Cistanche za liječenje upale i bolesti bubrega: Koji je uzrok patogene uloge upale u zahvaćenosti bubrega kod cistinopatije?
Mar 13, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
Interakcija između galektina-3 i cistinozina otkriva patogenu ulogu upale u zahvaćenosti bubrega cistinozom
Tatiana Lobry1,2 et al
Upalauključen je u patogenezu mnogih poremećaja. Međutim, osnovni mehanizmi su često nepoznati. Evo, testiramo da licistinoza, protein uključen ucistinoza, je kritični regulator galektina-3, član porodice proteina koji vezuje b-galaktozidazu, tokomupala. Cistinozaje lizosomski poremećaj skladištenja i, uprkos sveprisutnoj ekspresiji cistinoze,bubregje primarni organ pogođen bolešću.Cistinozautvrđeno je da poboljšava lokalizaciju lizosoma i degradaciju galektina-3. U Ctns–/–miševi, mišji modelcistinoza, galektin-3 je prekomjerno izražen ububreg. Odsustvo galektina-3 kod cistinotičnih miševa poboljšava patološku funkciju i strukturu bubrega i smanjuje infiltraciju makrofaga/monocita u bubrezima Ctns-a–/–Gal3–/–miševi u poređenju sa Ctns–/– miševi. Ovi podaci snažno sugeriraju da galektin-3 posredujeupalauključeni ububregprogresija bolesti u cistinozi. Nadalje, otkriveno je da galektin-3 stupa u interakciju s proinflamatornim citokinom MonociteChemoattractant Protein-1, koji stimulira regrutaciju monocita/makrofaga, a pokazalo se da je značajno povećan u serumu Ctns–/– miševa kao i pacijenti sacistinoza. Stoga, naši nalazi ističu novu ulogu cistinoze i interakcije galektina-3 u upali i pružaju dodatno mehaničko objašnjenje zabubregbolest cistinoze. To može dovesti do identifikacije novih ciljeva za lijekove za odlaganjecistinozaprogresija.
KLJUČNE RIJEČI:hronična bolest bubrega; cistinoza; galektin-3;upala; monocitni hemoatraktantni protein–1
cistanche može liječiti hroničnu bolest bubrega i cistinozu
Osnovni uzrok upale je taj što dušikov oksid može dovesti do stvaranja upalnih stanica.Cistancheje vrijedan kineski biljni lijek. Njegovi aktivni sastojci mogu inhibirati lučenje dušikovog oksida i igrati ulogu u prevenciji i liječenju upala i bolesti bubrega.
Translational Statement
Uprkos liječenju, pacijenti i dalje napreduju do završnog stadijuma zatajenja bubrega. U ovoj studiji smo pokazali da odsustvocistinozadovodi do poremećene lizozomske degradacije galektina-3 (Gal-3), što dovodi doupalai napredovanjehronična bolest bubregaincistinoza. Ovi nalazi otvaraju nove perspektive o potencijalnim terapijskim ciljevima koji bi mogli ograničiti ili odgoditi degeneraciju bubrega kod pacijenata sacistinoza. Kao takvi, antiinflamatorni lijekovi i inhibitori Gal-3 kao što su nesteroidni protuupalni lijekovi ili indometacin mogu poboljšati bubrežnu patogenezu kod cistinoze.
Upalaje normalan akutni odgovor organizma na ozljedu ili infekciju,1ali hroničnoupalapovezana je sa oštećenjem tkiva. U slučaju hroničnih bolesti, kao što je dijabetes, oštećena tkiva aktiviraju imunološki sistem, što dovodi do kontinuiranog upalnog odgovora i, na kraju, degeneracije tkiva.2 Citokini su ključni modulatoriupalai sposobni su za aktiviranje ili rješavanjeupalaprocesa.3 Kod pacijenata sahronična bolest bubrega(CKD), povišene koncentracije citokina u plazmi (interleukina [IL]-6 i faktora tumorske nekroze-a) iupalamarkeri (C-reaktivni protein, IL-6, hijaluronan i neopterin) povezani su s progresijom do završnog stadijuma bubrežne bolesti.4 Razumijevanje specifičnih medijatora koji pokreću inflamatorne odgovore olakšava otkrivanje odgovarajućih meta lijekova za sprječavanje degenerativnog oštećenja .
Cistinozaje autosomno-recesivna metabolička bolest koja pripada porodici poremećaja lizosomskog skladištenja i karakterizira je nakupljanje cistina u svim organima.5 Gen defektan ucistinoza, CTNS, kodira lizozomalni cistin/proton ko-transporter, cistinozu.6,7 Iako je CTNS sveprisutno izražen,bubregje prvi zahvaćen organ kod osoba sacistinoza. Pacijenti se obično javljaju u prvoj godini života s Fanconijevim sindromom, koji karakteriziraju teški poremećaji tekućine i elektrolita, loš rast i rahitis.8Nakon toga se razvija CKD, koji napreduje u završnu bubrežnu bolest i zahtijevabubregtransplantacija. Akumulacija cistina u svim tkivima na kraju dovodi do multiorganske disfunkcije; pacijenti doživljavaju fotofobiju i sljepoću, hipotireozu, hipogonadizam, dijabetes, miopatiju i propadanje centralnog nervnog sistema.9 U pozadini C57BL/6, nokaut model miša (Ctns–/–) 10 replicira fenotip bubrega cistinotičnih pacijenata,11 kao i taloženje kristala cistina u rožnjači12i disfunkcija štitne žlijezde.13
U ovoj studiji otkrivamo novu ulogu zacistinozainupalakroz interakciju sa Gal-3. Gal-3 je član porodice lektina i proteina koji vezuju b-galaktozide 21 i uključen je u više bioloških funkcija, uključujućiupala.22U kontekstububregbolesti, pokazalo se da inhibicija Gal-3 smanjuje ekspresiju proinflamatornih markera i renalnu fibrozu i sprječava pad brzine glomerularne filtracije kod modela hiperaldosteronizma, hipertenzije ili gojaznosti.23–26Ovdje pružamo dokaze da, ucistinoza, odsustvocistinozadovodi do prekomjerne ekspresije Gal-3 ububrezi, pojačavajući infiltraciju makrofaga i napredovanje CKD. Osim toga, identificirali smo monocitni kemoatraktantni protein-1 (MCP-1) kao potencijalnog posrednika, otkrivajući nove genske mete za terapiju lijekovima. REZULTATI Gal-3 stupa u interakciju sa cistinozom preko domene prepoznavanja ugljikohidrata kako bi identificirala specifičnu interakciju partneri koji koriste kvantitativnu masenu spektrometriju, Madin-Darby caninebubreg(MDCK) ćelije su transducirane lentivirusnim konstruktom da stabilno eksprimiraju cistinozno-zeleni fluorescentni protein (GFP) fuzioni protein. Pored 9 podjedinica vakuolarnog tipa Hþ adenozin trifosfataze objavljenih ranije,19Gal-3 je identificiran kao jedan od proteina s kojima je u interakcijicistinoza(Slika 1a). Ova interakcija je dalje potvrđena ko-imunoprecipitacijom praćenom Western blotingom (Slike 1b i c). Osim toga, pokazali smo interakciju između Gal-3 icistinozabio je posredovan Gal-3 domenom prepoznavanja ugljikohidrata (CRD) lokaliziranom u C-terminalnom repu proteina. Interakciju je inhibirao tiodigalaktozid, snažan inhibitor interakcija galektin-ugljikohidrata (slika 1d). Kao i svi galektini, Gal-3 ima afinitet prema glikozilovanim proteinima,21 tako da je vjerovatno da se interakcija sa Gal-3 odvija kroz cistinozni glikoziliran dio koji se nalazi u intralizozomalnom N-terminalnom repu proteina.27
Cistinozin poboljšava lokalizaciju i degradaciju Gal-3 lizosoma
Za provjeru potencijalne lizozomske lokalizacije Gal-3 prilikom interakcije sacistinoza, pokazali smo da je Gal-3, kao i katepsin D (intralizosomalna proteaza), bio zaštićen od probave proteinazom K, dok su oba proteina probavljena kada su lizozomi permeabilizirani Tritonom X- 100 (Slika 2a i Dodatni Slika S1). Slični podaci su dobijeni u lizozomima izolovanim iz jetre miša, potvrđujući lizozomalnu lokalizaciju Gal-3 in vivo (Slike 2b i c). Zbog odsustva pouzdanog antitijela za otkrivanjecistinoza, izvršeno je imunološko bojenjecistinoza-GFP–ćelijske linije koje eksprimiraju MDCK sa anti-Gal-3 antitijelom. On je potvrdio prisustvo Gal-3 u lumenu lizosoma, dok su cistinoza-GFP i Lamp-2 (lizozomalni transmembranski protein) pronađeni samo na membrani vezikula (slika 2d).
Da istraži akocistinozinbio uključen u trgovinu Gal-3, analizirali smo dinamiku obacistinozai Gal-3–pozitivne vezikule koristeći FL fluorescentnu mikroskopiju ukupne unutrašnje refleksije u dvije boje u živim ćelijama u mišjim embrionalnim fibroblastima (MEF) iz divljeg tipa (WT) i Ctns–/–miševi koji eksprimiraju i CTNS-DsRed i Gal-3-GFP. Naša analiza je to potvrdilacistinozai Gal-3 se podvrgavaju istinskoj kolokalizaciji u Ctns–/– MEF-ovima, što je potvrđeno sličnom prostorno-vremenskom distribucijom ovih molekula u zoni fluorescentne mikroskopije ukupne unutrašnje refleksije FL (Slika 2e). Podaci u WT MEF-ovima bili su slični (podaci nisu prikazani). Štaviše, kada su analizirani MEF-ovi transficirani samo sa Gal- 3–GFP, Gal-3–GFP je pronađen u citoplazmi i nije uočena nikakva izrazita vezikularna struktura, za razliku od ko-transfekcije sa CTNS-DsRed ( podaci nisu prikazani).
Ovi podaci su potvrđeni u 293T ćelijama, kod kojih je uočen jak GFP signal u citoplazmi u ćelijama koje eksprimiraju samo Gal-3–GFP, dok u ćelijama koje eksprimiraju i Gal-3–GFP icistinozin-DsRed, Gal-3–GFP je uglavnom bio lokaliziran unutar lizozoma koji eksprimiraju cistinozu-DsRed (Slika 3a). Štaviše, kvantifikacija ekspresije Gal-3 proteina u ćelijama transficiranim samo sa Gal-3–GFP ili Gal- 3–GFP i CTNS-DsRed, i Gal-3–GFP i DsRed kao kontrola, pokazala je značajno manje Gal-3-GFP proteina u ćelijama ko-transficiranim sa CTNS-DsRed u poređenju sa ćelijama transficiranim sa Gal-3-GFP samim ili ko-transficiranim sa DsRed (Slika 3b). Sve u svemu, ovi rezultati ukazuju na tocistinozinpoboljšava lizozomsku lokalizaciju i degradaciju Gal-3. Pokazalo se da je cistinozin uključen u CMA.28 Protein toplotnog šoka od 70 kDa (Hsc70) učestvuje u CMA tako što pomaže odvijanje i translokaciju supstratnih proteina preko membrane u lizozomski lumen na način koji zavisi od LAMP2A.29,30 Zbog Gal{ Predloženo je da se {8}} degradira od strane CMA,31 mi smo istražili lokalizaciju Gal-3 u odnosu na Hsc70 u cistinotičkim MEF-ovima. Konfokalna mikroskopska analiza potvrdila je kolokalizaciju Gal-3–GFP na Hsc70- pozitivnih struktura u WT (podaci nisu prikazani) i Ctns–/–ćelije (Slika 3c), podržavajući ko-transport Gal-3 sa Hsc70 i sugerirajući da je lizozomska internalizacija, ali ne i prepoznavanje Gal-3 od strane pratioca, defektno ucistinoza.
Gal-3 je uključen u upalu bubrega u Ctns–/–miševi
Proučiti ulogu Gal-3 ucistinozain vivo, generisali smo model miša sa dvostrukim nokautiranjem koji ima nedostatak u obacistinozini Gal-3 (Ctns–/–Gal-3–/–miševi). WT, Ctns–/–, i Gal-3–/–miševi su korišteni kao kontrolni subjekti. U C57BL/6 Ctns–/–kod miševa, bubrežne anomalije se javljaju oko 10 mjeseci starosti.11 Stoga su istraživanja rađena u dobi od 8 do 9 mjeseci, kadabubreganomalije počinju da se otkrivaju, a sa 12 do 15 meseci kada bubrežne anomalije napreduju. Budući da je utvrđeno da je sadržaj cistina različit kod muškaraca i žena Ctns–/– bubrezi, analizirani su zasebno. Ako se sadržaj cistina povećava s godinama u oba genotipa, nije uočena značajna razlika u bubrezima kod muškaraca i žena između Ctns–/– Gal-3–/– miševa i Ctns–/– miševi u dobi od 8 do 9 mjeseci i od 12 do 15 mjeseci (Slika 4a).
Funkcija bubrega je procijenjena u serumu i urinu i nije uočena značajna razlika između WT i Ctns–/–miševi u dobi od 8 do 9 mjeseci (podaci nisu prikazani), ali u dobi od 12 do 15 mjeseci, Ctns–/–miševi su pokazali značajno viši nivo kreatinina i uree u serumu u poređenju sa WT miševima. Zanimljivo, Ctns–/–Gal-3–/–miševi su pokazali poboljšanu funkciju bubrega u poređenju sa Ctns–/–miševi u dobi od 12 do 15 mjeseci, sa nižim kreatininom u serumu (P < 0.05) i ureom (P < 0,05; Tabela 1).
Histološke studije miša od 8- do 9-mjesečnog i od 12- do 15-mjesečnog mišabubregsekcije su otkrile prisustvo teških anomalija u Ctns–/– bubrezi, uključujući tubularnu atrofiju, uvučene glomerule i mononuklearne infiltrate. Slijepa analiza preseka bubrega kretala se u opsegu oštećenja korteksa od 1 (očuvana struktura tkiva) do 6. Prosječna ocjena za Ctns–/–miševa je bila 2.64 - 0.36 u dobi od 9 mjeseci (n=7) i 4,12 0.37 u dobi od 12 do 15 mjeseci (n=16). U bubrezima Ctns–/–Gal-3–/–miševi u istoj dobi, ove anomalije su bile značajno manje ekstenzivne: 1.62 - 0.11 u 9 mjeseci (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" i="" 3.04="" -="" 0.22="" u="" dobi="" od="" 12="" do="" 15="" mjeseci="" (n="33;" p="">< 0,05,="" mann-whitney="" t-test)="" (slika="" 4b="" i="" dodatna="" slika="" s2).="" štaviše,="" postotak="" tubularne="" atrofije="" je="" dodijeljen="" svakom="" tkivu,="" a="" prosjek="" za="">–/–miševi i Ctns–/–Gal-3–/–miševa je bilo 66 posto i 42 posto, respektivno, u dobi od 12 do 15 mjeseci (P ¼ 0.01). Nadalje, upadljiva razlika između Ctns–/–i Ctns–/– Gal-3–/– bubregsekcije je prisustvo nekoliko mononuklearnih infiltrata u Ctns–/–Gal-3–/–sekcije, dok su teški infiltrati konzistentno uočeni u Ctns–/– bubreg(Slika 4b).
Karakterizirali smo mononuklearne infiltrate uočene histološkim pregledom u Ctns od 8- do 9-mjesečne–/– bubrezikao makrofagi/monociti ko-imunobojenjem sa CD68 i CD45 i sa CD68 i velikom histokompatibilnom klasom II (dopunska slika S3), ali ne sa CD68 i CD163, što sugerira da ovi makrofagi imaju M1- proinflamatorni profil.32 ,33 Kvantifikacija CD68- pozitivnih ćelija otkrila je značajno manje makrofaga/monocita u WT, Gal-3–/–, i Ctns–/–Gal-3–/– bubreziu poređenju sa Ctns–/– bubrezi(Slika 4c), potvrđujući histološke podatke (Slika 4b).
Sve u svemu, ovi nalazi upućuju na to da je Gal-3 uključen u regrutaciju makrofaga/monocita u cistinotnombubrezii da njegovo odsustvo ublažava bubrežnu bolest u Ctns–/–miševi. Stoga to sugeriraupalaje odgovoran, barem djelimično, za pogoršanje stanja bubrega u Ctns–/– miševi.
Bubrezi sa nedostatkom Ctns pokazuju prekomjernu ekspresiju Gal-3
Koristeći Western blot analizu, otkrili smo da je ekspresija Gal-3 značajno povećanabubreziod 12-mjesečnog Ctns–/–miševi u poređenju sa WT miševima (Slike 5a i b). Da istraži da li je ovaj povećani izraz Gal-3 specifičan za Ctns–/– bubrezi, kvantificirali smo ekspresiju Gal-3 na nivou transkripta i proteina ububreziod miševa sa CKD izazvanom standardnom operacijom subtotalne 2-stepene nefrektomije i od životinja koje su podvrgnute lažnoj operaciji. WT i Ctns–/–miševi su korišteni kao kontrolni subjekti. Gal-3 transkripti su značajno povećani u Ctns–/– i lažnim bubrezima, ali su visoko povećani u CKDbubreziu poređenju sa WT miševima (Slika 5c). Nasuprot tome, na nivou proteina, Gal-3 je otkriven samo u Ctns–/–bubrega, što jasno ukazuje na to da samo Ctns–/–bubrezi nisu mogli razgraditi Gal-3 protein (slika 5d). Imunofluorescentno bojenje Gal-3 kod miševabubregu dobi od 8 do 9 mjeseci također je pokazala prekomjernu ekspresiju Gal-3 u Ctns–/– bubreziu poređenju sa WTbubrezi(Slika 5e). Štaviše, Gal-3 su eksprimirali CD68þ makrofagi, kao i bubrežne ćelije u Ctns–/– bubreziu dobi od 8 do 9 mjeseci (dodatna slika S4). Sve u svemu, ovi podaci su u skladu sa smanjenom degradacijom Gal-3 u odsustvucistinozakao što je pokazano in vitro (Slike 3a i b), što dovodi do akumulacije Gal-3 proteina u Ctns–/– bubrezi.
Odsustvo cistinozina dovodi do povećanja serumskog MCP-1 putem Gal-3 upregulacije
Gal-3 regulišeupalakroz različite mehanizme.34 Dakle, da bismo stekli dalji uvid u mehanizam ucistinoza, istražili smo ekspresiju različitih proupalnih ili antiinflamatornih citokina u serumu od 12- do 15-mjesečnog WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, i Ctns–/–Gal- 3–/–miševi. Šest nivoa citokina je izmjereno pomoću mišjeg citometrijskog niza zrnaca, MCP-1, interferona-g, faktora tumorske nekroze i IL-10, IL-6 i IL-12p70. Samo MCP-1 ekspresija je značajno povećana u serumu Ctns–/– miševa u poređenju sa WT i Gal-3–/– miševima i Ctns–/–Gal-3–/–miševi, čiji su nivoi MCP-1 u serumu bili uporedivi sa WT miševima (Slika 6a). MCP-1 proizvode različiti tipovi ćelija, pri čemu su glavni izvor MCP-1 makrofagi i monociti,35 i djeluje kao hemoatraktant za monocite i makrofage regulišući njihovu migraciju i infiltraciju. Nasuprot tome, u istoj dobi, ekspresija Gal-3 je slična u serumu Ctns–/– miševa (44,33 9,81 ng/ml; n=5) i WT miševa (40.{{12} }.41 ng/ml; n=7).
Odnos između Gal-3 i MCP-1 je dalje istražen ko-imunoprecipitacijom koristeći Gal-3–GFP i MCP-1–DsRed– ili Gal-3– GFP i CTNS-DsRed– (kao pozitivna kontrola) koji eksprimiraju 293T ćelije. Uočena je interakcija između Gal-3 i MCP-1 (slika 6b), što ukazuje na direktnu indukciju MCP-1 od strane Gal-3. Inkubacija sa N-acetil-D-laktozaminom (LacNAc), inhibitorom Gal-3 CRD-a, pokazala je da je, za razliku odcistinozininterakcije, CRD nije uključen u interakciju između Gal-3 i MCP-1 (slika 6c).
Da bismo procijenili da li je ovaj nalaz relevantan za ljude, izmjerili smo nivoe Gal-3 i MCP-1 kod pacijenata sacistinozakoji nisu bili podvrgnuti imunosupresivnoj terapiji ili uzimali protuupalne lijekove. Iako je utvrđeno da je nivo Gal-3 neznatno povećan u serumu pacijenata sa cistinozom u poređenju sa zdravim donorima, razlika nije bila značajna (slika 6e), što potvrđuje naše rezultate dobijene u Ctns–/–miševi. Samo 2 pacijenta su imala visok nivo Gal-3 (25,34 i 39,54 ng/ml); smatrani su izvanrednim vrednostima i stoga nisu uključeni na Sliku 6e. Nasuprot tome, korištenjem enzimskog imunosorbentnog testa usmjerenog na humani MCP-1 (Slika 6d), utvrđeno je da su nivoi MCP-1 u serumu značajno povećani kod pacijenata sacistinoza(252.1 - 18.4 pg/ml; n ¼ 19; starosni raspon 1-23 godine) uprkos tretmanu cisteaminom u poređenju sa zdravim kontrolnim subjektima (166.9 -13.5 pg/ml; n ¼ 1 0; starosni raspon 8–63 godine) (P < 0,001).="" nije="" pronađena="" korelacija="" između="" starosti="" i="" nivoa="" mcp-="" 1="" kod="" oba="" pacijenta="">cistinozai zdravi davaoci (podaci nisu prikazani).
Cistancheimaprotuupalnosvojstva
DISKUSIJA
Uprkos činjenici da se cistin akumulira u svim tkivima kod pacijenata oboljelih odcistinoza, bubrezi su organi koji su najosjetljiviji na oštećenja. Stoga vjerujemo da akumulacija cistina nije isključivo odgovorna za degeneraciju bubrega. Ovdje opisujemo novu ulogu zacistinozinu regulacijiupalauključeni u napredovanje hronične bubrežne bolesti ucistinoza. Ova studija može objasniti zašto pacijenti evoluiraju do završnog stadijuma zatajenja bubrega uprkos podvrgavanju terapiji cisteaminom.
Studija molekularnih partnera cistinoze otkrila je direktnu interakciju sa Gal-3, koju mogu inhibirati inhibitori Gal-3 CRD-a. Nedavne studije su pokazale da Gal-3 može stupiti u interakciju sa glikanima koji se nalaze u lumenu lizosoma nakon oštećenja lizosoma kao što je nakupljanje kristala.36 U našoj studiji, interakcija između Gal-3 icistinozinje proučavan u zdravim ćelijama koje eksprimirajucistinozini, prema tome, ne akumulira cistein ili cistinske kristale. Osim toga, prekomjerna ekspresija i Gal-3 i cistinozina u zdravim stanicama modificirala je subcelularnu lokalizaciju Gal-3, koja je zatim lokalizirana na lizozomima, u poređenju sa samo prekomjernom ekspresijom Gal-3, što nalazio se u citoplazmi. Ovi rezultati snažno sugeriraju da se interakcija između Gal-3 i cistinozina odvija neovisno o lizozomskom oštećenju i da je cistinozin aktivno odgovoran za Gal-3 lizozomsku lokalizaciju. Ranije se pokazalo da se Gal-3 razgrađuje kroz proteolizu zavisnu od lizozoma u odsustvu Abl i Arg, 2 tirozin kinaze.31
Osim toga, to smo i pokazalicistinozai Gal-3 ko-lokaliziraju na dinamičkim vezikularnim strukturama i zajedno su mobilizirani na prostorno-vremenski način.Cystinosinranije je bio povezan sa mehanizmima trgovine lizosomskim LAMP2A, jedinog poznatog CMA receptora, koji je pogrešno lokalizovan ucistinoza.28Ranije se pokazalo da je degradacija Gal-3 posredovana CMA.31Konfokalna mikroskopska analiza potvrdila je kolokalizaciju Gal-3 na Hsc70-pozitivnim strukturama u oba Ctns-a–/– i WT ćelije, podržavajući kotransport Gal-3 sa Hsc70 za prezentaciju na lizozomu i degradaciju od strane CMA jer Hsc70 pomaže translokaciju supstratnih proteina preko membrane u lizozomski lumen.29,30Moguća interpretacija naših rezultata je tocistinozinreguliše promet i isporuku Gal-3 do CMA aktivnih lizozoma radi razgradnje.
Ovaj novi put odcistinozin-zavisna Gal-3 lizozomska lokalizacija i degradacija je podržana in vivo jer miševi s nedostatkom Ctns pokazuju prekomjernu ekspresiju Gal-3 unutarbubreg. Štaviše, dok je povećana Gal-3 mRNA bila ograničena u Ctns–/–bubrezi u poređenju sa drugim modelom CKD, velika količina Gal-3 proteina je otkrivena samo u Ctns–/– bubrezi. Ovi podaci snažno podržavaju zaključak dacistinozinje uključen u razgradnju Gal-3 proteina, koji može kontrolisati prekomjernu ekspresiju Gal-3 mRNA u stresnim uslovima kao što je CKD.
Gal-3 ima nekoliko bioloških uloga, uključujući uloge u akutnim i hroničnimupalaprivlačeći monocite i makrofage.37,38U Ctns–/– miševa, uočili smo teške mononuklearne infiltrate uglavnom ububregkao što je prethodno opisano,11,39koji su okarakterisani kao monociti/makrofagi. Nasuprot tome, bubrezi iz dvostrukog nokauta Ctns–/–Gal-3–/–miševi su pokazali vrlo malo infiltrata monocita/makrofaga, što jasno ukazuje na to da je Gal-3 uključen uupalau bubrezima Ctns–/–miševi. U kontekstu ponavljajućih ozljeda tkiva, Gal-3 može izazvati prijelaz u hroničnuupalai fibroza.34U skladu sa ovim nalazima, naši podaci pokazuju učešće Gal-3 u napredovanju CKD-a ucistinoza. Zaista, dvostruki nokaut Ctns–/– Gal-3–/–miševi su se bolje pokazalibubregfunkcija i struktura u poređenju sa Ctns–/–miševi. Slično, miševi s nedostatkom Gal-3 pokazuju manje fibroze bubrega ububregu poređenju sa WT miševima nakon jednostrane opstrukcije uretera,40 i Gal-3 nokaut miševi podvrgnuti ishemijsko-reperfuzijskoj ozljedi imali su bolju bubrežnu funkciju u poređenju sa WT miševima podvrgnutim ishemijsko-reperfuzijskoj ozljedi.41
Iako je pronađena korelacija između nivoa Gal-3 u plazmi i razvoja CKD,42 nije uočena razlika u ekspresiji Gal-3 u serumu miševa i ljudi zahvaćenihcistinozai zdravi kontrolni subjekti. Mjerenjem različitih nivoa citokina u serumu, otkrili smo značajno povećanje MCP-1 u Ctns–/–miševi, dok Ctns–/–Gal-3–/–miševi su imali nivoe uporedive sa onima kod WT miševa. MCP-1 je citokin koji se može osloboditi u serumu i formira gradijent za privlačenje monocita i makrofaga na mjesto ozljede.35 Povećanje MCP-1 u serumu Ctns–/–miševi u poređenju sa Ctns–/–Gal-3–/–miševa je bila nezavisna od akumulacije cistina jerbubregsadržaj cistina bio je sličan u oba genotipa. Nadalje, uprkos tretmanu cisteaminom koji je omogućio izlazak cistina iz lizosoma, utvrđeno je da je MCP-1 značajno povećan u serumu pacijenata sacistinozau poređenju sa zdravim donorima. Ovi podaci snažno upućuju na to da izostanakcistinozin, a ne akumulacija cistina, odgovorna je za povećanje MCP-1 u serumu. Pored toga, pokazali smo direktnu interakciju između Gal-3 i MCP-1, koju su nedavno predložili Gordon-Alonso et al.43, ali nije dalje proučavana. Mehanizam Gal-3-posredovane MCP-1 aktivacije ovdje nije proučavan. Hipoteza je prisustvo signalnog peptida u ljudskom MCP-1, koji se može odcijepiti kako bi se pojačalo njegovo lučenje.44 Štaviše, plazmin može cijepati C-terminus MCP-1, što povećava njegov hemoatraktant potentnost.45 Osim toga, u korelaciji s našim podacima, inhibicija MCP-1 na mišjem modelu dijabetičke nefropatije spriječila je infiltraciju bubrežnih makrofaga i poboljšala funkciju bubrega.46,47 Ucistinoza, naši podaci snažno ukazuju na to da odsustvocistinozindovodi do povećanja Gal-3, koji aktivira MCP-1 mobilizaciju krvi, pospješujući rad bubregaupalai napredovanjehronična bolest bubrega.
Ovi nalazi otvaraju nove perspektive o potencijalnim terapijskim ciljevima koji bi mogli ograničiti ili odgoditi degeneraciju bubrega kod pacijenata sacistinoza. Zaista, otkriveno je da nesteroidni protuupalni lijekovi kao što su aspirin i indometacin inhibiraju ekspresiju Gal-3 inhibirajući njegovu transkripciju.48 Indometacin se zapravo koristi za regulaciju poliurije i polidipsije ucistinoza,49 i nedavna studija na 307 evropskih pacijenata sa cistinozom pokazala je poboljšan bubrežni ishod kod pacijenata liječenih indometacinom.50 U svjetlu naše studije, upotreba indometacina ili nesteroidnih protuupalnih lijekova zacistinozapacijenti mogu biti preispitani.
METODE
Eksperimenti na životinjama
C57BL/6 Ctns–/–miševe je obezbijedio dr. Antignac (Inserm U1163, Pariz, Francuska). C57BL/6 galectin-3 null (Gal-3–/–) miševe su obezbijedili dr. Fu-Tong Liu (Univerzitet Kalifornije, Davis) i dr. Jerrold M. Olefsky (Univerzitet Kalifornije, San Diego). Strategija uzgoja za stvaranje WT, Ctns–/–, Gal-3–/–, Ctns–/– i Gal- 3–/–miševi je opisan u Dodatnim metodama.
Ćelijske linije
nered je nastao iz biopsija kože novorođenčeta WT i Ctns–/–miševi. Ćelijske linije MEF, 293T i MDCK tipa II (ATCC, Manassas, VA) su uzgajane u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle mediju koji sadrži 10 posto fetalnog telećeg seruma ili fetalnog goveđeg seruma, 100 jedinica/ml penicilina, 0,1 mg/ml streptomicina i 2 mM L-glutamina.
Analiza ko-imunoprecipitacije i masene spektrometrije
Da bi se proučavale interakcije protein-protein, MDCK ćelije su transducirane pomoću lentivirusne kičme vektora pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE da bi se stabilno eksprimiralacistinozin-GFP.51Ko-imunoprecipitacija je izvedena kako je opisano u Dodatnim metodama. Ko-imunoprecipitirani proteini su razdvojeni natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE) i analizirani masenom spektrometrijom, LTQ Orbitrap kao što je već opisano.19
293T ćelije koje eksprimiraju Gal-3–GFP i MCP-1–DsRed ili Gal-3– GFP i CTNS-DsRed korištene su za ko-imunoprecipitaciju kao što je opisano u Dodatnim metodama. Ko-imunoprecipitirani proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE, a Gal-3–vezujući MCP-1 je detektovan korištenjem anti-DsRed antitijela (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Subcelularno frakcionisanje
Osam jetre je dobijeno od C57BL/6 miševa i pripremljeno kako je prethodno opisano.52 Uslovi gradijenta su u suštini bili isti kao što je opisano u originalnoj publikaciji,52 osim što je Nycodenz korišćen umesto metrizamida.
Tretmani Gal-3–inhibitorom i proteinazom K
Lizati izcistinozin-GFP MDCK ćelije i 293T koji eksprimiraju Gal-3–GFP i CTNS-DsRed ili Gal-3–GFP i MCP-1–DsRed su inkubirani sa ili bez 5 mM tiodigalaktozida ili 5 mM N -Acetil-D-laktozamin, 2 inhibitora Gal-3 CRD-a. Nakon 30 minuta inkubacije na 4 - C uz stalno mućkanje, lizati su inkubirani sa 50 ml anti-GFP mikrozrnaca, a imunoprecipitacija je izvedena kao što je prethodno spomenuto. Precipitirani proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE na 10 postotnom gelu.
Lizati izcistinozin-GFP MDCK ćelije i frakcije obogaćene lizozomima mišje jetre su inkubirane sa ili bez 2 posto Triton X-100 10 minuta na 4 - C, a zatim inkubirane 30 minuta sa ili bez 2,5 mg/ml i 25 mg /ml proteinaze K, respektivno. Nakon inaktivacije enzima sa 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida tokom 5 minuta na 4 - C, proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE na 10 postotnom gelu.
Imunofluorescentna analiza
Fiksirane MDCK ćelije su inkubirane sa anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) i anti-Gal-3 antitijelima (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) 2 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je slijedio Alexa Fluor 555 sekundarno antitijelo (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1 sat na sobnoj temperaturi. Konfokalne slike snimljene su Zeiss LSM 700 mikroskopom (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Njemačka).
293T ćelije koje prolazno eksprimiraju Gal-3–GFP sam, Gal-3–GFP, i DsRed ili Gal-3–GFP icistinozin-DsRed su uzgajani na pokrovnom stakalcu prije nego što su postavljeni na stakalce. Ćelije su snimljene pomoću Keyence BZ-X700 instrumenta (Keyence Corp., Osaka, Japan).
Popravljenobubregsekcije su inkubirane preko noći na 4 - C sa anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) ili anti-Gal-3 antitijelom (BioLegend), nakon čega slijedi Alexa Fluor 488 sekundarno antitijelo (Invitrogen), 1 sat na sobnoj temperaturi. Slike su dobijene pomoću Keyence BZ-X700 instrumenta. Kvantifikacija ekspresije CD68 opisana je u Dodatnim metodama.
MEF-ovi koji eksprimiraju Gal-3-GFP obojeni su korištenjem anti-Hsc70 antitijela (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) i snimljeni kako je prethodno opisano.53
Totalna unutrašnja refleksija FL fluorescentna mikroskopija
WT i Ctns–/–MEF koji eksprimira Gal-3–GFP, i CTNS-DsRed zasijani su na 4-komornoj 35- mm borosilikatnoj posudi s dnom (Cellvis, Mountain View, CA). Nakon 2 dana u kulturi, MEF-ovi su analizirani FL fluorescentnom mikroskopijom totalne unutrašnje refleksije kao što je prethodno opisano54iu dopunskim metodama. Slike su analizirane pomoću softvera ImageJ.
Analiza Gal-3 izraza
293T ćelije koje eksprimiraju Gal-3–GFP, Gal-3–GFP i DsRed, ili Gal-3–GFP i CTNS-DsRed i eksplantiranebubrezisu lizirani u puferu za radioimunoprecipitacijski test koji sadrži koktel inhibitora proteinaze. Proteini su razdvojeni na gelu od 4 do 15 posto i otkriveni korištenjem anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) ili anti-gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) antitijela .
Bubrezisu homogenizovani u RLT puferu koji sadrži b-merkaptoetanol korišćenjem Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francuska). RNK je izolovana i lančana reakcija digitalne polimeraze specifične za kapljice Gal-3 izvedena je kao što je opisano u Dodatnim metodama. Ekspresija Gal-3 transkripta je izražena kao omjer u poređenju sa endogenom kontrolom 18S. Za detekciju nivoa Gal-3 u miševima i ljudskim serumima, u skladu sa uputstvima proizvođača, korišten je enzimski imunosorbentni test (Abcam).
Bubrežna funkcija
Nivoi fosfata u serumu i urinu, kreatinina u serumu i uree procijenjeni su korištenjem QuantiChrom fosfatnog testa, Quanti Chrom kompleta za kreatinin i QuantiChrom kompleta za analizu uree (BioassaySystems, Hayward, CA). Nivoi proteina u urinu mjereni su korištenjem Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).
Histologija
U vrijeme kada su miševi ubijeni,bubrezisakupljeni su, fiksirani u formalinu i stavljeni u parafin. Sekcije obojene hematoksilinom i eozinom pregledala je dr. Marie Claire Gubler na slijepi način kako je opisano u Dodatnim metodama.
Merenje sadržaja cistina
Mjerenje cistina u tkivu izvedeno je masenom spektrometrijom (LC-ESI-MS/MS) kako je prethodno opisano.39
Standardna nefrektomija i lažna operacija
Kod miševa CKD je izazvan standardnom operacijom subtotalne 2-faze nefrektomije kao što je prethodno opisano.55,56Lažna grupa miševa je podvrgnuta istom postupku, ali bez rezanjabubregtkiva.
Nivo citokina u serumu
Za mjerenje nivoa citokina u serumu miša, mišupalakit citometrijski niz zrna (BD Biosciences, San Jose, CA) izveden je prema uputama proizvođača. Koncentracija MCP-1 u ljudskom serumu određena je pomoću enzimskog imunosorbentnog testa usmjerenog protiv MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) prema uputama proizvođača.
Statistička analiza
Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost - SEM. Značajnost rezultata je procijenjena nesparenim 2-repom t-testa ili nesparenim 2-repom t-testa sa Welch-ovom korekcijom. Grupna poređenja 3 ili više uslova su napravljena parametarskom analizom varijanse, nakon čega je slijedio Tukey test višestrukih poređenja za poređenje u paru. Histološki rezultati su upoređeni korištenjem Mann-Whitney testa. Analize su obavljene pomoću softvera Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). P-vrijednost manja od 0.05 se smatra značajnom.
Odobrenje studije
Eksperimenti na miševima su sprovedeni u skladu sa protokolima Institutional Animal Use Committee. Korištenje ljudskog tkiva u ovoj studiji odobrio je Univerzitet Kalifornije, San Diego, HumanResearch Protection Program.
OTKRIVANJE
SC je član Naučnog odbora i član Upravnog odboracistinozaFondacija za istraživanje. SC je suosnivač, dioničar i član i naučnog i upravnog odbora GenStem TherapeuticsInc. Uslove ovog aranžmana pregledao je i odobrio Univerzitet Kalifornija-San Diego u skladu sa svojom politikom sukoba interesa. Svi ostali autori su se izjasnili da nema suprotstavljenih interesa.
pružanje Gal-3–/–miševi. Zahvaljujemo Lou Devanneauxu i Nichole Flerchinger na njihovoj tehničkoj pomoći i Elizabeth Souter na recenziji rukopisa. Zahvaljujemo Christopheru Alfonsu iz BDBioscience za pružanje mišaupalacitometrijske kuglice i za njegovu pomoć u interpretaciji rezultata. Ovaj rad su podržali grantovi Nacionalnog instituta za zdravlje RO1-DK090058 i R01-DK110162,CistinozaIstraživačka fondacija i Kalifornijski institut za regenerativnu medicinu (CIRM, CLIN-09230). TL je podržan od strane diplomirane stipendije iz Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB i JZ su podržani od strane stipendijecistinozaFondacija za istraživanje. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility je finansiran od strane Nacionalnog instituta za neurološke poremećaje i moždanog udara (NINDS) grant P30-NS047101.
REFERENCE
1. Medzhitov R. Porijeklo i fiziološke ulogeupala. Priroda. 2008;454:428–435.
2. Donath MY. Ciljanjeupalau liječenju dijabetesa tipa 2. Diabetes Obes Metab. 2013;15(suppl 3):193–196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Citokini u sindromu sistemskog inflamatornog odgovora: pregled. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth. 2010;2:161–175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Povezanost cirkulirajućih inflamatornih markera i rezidualne bubrežne funkcije kod pacijenata s CRF-om. Am JBubregDis. 2003;41:1212–1218.
5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cistinoza. N Engl J Med. 2002;347: 111–121.
6.Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Ciljanje nacistinozinZa lizozomalnu membranu potreban je signal baziran na tirozinu i novi motiv sortiranja. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.
7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystinosin, protein neispravan ucistinoza, je H( )-pokrenut lizozomalni cistinski transporter. EMBO J. 2001; 20:5940–5949.
8. Cherqui S, Courtoy PJ. Bubrežni Fanconijev sindrom ucistinoza: patogenetski uvidi i terapijske perspektive. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
9. Nesterova G, Gahl W. Nephropathiccistinoza: kasne komplikacije multisistemske bolesti. Pediatr Nephrol. 2008;23:863–878.
10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Nedostaje intralizozomalna akumulacija cistina kod miševacistinozin, protein neispravan ucistinoza. Mol Cell Biol. 2002;22:7622–7632.
11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Renalni fenotipcistinozamodel miša ovisi o genetskoj pozadini. Transplantacija Nephrol Dial. 2010;25:1059–1066.
12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. Očne anomalije u acistinozaživotinjski model oponaša patogenezu bolesti. Pediatr Res. 2007;62:156–162.
13. Vodič Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Mišji model sugerira dva mehanizma za promjene štitne žlijezde u infantilne djececistinoza: smanjena sinteza tireoglobulina zbog stresa endoplazmatskog retikuluma/odgovora nesavijenog proteina i poremećene lizozomske obrade. Endokrinologija. 2015;156:2349–2362.
14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Terapija cisteaminom odgađa napredovanje nefropatijecistinozakod kasnih adolescenata i odraslih.BubregInt. 2012;81:179–189.
15. Cherqui S. Cysteamine terapija: tretman zacistinoza, nije lek.BubregInt. 2012;81:127–129.
16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nephropathiccistinozakod odraslih: prirodna istorija i efekti oralne terapije cisteaminom. Ann Intern Med. 2007;147:242–250.
17. Cherqui S, Courtoy PJ. Bubrežni Fanconijev sindrom ucistinoza: patogenetski uvidi i terapijske perspektive. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Poremećaj autofagije posredovane šaperonom dovodi do selektivnih defekta lizosomske degradacije u bolesti lizosomskog skladištenjacistinoza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystinosinje komponenta vakuolarnog kompleksa H-ATPaze-regulator-krpa koji kontroliše metu sisara rapamicinskog kompleksa 1. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678–1688.
20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Aktivacija transkripcionog faktora EB spašava lizozomske abnormalnosti u cistinoticimabubregćelije.BubregInt. 2016;89:862–873.
21. Dumić J, Dabelić S, Flogel M. Galectin-3: priča otvorenog kraja. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.
22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galektin-3: jedan molekul za alfabet bolesti, od A do Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).
23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. Utjecaj inhibicije galektina-3 na ozljede srca i bubrega uzrokovane aldosteronom. JACC Heart Fail. 2015;3:59–67.
24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Farmakološka inhibicija galektina-3 štiti od hipertenzivne nefropatije. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F500–F509.
25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Modificirani citrusni pektin smanjuje ekspresiju galektina-3 i težinu bolesti u eksperimentalnim akutnimbubregpovreda. PloS One. 2011;6:e18683.
26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Galektin-3 blokada smanjuje bubrežnu fibrozu u dva normotenzivna eksperimentalna modela oštećenja bubrega. PloS One. 2016;11:e0166272.
27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Uticaj odcistinozaglikozilacija na stabilnost proteina diferencijalnim dinamičkim označavanjem stabilnih izotopa aminokiselinama u ćelijskoj kulturi (SILAC). Mol Cell Proteomics. 2017;16:457–468.
28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Poremećaj autofagije posredovane šaperonom dovodi do selektivnih defekta lizosomske degradacije u bolesti lizosomskog skladištenjacistinoza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
29. Majeski AE, Dice JF. Mehanizmi autofagije posredovane pratiocem. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435–2444.
30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. Autofagija posredovana šaperonom sprečava apoptozu razgradnjom BBC3/PUMA. Autofagija. 2015;11:1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. c-Abl i Arg tirozin kinaze regulišu lizozomsku degradaciju onkoproteina Galectin-3. Cell Death Differ. 2010;17:1277–1287.
32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Dominacija M2-polarizovanih makrofaga u karcinomu mokraćne bešike utiče na angiogenezu, stepen tumora i invazivnost. Oncol Lett. 2016;11:3403–3408.
33. Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Mnogo više od M1 i M2 makrofaga, postoje i CD169( ) i TCR( ) makrofagi. Front Immunol. 2015;6:263.
34. Henderson NC, Sethi T. The Regulation ofupalaod galectin-3. Immunologic Rev. 2009;230:160–171.
35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1): pregled. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313–326.
36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Pokrenuto angažovanje ESCRT mašinerije promoviše endolizozomalnu popravku. Nauka. 2018;360(6384).
37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulacija alternativne aktivacije makrofaga galektinom-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.
38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Ljudski galektin-3 je novi hemoatraktant za monocite i makrofage. J Immunol. 2000;165:2156–2164.