu brzo rasti kao posljedica promjena u sastavu crijevne flore u oksidativnim uvjetima tokom upale [69, 70]. Većina živih organizama razvija enzimsku odbranu, neenzimsku antioksidativnu odbranu i mehanizme popravke kako bi uklonili radikale kisika [71].

Međutim, ovi prirodni antioksidativni sistemi općenito nisu dovoljni da spriječe oksidativna oštećenja u živim organizmima. Nekoliko dodatnih sintetičkih antioksidansa, uključujući butilirani hidroksianizol i butilirani hidroksitoluen, široko se koristi za smanjenje oksidacije, ali je njihova sigurnost dovedena u pitanje [72, 73]. *prije su se istraživači okrenuli pronalaženju sigurnijih i prirodnijih antioksidansa dobivenih iz prirodnih supstanci. Zbog sposobnosti polisaharida i bakterija mliječne kiseline da eliminiraju oksidativni stres, određivanje preciznog antioksidativnog mehanizma CT vodenih ekstrakata na crijevnu mikrobiotu zahtijeva daljnja istraživanja u budućnosti.

U zakljucku,otkrili smo da je CT vodeni ekstrakt mogao poboljšati crijevnu mikrobiotu kod miševa s crijevnim poremećajima promicanjem raznolikosti, moderiranjem metaboličkih promjena i remodeliranjem strukture crijevne mikrobiote, a ovi rezultati mogu pružiti referencu za razvoj srodnih lijekova u budućnost. Dostupnost podataka*e statistike operativnih taksonomskih jedinica među podacima svakog uzorka koji se koriste da podrže nalaze ove studije uključeni su u dopunske informativne datoteke, a podaci o sekvenciranju 16s rRNA koji se koriste da podrže nalaze ove studije biće objavljeni po objavljivanju. Sukob interesa* Autori izjavljuju da nemaju sukoba interesa. Zahvala* je studija finansijski podržana grantovima Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (81860766). Dodatni materijali Slika S1: HPLC detekcija vodenog ekstrakta Cistanche tubulosa. (a) *Pak ehinakozida i akteozida u referentnom materijalu pojavljuje se na 5,066 min i 9,988 min odvojeno. (b) *Pak ehinakozida i acetonida u vodenom ekstraktu pojavljuje se na 5,097 min i 10,076 min odvojeno, a koncentracije su 236 mg/g i 12,7 mg/ odvojeno. Tabela S1: dužina resica debelog crijeva i dubina udubljenja. Tabela S2: Statističke informacije podataka sekvenciranja 16S rRNA. Tabela S3: statistika operativnih taksonomskih jedinica za svaki uzorak. (dodatni materijal)

Članak dolazi iz Hindawi sveske komplementarne i alternativne medicine zasnovane na dokazima 2021, ID članka 4936970, 11 stranica https://doi.org/10.1155/2021/4936970