Abstract

Cilj:Da bi se istražili efektiverbaskozid (VB; poznat i kao akteozid)onzarastanje tetiva i kostikod pacova koji slederekonstrukcija prednjeg ukrštenog ligamenta (ACL)., te istražiti da li jeJanus kinaza 2 (JAK2)/pretvarač signala i aktivator transkripcije 3 (STAT3)uključen je signalni put.

Metode:Pacovi su nasumično raspoređeni u šest grupa:Sham, Model, niska doza VB (VB‑L), srednja doza VB (VB‑M), visoka doza VB (VB‑H), iVB‑H + AG490(inhibitor puta JAK2/STAT3). Osim Sham grupe, sve grupe su podvrgnute rekonstrukciji ACL-a kako bi se uspostavio postoperativni model.

Micro‑CTje korišten za procjenu parametara koštane mikrostrukture koštanog tunela i za mjerenjepovršina poprečnog presjekafemoralnog i tibijalnog tunela.

Biomehanička ispitivanjaevaluirano rekonstruirano kolenoukočenostimaksimalno opterećenje.

ELISAizmjereni inflamatorni citokini i markeri oksidativnog stresa u tekućini za ispiranje koljena.

H&E bojenjeiSafranin O–Fast Green bojenjeprocijenjena patologija hrskavice.

Imunohistohemijaprocijenjen izrazkolagen tipa I (COL‑I)imatriksna metaloproteinaza-13 (MMP13).

Western blotispitivani proteini povezani saJAK2/STAT3put.

Rezultati:U poređenju sa grupom modela, VB‑L/VB‑M/VB‑H povećanomjer površine kosti i volumena, trabekularne debljine, iBV/TV, i smanjiofemoralniipovršina poprečnog presjeka tunela tibijalne kosti, sa najznačajnijim promjenama u VB‑H grupi (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H also increased ukočenostimaksimalno opterećenje, opet najistaknutije u VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05). ELISA showed that VB reduced TNF‑, IL‑6, IL‑1, iMDA, dok se povećavaSODiGSH‑Px, pri čemu VB‑H pokazuje najjači efekat (P<0.05P < 0.05P<0.05). Histology indicated improved cartilage damage with thicker cartilage layers, more orderly chondrocyte arrangement, reduced inflammatory infiltration, increased proteoglycan content, and clearer tidemark-most evident in VB‑H. Immunohistochemistry showed increased COL‑Ii smanjenaMMP13u VB grupama (VB‑H najjači, P<0.05P < 0.05P<0.05). Western blot indicated increased p‑JAK2/JAK2ip‑STAT3/STAT3u VB grupama (VB‑H najjači, P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with VB‑H, AG490djelimično poništio ova poboljšanja.

zaključak:Verbaskozid može potaknuti zacjeljivanje tetiva i kosti kod pacova nakon rekonstrukcije ACL-a, potencijalno krozaktivacija JAK2/STAT3 signalnog puta.

Ključne riječi:JAK2/STAT3 signalni put; verbaskozid (akteozid); ACL rekonstrukcija; zarastanje tetiva i kosti

Uvod

Ruptura ACL-a je obično uzrokovana sportom visokog intenziteta i mehaničkom traumom, koja se obično manifestira bolom, brzim oticanjem zglobova, nestabilnošću i smanjenom tolerancijom na vježbanje – što često dovodi do velikih funkcionalnih ograničenja. Rekonstrukcija ACL se široko koristi klinički, aliuspješan postoperativni oporavak u velikoj mjeri ovisi o integraciji tetiva-kostna interfejsu transplantat-kost.

Posljednjih godina istraživači su istražili više strategija za ubrzanje zacjeljivanja tetiva i kostiju, kao što je nprfizička stimulacija(istezanje, pritisak, vibracije), implantacija biomaterijala i upotreba citokina ili pristupa tkivnom inženjeringu. Čak i tako, izlječenje može biti sporo, a ishodi ostaju promjenjivi, motivirajući interes zanovi dodatni pristupi, uključujućibioaktivna jedinjenja sa antiinflamatornim, antioksidativnim i zaštitnim svojstvima kostiju.

verbaskozid (akteozid)je feniletanoidni glikozid rastvorljiv u vodi koji se nalazi u raznim lekovitim biljkama. Prijavljeno je da se izlažeantiinflamatorno, antioksidans, iza zaštitu kostijuaktivnosti, uključujući supresiju osteoklastogeneze i ublažavanje erozije kostiju u modelima upalnog artritisa.

Ključni mehanički kandidat jeJAK2/STAT3put, glavna intracelularna signalna kaskada uključena u različite fiziološke i patološke procese. Prethodni rad sugerira da aktiviranje JAK2/STAT3 može povećati debljinu trabekule, krutost i maksimalno opterećenje u kontekstu ozljede kostiju, podržavajući zacjeljivanje prijeloma.

Lista specifikacija ekstrakta visokog akteozida Cistanche

Služba podrške Wecistanche-Za više detalja o saradnji
Email:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

Gdje se Cistanche uklapa

Za čitaoce koji istražujuprirodne strategije podrške dobijene od biljaka, korisno je to znatiCistanche(često se raspravlja u tradicionalnim biljnim kontekstima) jedna je od biljaka koje se često spominju kao sadržefeniletanoidni glikozidi, uključujućiakteozid (verbaskozid)u nekim pripremama. Ovo radineznači da je to dokazana ili odobrena postoperativna terapija za rekonstrukciju ACL-a, prije pruža botanički kontekst zašto je akteozid/verbaskozid privukao pažnju istraživanja. U kontroliranim životinjskim modelima poput onog u ovoj studiji, korištenje definiranog spoja (VB) omogućava mehaničko testiranje - nešto što dodaci cijelog bilja ne mogu garantirati zbog varijabilnosti u sastavu i dozi.

Ova studija stoga istražuje može li verbaskozid poboljšati zacjeljivanje tetiva i kosti u modelu rekonstrukcije ACL štakora i da li se ovaj efekat odnosi naAktivacija JAK2/STAT3.

Materijali i metode

1. Životinje

Mužjaci SPF SD pacova (stari 7 sedmica, 200–220 g) dobijeni su od odjela za eksperimentalne životinje Medicinskog univerziteta Hebei (licenca: SCXK (Hebei) 2025‑005). Uslovi stanovanja: vlažnost 55%-65%, temperatura 22-24 stepena, 12‑h ciklus svetlo/mrak, slobodan pristup hrani i vodi. Studiju je odobrio Komitet za etiku životinja Medicinskog fakulteta u Cangzhou (odobrenje br.. 2202130618).

2. Lijekovi i reagensi

Verbaskozid (čistoća 99,8%, HY‑N0021‑107208), AG490 (čistoća 99,0%, HY‑12000‑09922): Shanghai Haoyuan Biopharmaceutical Technology Co., Ltd.

ELISA kompleti za TNF‑ (ml002859), IL‑6 (ml102828), IL‑1 (ml003057), SOD (EK‑M26101), MDA (EK‑M29370), GSH‑Px (EK‑M29370), GSH‑Px (EK‑M29370), GSH‑Px (EK‑M29370): Eng‑M27Engha‑En‑M2 Co., Ltd.

Antitijela: JAK2 (FNab04432), STAT3 (FNab08298) iz Wuhan Fine Biotech; COL‑I (GTX82720), MMP13 (GTX100665), p‑JAK2 (GTX32203) iz GeneTexa; p‑STAT3 (bsm‑52210R) kompanije Bioss; ‑aktin (48139) iz Nanjing Saigowe; HRP-kozji anti-zečji IgG (P0948) iz Beyotimea.

3. Instrumenti

Čitač mikroploča (EnVision), mikroskop (Olympus BX51), sistem za snimanje u gelu (Bio‑Rad GelDoc Go).

4. Uspostavljanje modela, grupisanje i administracija

Modeliranje (ACL rekonstrukcija):Pacovi su anestezirani intraperitonealnim 10% hloral hidratom (4 mL/kg). Napravljen je medijalni parapatelarni rez kako bi se otkrila ACL, koja je transektirana (pozitivni Draer i Lachmanov test). Tibijalni i femoralni tuneli su izbušeni na nativnom ACL otisku. Fiksni tetivni transplantat je prošao kroz tibijalni tunel u zglobnu šupljinu i u femoralni tunel, zatim zašiven i fiksiran na lateralno meko tkivo femura u blizini izlaznog otvora tunela. Sa savijenim koljenom pod uglom od 30 stepeni, kraj tibije je zašiven i fiksiran za koštani most tibijalnog tunela i okolno meko tkivo. Negativni ladički i Lachman testovi i dobra napetost grafta ukazali su na uspješnu rekonstrukciju. Rez je zatvoren, dezinfikovan i penicilin je ubrizgavan 3 dana da bi se sprečila infekcija. Kriterijumi uspjeha: negativna fioka/Lachman i dobra napetost grafta.

Grupisanje:Korišteno je 120 pacova. Osamnaest je nasumično odabrano kao lažno (samo rez i zatvaranje). Od preostala 102 modelirana štakora, 90 je uspješno uspostavljeno (stopa uspješnosti 88,24%) i nasumično raspoređeno (18 po grupi) u: Model, VB‑L, VB‑M, VB‑H i VB‑H+AG490.

Režim doziranja (jednom dnevno tokom 8 nedelja):

VB‑L/VB‑M/VB‑H: 50/100/200 mg/kg VB putem sonde + fiziološki rastvor jednake zapremine intraperitonealno.

VB‑H+AG490: 200 mg/kg VB gavažom + AG490 5.0 mg/kg intraperitonealno.

Lažni/model: jednaka doza fiziološke otopine putem sonde + fiziološka otopina intraperitonealno.

5. Micro‑CT

Nakon eutanazije, intaktni zglobovi koljena sa susjednom butnom kosti i tibije su sakupljeni i fiksirani u 4% paraformaldehidu na 4 stepena tokom 24 h. Uzorci su umotani u vlažni papir bez vlakana i skenirani mikro-CT od 360 stepeni (rezolucija 10 μm; 70 kV; 114 μA; ekspozicija 400 ms; 0,5 mm Al filter). Analizirani parametri:omjer površine kosti/volumena, BV/TV, trabekularne debljine; ipovršina poprečnog presjeka femoralnih i tibijalnih tunela.

6. Biomehaničko ispitivanje

Rekonstruisana koljena su montirana u mašinu za ispitivanje materijala. Primijenjeno je prednaprezanje od 0,8 N da bi se uklonilo labavost, nakon čega je uslijedilo ispitivanje zatezanja pri 5 mm/min dok opterećenje ne padne ~25% od vrha. Zabilježeno je opterećenje–pomak iukočenostizračunati.

7. ELISA za faktore upalnog i oksidativnog stresa u ispiranju koljena

Koljena su otvorena na suprapatelarnoj vrećici i isprana fiziološkom otopinom tri puta kako bi se prikupila tekućina za ispiranje. Nakon centrifugiranja (2.000 o/min, 15 min), supernatanti su korišteni za kvantifikacijuTNF‑, IL‑6, IL‑1i markeri oksidativnog stresaSOD, GSH‑Px, MDAby ELISA.

8. H&E i Safranin O – brzo zeleno bojenje

Koljena su fiksirana, dekalcificirana, ugrađena u parafin, izrezana na 4 μm, deparafinizirana, rehidrirana i obojena H&E i Safranin O-Fast Green za procjenu patologije hrskavice.

9. Imunohistohemija za COL‑I i MMP13

Nakon rutinske obrade, izvršeno je uzimanje antigena i blokiranje. Sekcije su inkubirane s primarnim antitijelima protiv COL-I i MMP13 preko noći na 4 stepena, zatim sa sekundarnim antitijelima konjugiranim s HRP 1 h na sobnoj temperaturi. DAB je korišten za razvoj boje, obavljeno je kontra-bojenje hematoksilinom, a ekspresija je promatrana mikroskopski.

10. Western blot za proteine ​​puteva JAK2/STAT3

Ukupni proteini su ekstrahovani iz tkiva koljena, kvantifikovani, denaturirani, odvojeni elektroforezom, prebačeni u PVDF i blokirani. Membrane su inkubirane sa primarnim antitijelima protiv p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3 i -aktina preko noći na 4 stepena, nakon čega je uslijedilo HRP-sekundarna antitijela 1 h. Trake su vizualizirane i analizirane denzitometrijom.

 

Tabela 6. Poređenje nivoa ekspresije JAK2/STAT3 proteina vezanih za signalni put u tkivima zgloba koljena svake grupe pacova (n=6n=6n=6, srednja vrijednost ± SD)

Grupa	p‑JAK2/JAK2	p‑STAT3/STAT3
Sham	0.95 ± 0.10	0.88 ± 0.10
Model	0.34 ± 0.04a^{a}a	0.25 ± 0.04a^{a}a
VB‑L	0.52 ± 0.06b^{b}b	0.43 ± 0.05b^{b}b
VB‑M	0,71 ± 0,08bc^{bc}bc	0.61 ± 0.07bc^{bc}bc
VB‑H	0,92 ± 0,10bcd^{bcd}bcd	0,83 ± 0,09bcd^{bcd}bcd
VB‑H + AG490	0.55 ± 0.06e^{e}e	0.46 ± 0.05e^{e}e

11. Statistička analiza

Podaci su normalno raspoređeni i izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Korišten je SPSS 29.0. Jednosmjerna ANOVA primijenjena je za višegrupna poređenja, a SNK-q test za poređenje u paru. P<0.05P < 0.05P<0.05 indicated statistical significance.

Rezultati

1. Mikrostruktura koštanog tunela i površina poprečnog presjeka tunela

U poređenju sa Sham-om, grupa Model je pokazala smanjenjeomjer površine kosti/volumena, trabekularne debljine, iBV/TV, i povećanafemoralniipovršina poprečnog presjeka tibijalnog tunela (P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with Model, VB‑L/VB‑M/VB‑H increased bone microstructure parameters and decreased tunnel cross‑sectional areas (P<0.05P < 0.05P<0.05), with VB‑H being most significant. Compared with VB‑H, VB‑H+AG490 reduced these improvements and increased tunnel areas (P<0.05P < 0.05P<0.05).

2. Ukočenost koljena i maksimalno opterećenje

U poređenju sa Sham-om, grupa Model je izlagala smanjenoukočenostimaksimalno opterećenje (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H significantly increased both outcomes vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed the VB‑H benefits (P<0.05P < 0.05P<0.05).

3. Upalni citokini u ispiranju koljena

TNF‑, IL‑6 i IL‑1 su bili povišeni u grupi modela u odnosu na Sham (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB treatment decreased these cytokines vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 increased cytokine levels vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

4. Markeri oksidativnog stresa u ispiranju koljena

Model pacova se povećaoMDAi smanjenaSODiGSH‑Pxprotiv Šama (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB lowered MDA and raised SOD and GSH‑Px vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 partially reversed these effects vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

5. Patologija hrskavice (H&E i Safranin O-Fast Green)

H&E je pokazao ozbiljnu povredu hrskavice u grupi modela sa gubitkom slojevite strukture, oštećenim i neorganizovanim površinskim ćelijama i izraženom inflamatornom infiltracijom. VB grupe su pokazale 明显 poboljšanje: deblja hrskavica, više hondrocita s urednim rasporedom i smanjena inflamatorna infiltracija; VB‑H je imao najjasnije poboljšanje.
Safranin O–Fast Green je ukazao na ozbiljan gubitak proteoglikana i nepravilan/odsutan znak plime u modelu, dok je VB obnovio bojenje proteoglikana i integritet oznake plime; AG490 pogoršava patologiju u odnosu na VB‑H.

6. COL‑I i MMP13 izraz

U poređenju sa Sham-om, Model je pokazao smanjenjeCOL‑Ii povećanaMMP13 (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased COL‑I and decreased MMP13 vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed these changes (P<0.05P < 0.05P<0.05).

7. Proteini putanje JAK2/STAT3

Model pacova je smanjenp‑JAK2/JAK2ip‑STAT3/STAT3protiv Šama (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased both ratios vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 decreased both ratios vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Diskusija

Tetive povezuju mišiće s kostima i neophodne su za obnavljanje funkcije zglobova. U postavci rekonstrukcije ACL-a, integracija tetiva-kost je glavna determinanta mehaničke stabilnosti i funkcionalnog oporavka. U ovom modelu, operacija je narušila mikroarhitekturu i biomehaniku kosti (niži BV/TV, debljina trabekule, krutost, maksimalno opterećenje; veće površine tunela), što je u skladu sa odloženim sazrevanjem interfejsa.

Upala igra dvostruku ulogu u zacjeljivanju tetiva i kosti: kontrolirani upalni odgovor može očistiti ostatke i podržati ćelijsku proliferaciju i stvaranje kolagena, dok pretjerana upala potiče oštećenje tkiva, adhezije i stvaranje ožiljaka. Ovdje su se TNF‑, IL‑6 i IL‑1 značajno povećali nakon rekonstrukcije, što ukazuje na proinflamatorno okruženje koje je vjerovatno nepovoljno za organizirano zacjeljivanje sučelja.

Oksidativni stres je isto tako važan. Povišen MDA sa smanjenim SOD i GSH‑Px sugerira povećanu peroksidaciju lipida i smanjenu antioksidantnu odbranu. Oksidativni stres može poremetiti osteogenezu i poremetiti remodeliranje matriksa. Paralelno, povećani MMP13 i smanjeni COL‑I impliciraju ubrzanu degradaciju ekstracelularnog matriksa, što može odgoditi stabilizaciju interfejsa tetiva-kost.

Zašto je verbaskozid (akteozid) zanimljiv u "prirodnim" strategijama

Verbaskozid je spoj biljnog porijekla s protuupalnim i antioksidativnim svojstvima, što je u skladu s idejom da bi moduliranje upalnog i oksidativnog mikrookruženja moglo pomoći zacjeljivanju međusklopa. U ovoj studiji, VB je poboljšao mikrostrukturu kosti, smanjio proširenje tunela, poboljšao mehaničku čvrstoću, smanjio upalne citokine, poboljšao redoks markere, povećao COL-I i snizio MMP13 - što sugerira koordinirani pomak prema konstruktivnom preobličavanju, a ne destruktivnoj upali.

JAK2/STAT3 kao mehaničko čvorište

Put JAK2/STAT3 se aktivira kada se ekstracelularni signali vežu na receptore citokina, promovišući fosforilaciju JAK2, regrutaciju/fosforilaciju STAT3, STAT3 dimerizaciju i nuklearnu translokaciju za regulaciju gena uključenih u upalu, odgovor na oksidativni stres i formiranje kostiju. Sadašnji rezultati su pokazali smanjenu aktivaciju puta nakon modeliranja, ali je VB povećao p-JAK2/JAK2 i p-STAT3/STAT3. Važno je da je blokiranje puta pomoću AG490 djelomično preokrenulo prednosti VB-a na mikro-CT, biomehaniku, inflamatorne/oksidativne markere, proteine ​​koji remodeliraju matriks i uključenost puteva koji podržavaju histologiju.

 

Praktični "prirodni" kontekst: botanički proizvodi bogati cistanche i akteozidima

Za publiku zainteresiranu za strategije dobivene iz biljaka,Cistanchečesto se raspravlja kao botanički izvor feniletanoidnih glikozida, uključujući akteozid/verbaskozid u nekim preparatima. Iz perspektive prevođenja, ključna naučna poenta je todefinisanu dozu prečišćenog VBmogu se mehanički potvrditi na životinjskim modelima, dok proizvodi od cijelog bilja mogu varirati u sastavu, metodi ekstrakcije i biodostupnosti. Stoga, dok je Cistanche relevantan za razgovor o botaničkim preparatima bogatim akteozidima, dokazi u ovom rukopisu izričito podržavajuverbaskozid kao jedinjenjeu kontroliranom postoperativnom modelu štakora, a ne klinička preporuka.

Opšti zaključak:Verbaskozid može poboljšati zacjeljivanje tetiva i kosti nakon rekonstrukcije ACL-a kod pacova, potencijalno aktiviranjem JAK2/STAT3 signalizacije i poboljšanjem inflamatornog/oksidativnog mikrookruženja uz favoriziranje integriteta kolagenog matriksa.

 

Reference

(Prevedena lista je sačuvana onakva kakva je iz vašeg rukopisa; mogu ih formatirati u ciljni stil časopisa ako mi kažete časopis.)