Nedvosmisleno NMR strukturno određivanje (plus )-katehin-Lakaza dimernih proizvoda reakcije kao potencijalnih markera oksidacije grožđa i vina
Mar 12, 2022
Za više detalja kontaktirajte:tina.xiang@wecistanche.com
Abstract:( plus )-Katehin—lakazaoksidacijadimerni standardi su hemi-sintetizirani upotrebom lakaze iz Trametes Versicolor je rastvor vode-etanola pri pH 3,6. Detektovano je osam frakcija koje odgovaraju osam potencijalnih oksidacionih dimernih proizvoda. Profili frakcija su upoređeni sa profilima dobijenim sa dve druge oksidoreduktaze:polifenol oksidazaekstrahiran iz grožđa i lakaze iz Botrytis cinerea. Profili su bili vrlo slični, iako su neke manje razlike upućivale na moguće razlike u reaktivnosti ovih enzima. Pet frakcija je zatim izolovano i analizirano 1D i 2D NMR spektroskopijom. Dodavanje tragova kadmijum nitrata u uzorke solubilizovane u acetonu dovelo je do potpuno razrešenih NMR signala fenolnih protona, omogućavajući nedvosmisleno strukturno određivanje šest reakcijskih proizvoda, od kojih jedna od frakcija sadrži dva enantiomera. Ovi proizvodi se dalje mogu koristiti kao markeri oksidacije kako bi se istražilo njihovo prisustvo i evolucija u vinu tokom proizvodnje vina i starenja vina.
Ključne riječi: marker oksidacije;( plus )-katehin; fenolni NMR signali; laccase; kadmijum nitrat; polifenol oksidaza
1. Uvod
Polifenolisu porodica hemijskih jedinjenja široko prisutnih u prirodi. U značajnim količinama nalaze se u čaju [1], kakau [2,3], borovnicama [4], grožđu [5l i fermentisanim proizvodima poput vina [6]. Budući da su primarni ciljevi oksidacije J7,8], hemijske strukture polifenola se neprestano razvijaju. Ove promjene utiču na organoleptička svojstva mnogih vrsta hrane; oni su odgovorni za pojave kao što su tamnjenje hrane [9] i modifikacije senzornih karakteristika vina [10,11. U enologiji se ovaj fenomen oksidacije odvija u grožđu ili vinu. Što se tiče enzimske oksidacije, glavni enzimi odgovorni za tamnjenje su oksidoreduktaze, tačnije,polifenol oksidazaprisutan u grožđu i lakazi koju proizvodi Botrytis cinerea [12].
Enzimskioksidacijauglavnom se javlja u moštu od grožđa, ali dalje tamnjenje vina može biti posljedica kemijskih reakcija oksidacije |7,13] ili Botrytis cinerea laccase koja može biti vrlo stabilna tokom starenja vina14. Na fenolnim supstratima mogu se javiti dvije oksidacijske enzimske aktivnosti: aktivnost monofenol oksidaze koju karakterizira hidroksilacija postojeće hidroksilne grupe u susjednoj poziciji i aktivnost difenol oksidaze koja odgovara oksidaciji orto-dihidroksibenzena u orto-benzohinone.
Prema Nomenklaturnom komitetu Međunarodne unije za biohemiju i molekularnu biologiju (NC-IUBMB), ove enzimske aktivnosti kataliziraju enzimi klase EC1- koji odgovaraju oksidoreduktazama. Među njima, tri glavne klase oksidoreduktaza koje kataliziraju oksidaciju polifenola su EC1.14.18.1 (monofenol monooksigenaza), EC1.11.1 (peroksidaza/POD) i EC1.10.3 (oksidoreduktaze koje djeluju na difenole).
Ova posljednja klasa podijeljena je u različite podklase, a dvije od njih su se učinile posebno interesantnim za ovu studiju: EC1.10.3.1 (polifenol oksidaza/PPO) i EC1.10.3.2 (lakaza) (vidi Dodatni materijal Sliku S1).
PPO, lakaza i peroksidaza su oksidoreduktaze koje su uglavnom odgovorne za tamnjenje tokom prerade grožđa [13]. Posmeđivanje uzrokovano POD je zanemarivo u voću, ali može povećati razgradnju fenola u kombinaciji s PPO[15]. PPO je prirodno prisutan u grožđu i može katalizirati oksidaciju monofenola u katehole i katehola u smeđe pigmente [8,13,16]. Lakaze, koje se javljaju u grožđu zaraženom Botrytisom, imaju širi spektar djelovanja|17|jer mogu katalizirati oksidaciju mnogih različitih supstrata. Glavni ciljevi oksidacije lakaza ostaju 1-2 i 1-4 dihidroksibenzen.
U vinu, benzokinon proizveden oksidacijom (PPO ili lakaze) može lako podvrgnuti daljnjim reakcijama ovisno o njihovim redoks svojstvima i elektronskim afinitetima [15]. Mogu djelovati ili kao elektrofili i reagirati s amino derivatima [18] ili djelovati kao oksidansi i reagirati, između ostalog, sa fenolnim supstratima. Ovisno o njihovoj kemijskoj konformaciji (kinon ili semi-kinon), benzokinon može dovesti do različitih proizvoda oksidacijske reakcije. Pri neutralnom pH, (plus)-katehin će se oksidirati u kinon na poziciji A-prstena C5 ili C7 i dovesti do stvaranja šest mogućih dimernih izomera koji impliciraju vezu između položaja B-prstena C2', C5' ili C6' gornje katehinske jedinice i pozicija A-prstena C6 ili C8 donje jedinice [19,20]. Dehidrodikatehin je dobro poznati proizvod ovog spajanja [21]. Položaji označavanja struktura prikazani su na slici 1. U kiselim uslovima, polukinonski oblici mogu takođe biti prisutni na B-prstenu (položaj OH3'ili OH4') i dovesti do četiri moguća dimerna izomera [20,22] sa gornju katehinsku jedinicu i A-prsten donje jedinice (pozicija C6 ili C8). Enzimska oksidacija katehina je istraživana u prethodnim studijama [22,23], a povezani produkti oksidacije su okarakterizirani HPLC-om [24], iako su rjeđe izolirani i nikad potpuno okarakterizirani NMR.
Cilj ovog rada bio je prvo da se pomoću UHPLC-MS uporede profili proizvoda oksidacije dimer( plus )-katehin u prisustvu tri ekstrakta oksidoreduktaze, tj. PPO ekstrahovanog iz grožđa, lakaze iz gljive Botrytis cinerea prisutne u botritizovanim slatkim vinima. [14], i lakaza iz Trametes Versicolor.
Drugi cilj je bio hemisintetizirati i karakterizirati strukture nekih dimernih oksidacijskih proizvoda NMR spektroskopijom dobivenom s lakazom iz Trametes Versicolor.
2. Rezultati i diskusija
2.1. Poređenje profila proizvoda dimerne reakcije s tri različite oksidoreduktaze i( plus )-katehin
( plus )-katehin je prvo oksidiran u prisustvu lakaze iz Trametes Versicolor na pH 3,6 u modelnom rastvoru vina. Nakon odvajanja dimerne frakcije od rezidualnog( plus )-katehina i drugih polimernih frakcija, osam glavnih frakcija je sakupljeno i analizirano UHPLC-UV-MS, zabilježeno od N1 do N8 u rastućem redoslijedu vremena zadržavanja (Tabela 1). Maseni spektri elektrospreja u pozitivnom modu pokazali su pikove jona [M plus H] plus na m/z 579 za N1 do N6, hipotetički odgovara dimeru formiranom jednostrukom vezom između dvije katehinske jedinice, i [M plus H] plus na m/577 za N7 i N8, hipotetički sugerirajući formiranje dodatne veze.
Ovih osamoksidacijafrakcije su potencijalno uočene nakon hemijske depolimerizacije frakcije tanina u prethodnim radovima [25,26] i mogle bi biti iste kao one koje su već opisali Guyot et al. [20], čak i ako su eksperimentalni uvjeti bili malo drugačiji. Zaista, u ovoj prethodnoj studiji, sirovi ekstrakt PPO je korišten na pH3 i 6 za dobivanje osam frakcija. U ovoj studiji, tri različita enzima su upoređena na pH 3,6 u modelnoj otopini vina. LC-MS komparativna analiza glavnih oksidacionih frakcija dobijenih sa tri različita enzima (lakaza iz Trametes Versicolor, lakaza iz Botrytis cinerea i polifenol oksidaza ekstrahovana iz grožđa) prikazana je u tabeli 2. Za svaku od osam frakcija, vremena retencije su bila skoro identična sa različitim enzimima, a sličan m/z je određen MS analizom. Ovi rezultati podržavaju hipotezu da su iste frakcije dobijene za svaki enzim, koji sadrže proizvode sa strukturama sličnim onima koje su pretpostavili Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano i Ros Barcel6 [27] su također izveli komparativnu studiju proizvoda oksidacije (plus)-katehina s dva različita enzima: peroksidazom i polifenol oksidazom, oba ekstrahirana iz jagoda. Zaključili su da su proizvodi dobiveni s dva enzima kvalitativno isti. Dodatno jedinjenje pod nazivom N4' sa m/z=578 Th i Rt=15.66 min uočeno je u eksperimentima s lakazom iz Botrytis cinerea i ekstrahiranim PPO, ali ne i sa lakazom iz Trametes Versicolor, što ukazuje na moguće razlike u reaktivnosti za ove enzime.
2.2. Proučavanje i optimizacija fizičko-kemijskih parametara na 1H-NMR fenolnim i alifatskim OH signalima
Strukturna karakterizacija dimera procijanidina može se dobiti NMR analizom. Konkretno, precizna pozicija veze između jedinica može se odrediti korištenjem HMBC i/ili ROESY korelacijskih spektra [28,29] (Slike S2 i S3). U slučaju veze eterskog tipa (COC), atribucija protona hidroksilnog signala je neophodna. Također može biti ključno u slučaju CC veza ako se neki alifatski ili aromatični protoni preklapaju ili ako nedostaju neke ključne korelacije. Međutim, čak i u aprotonskom otapalu, hidroksilni protoni polifenola često se pojavljuju kao široki signali iz kojih se ne mogu dobiti nikakve strukturne informacije [30]. Ovo pitanje je provizorno obrađeno dodavanjem tragova
Cd(NO3)2 u rastvorima uzoraka. Zaista, 'H široki signali OH grupa su posljedica intermolekularne izmjene između ovih OH protona i drugih protona u otapalu ili otopljenoj tvari. Smanjenjem međumolekularnih veza, prisustvo kadmijum nitrata u uzorcima može smanjiti ovu razmenu, čime se poboljšava oštrina signala OH protona.
2.2.1. Učinak dodatka kadmijuma
Nakon sušenja zamrzavanjem, pet frakcija N2, N3, N4, N6 i N8 rastvoreno je u acetonu-dg. Zatim su 1D protonski NMR spektri dobijeni na 25 stepeni prije (slika 2A) i nakon dodavanja malih količina kadmijuma (slika 2B). U čistom acetonu-d., fenolni OH protoni svih frakcija su se pojavili kao široki pikovi. Nakon dodavanja kadmijuma, ovi protoni su pokazali visoko razlučene signale u slučaju frakcija N6 i N8, dok su za frakcije N2, N3 i N4 signali bili samo malo oštriji. Takođe treba napomenuti da povećanje sadržaja Cd nije imalo uticaja na rezoluciju OH signala, jer nije primećena oštrina ili širina vršne linije kada su uzastopne male količine Cd dodane uzorcima (podaci nisu prikazani).
Visoko razlučeni fenolni OH signali iz proizvoda N2, N3 i N4 postignuti su zahvaljujući dodatnom sušenju i resolubilizaciji (Slika 2C,D).
Razlika u ponašanju nakon dodavanja Cd između frakcija može se objasniti jačinom molekularnih interakcija: jače u slučaju N2, N3 i N4 u poređenju sa N6 i N8, pri čemu je neophodan dalji korak da se ove veze prekinu.
Ovaj dodatni korak može biti ključni korak kada se koristi Cd za dobivanje visoko razlučenih fenolnih OH signala u bilo kojoj situaciji, bez obzira na porijeklo uzoraka, reakciju sinteze ili prirodne polifenolne proizvode.
Prethodni rad koji se bavio nedvosmislenom strukturnom karakterizacijompolifenoldimeri koji koriste visoko razlučene OH fenolne NMR signale zahvaljujući dodavanju kadmijum nitrata objavljen je 1996. godine[30]. Prema našim saznanjima, od tada nije objavljen nijedan drugi istraživački rad koji koristi ovu metodologiju. Kasnije su poduzeta i druga istraživanja kako bi se postigao ovaj cilj, bilo dodavanjem pikrinske kiseline doziranim [31] ili korištenjem niske temperature akvizicije [32]. Ovo se može objasniti daljim korakom neophodnim za postizanje odlučujućeg efekta na oštrinu OH vrha uz dodatak Cd, kao što je gore opisano. Međutim, čini se da je kadmijum od velike vrijednosti, budući da se visoko razlučeni signali mogu dobiti bez potrebe za dodavanjem preciznih količina, za razliku od akvizicije pikrinske kiseline ili NMR spektra na niskim temperaturama.
2.2.2. Utjecaj temperature
Smanjenje temperature sa 25 stepeni C na 15 stepeni nije imalo uticaja na oštrinu fenolnih ili alifatskih OH signala. Ipak, pomaci u donjem polju izmjenjivih protonskih pikova omogućili su nam da odvojimo neke preklapajuće fenolne i alifatske OH signale, čineći njihovu identifikaciju očiglednijom (slika 3). Smanjenjem temperature došlo je do smanjenja brzine izmjene protona i moglo bi se očekivati oštrije alifatske OH pikove [31]. Temperatura od 15 stepeni očigledno nije dovoljno niska da bi se dobili dobro razlučeni alifatski OH signali. Međutim, to nam je omogućilo da jasno identifikujemo rezonanciju dva alifatska OH protona u uzorcima N3 i N6 i jednog u uzorku N8. Spektar uzorka N2 takođe je pokazao dva signala alifatskih protona OH, koji su se razlikovali na 25 stepeni C nego na 15 stepeni (slika 2E). U slučaju uzorka N4, signali koji proizilaze iz alifatskih OH bili su samo delimično vidljivi u spektri, bilo da je temperatura postavljena na 25 stepeni ili na 15 stepeni C, zbog stalnog preklapanja (slika 2E).
2.3. Strukturna karakterizacija dimernih standarda—NMR spektralna analiza
NMR spektri frakcija N2, N3, N4, N6 i N8 pokazali su da su oksidacioni proizvodi visoke čistoće jer su intenziteti signala drugih detektovanih jedinjenja bili manji od 10 procenata u poređenju sa onima ovih proizvoda.
U svim spektrima mogu se razlikovati četiri lH područja hemijskog pomaka tipična za katehinske jedinice (slika 2C): signali alifatskih protona piranskih prstenova (C prstenovi) nalaze se u području od 2,3 do 5.0 ppm, i one aromatičnih signalnih protona rezorcinolnih prstenova (A prstenovi) i kateholnih prstenova (Donosi) od 5,5 do 6,3 ppm i 6,3 do 7,1 ppm, respektivno. Signali OH fenola i A i B prstena pojavili su se od 7,1 do 10 ppm. NMR spektri obje frakcije pokazali su prisustvo različitih signalnih skupova katehinskih jedinica u konstantnom omjeru intenziteta: dva seta signala su uočena u spektrima frakcija N2, N3, N6 i N8 u skladu sa prisustvom dimera, i četiri seta u N4 spektrima, koji mogu odgovarati jednom tetrameru, dva dimera ili mješavini različitih oligomera, odnosno jednom trimeru plus jednom monomeru. Da bi se odredio stepen oligomerizacije proizvoda prisutnih u frakciji N4, izveden je 'H DOSY eksperiment koristeći mješavinu koja sadrži alikvote obje frakcije N4 i N2. Koeficijenti difuzije svih signala pokazali su slične vrijednosti (slika 4), što ukazuje na prisustvo dva dimera katehina u frakciji N4.
Zahvaljujući potpuno razriješenim signalima OH fenola koji daju pouzdane kvantitativne rezultate, tip veze između katehinskih jedinica može se direktno zaključiti iz integracije površine vrha. Dakle, za obje frakcije, N3 i N6, nedostatak jednog OHfenola (koji pripada ili rezorcinolu ili kateholnom prstenu) i nedostatak jednog aromatičnog protona resorcinola ukazuje na međuflavansku vezu (IFL) eterskog tipa što implicira opoziciju u A ili B prsten i C6 ili C8 pozicija u A prstenu. U slučaju uzorka N2 nedostajala su dva aromatična protona, jedan iz B prstena i jedan iz A prstena, što implicira CA-CB IFL. 1D 'H spektar frakcije N4 pokazao je da nedostaju dva protona B prstena, kao i dva protona A prstena. Veze između dimer jedinica frakcije N4 su stoga oba tipa CC. Spektri frakcije N8 su se prilično razlikovali od četiri druga. Neki signali su bili tipični za katehinske jedinice, u kojima su nedostajala tri OH fenola, jedan aromatični prsten A i jedan proton B prstena, kao i jedan alifatski OH. S druge strane, neki drugi NMR signali su atipični za katehinsku jedinicu: metilen sa zaslijepljenim 13C hemijskim pomacima (~40 ppm) i ketonska grupa (~192 ppm).
Sistemi protonskog spina C, A i B prstenova su određeni korišćenjem 'H 1D i 1H 2D TOCSY spektra (nije prikazano). U spektrima frakcija N2, N3, N6 i N8 uočena su dva ABMX C-ring sistema (tipična za katehin), a četiri za frakciju N4. U spektrima frakcija N2, N3, N6 i N8, dva meta-spregnuta dubleta (J~2Hz) i jedan u aromatičnom području A prstena su dodijeljeni, respektivno, protonima A prstena nevezane katehinske jedinice i na rezidualni proton prstena C6-ili C8-vezane katehinske jedinice. U spektrima N4, zbog prisustva dva dimera, detektovana su i dodeljena četiri meta-spregnuta dubleta i dva singleta kao što je gore opisano. Protonski sistemi B prstena su takođe lako određeni iz ovih spektra i omogućili su nam da identifikujemo dva ABM protonska spin sistema za dimere frakcija N3 i N6, dok su jedan ABM i jedan AB protonski spin sistemi detektovani za dimer N2, a jedan ABM i jedan AM proton spin sistem za dimer N4. Dimer N8 je pokazao samo jedan spin sistem ABM B-prstena tipičan za katehin monomer.
2.3.1. Određivanje položaja A prstena IFL dimera frakcija N2, N3, N4 i N6
Uspostavljanje mosta koji se nalazi na A prstenu dimera (tj. C6A-ili C8A-pozicija) zahtijeva pripisivanje rezidualnog HA protona CA-povezane katehinske jedinice. Zahvaljujući visoko razlučenim fenolnim OH signalima, laka početna tačka bila je identifikacija dva OHfenol protona jedinica vezanih za A, tj. A prstena koji
had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm) koji se lako pripisuju C7A i C8A, respektivno. Jednom kada su C6A i C8A dodijeljeni, rezidualni HA proton se može direktno pripisati HSQC spektrima. Tako je utvrđeno da je ovaj rezidualni HA proton bio H6A za sve frakcije N2, N3, N4, N6. IFL između katehinskih jedinica je stoga implicirao C8A poziciju za sve dimere.
2.3.2. Određivanje položaja B prstena IFL-a
Dimeri frakcija N2 i N4. Spektri frakcije N2 pokazali su dva različita tipa protonskih spin sistema B prstena: jedan AMX koji odgovara B prstenu nepovezane jedinice i jedan AM sa konstantom spajanja od oko 8 Hz, karakterističnom za H6'B i H5' B C2'B-povezane jedinice. Veza između jedinica N2 dimera je stoga C2'B-C8A. NMR spektri frakcije N4 su takođe pokazali različite B spin sisteme: dva AMX, koja odgovaraju nevezanom B-prstenu, i dva AXspin sistema, oba prikazuju konstante spajanja od oko 2 Hz, koje su karakteristične za H2'B i H6' B protoni C5'B-povezanih jedinica. Prisustvo korelacija dugog dometa 'H/13C između H6'pojasa C8A, koje su uočene u HMBC spektrima dva dimera, u skladu je sa C5/'B-C8A vezom (Slika 5).
Dimeri frakcija N3 i N6. Spektri frakcija N3 i N6 su pokazali prisustvo dva AMX protonska sistema B-prstena i nedostatak jednog OH fenolnog signala. Pošto su identifikovani svi OHA fenolni protoni dimernih jedinica (kao što je gore opisano), nedostajući OH fenolni signal može biti ili OH3'B ili OH4'B.
Položaj OH (3'B ili 4'B) može se lako odrediti kroz ROE korelacije sa H2'Bor H5'B, odnosno korištenjem dugotrajnih HMBC korelacija kao što je ilustrovano na slici 5.
Atribucija zaostalog OH prstenova B je lako izvedena korištenjem HMBC ili ROESY korelacija dugog dometa, kao što je ilustrovano na slici 5. U slučaju dimera N3, uočena je korelacija ROE između H5'B i zaostalog OH 'B katehinske jedinice povezan preko svog B prstena. Ovaj OH je stoga identificiran kao OH4'B. U slučaju frakcije N6, rezidualni OH'B je pripisan OH3'B, pošto je uočena korelacija ROE između ovog OH i H2'B. Dugoročne HMBC korelacije su u skladu sa ovim atribucijama. Položaji veza ova dva dimera su zatim određeni na sljedeći način: CO3'B-C8A i CO4'B-C8A za N3 i N6. respektivno.
Frakcija N8. Analiza spektra dimera N8 pokazala je da je jedna jedinica ovog dimera katehin sa dva položaja veza jedan na A prstenu, jedan na C8A, a drugi na poziciji C-O7A, budući da su protoni H8A i OH7A nedostaje. Druga jedinica ovog dimera pokazala je jedinstvene spektralne karakteristike, što ukazuje na gubitak aromatičnosti B prstena i prisustvo nekoliko pozicija veze na B i C prstenu.
'H NMR signali koji proizlaze iz B prstena bili su dva dubleta na 2,49 i 2,71 ppm, pokazujući geminalnu spregu od ~15 Hz (12,03 ppm) tipično za metilensku grupu i singlet na 6,38 ppm koji proizlazi iz etilenskog protona. Pošto ovi protoni metilena i etilena nisu bili spregnuti, vjerovatno će biti na pozicijama 2'B i 5'B. HIMBC spektar je pokazao sve korelacije, omogućavajući precizne atribucije ovih ugljenika B prstena, kao što je ilustrovano na slici 5. H2C ove jedinice dao je tri korelacije sa ugljenicima B prstena: jedna je metilenski ugljenik na ~45 ppm, što se pripisuje C2'B, i preostala dva, sa ugljicima koji rezoniraju na ~90 ppm i ~162 ppm, što se može pripisati C1'B i C6'B.H5'B dalo je samo jake 3J korelacije sa dva kvartarna ugljika ovog B prstena : jedan je ugljenik koji je prethodno pripisan C3'B (~95 ppm), a drugi, koji je rezonirao na ~90 ppm, stoga se može pripisati C1'B. Tada je zaključeno da je ugljenik na ~162 ppm C6'B.
Prisustvo alifatskog OH (~5,8 ppm) na poziciji C3'B (~95 ppm) određeno je preko njegove ROE korelacije sa oba H2'B protona. Nadalje, OH3/B je dao HMBC korelaciju sa kvaternarnim ugljikom na ~192,5 ppm, karakterističnom za ketonsku grupu na poziciji C4'B.
Zaštita ovog C1'B od oko 40 ppm je u skladu sa gubitkom aromatičnosti B prstena. Nadalje, nedostatak OH na poziciji C7A druge jedinice je u skladu sa eterskom vezom C1'BO-C7A.
NMR podaci su pokazali da C prsten ove jedinice nema OH3C. Prisustvo C3C-O-C3'B veze je u skladu sa zaštitom C3C od oko 1,5 ppm, kao i hemijskim pomakom C3'B koji je tipičan za hemiketalni ugljenik (95 ppm).
Sve u svemu, NMR spektralni podaci nam omogućavaju da zaključimo da ovaj dimer odgovara dehidrokatehinu A koji su ranije opisali Winges et al.[33] a zatim od Guyot et al.[20].
Strukture šest dimernih jedinjenja utvrđenih ovim NMR analizama prikazane su na slici 6, N2, N3, N6 i N8 su čisti proizvodi, a N4 je mešavina dva izomera.
3. Materijali i metode
3.1. Hemikalije
( plus ) - katehin hidrat Veći ili jednak 98 posto ; lakaza iz Trametes Versicolor (0.94 U·mg-1); natrijum fosfat dvobazni dihidrat Veći ili jednak 98 posto; limunska kiselina (ACS reagens, kadmijum nitrat tetrahidrat 99,997 posto; mravlja kiselina i Amberlite XAD7HP su dobijeni od Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, SAD). Aceton-dg je kupljen od Euriso-top (Saarbrüicken, Njemačka), kiselina (TFA) iz Roth Labo (Karlsruhe, Njemačka). Voda LC-MS, acetonitril LC-MS (ACN) i metanol LC-MS (MeOH) su svi iz VWR (Radnor, PA, SAD).
3.2. Priprema modelnog rastvora vina
Model rastvora vina bio je rastvor etanola/vode (12/88;o/o) sa 0.033 M vinske kiseline, podešen na pH 3,6 sa NaOH 1 M [34].
3.3. Ekstrakti sirovog grožđa PPO
Ekstrakt PPO je pripremljen kao što su prethodno opisali Singleton i saradnici.[35]. Smrznuto grožđe je prvo pomiješano u acetatnom puferu (1,5 M, pH5; 10 gL-I askorbinske kiseline). Smjesa je zatim filtrirana i centrifugirana (3000 g; 10 min). Ostatak je na kraju ispran acetonom (80 posto) i osušen na zraku.
3.4. Laccase iz Botrytis Cinerea
Lakaza iz Botrytis cinerea dobijena je kako su opisali Quijada-Morin et al.[36]. Proizveden je od soja VA612 (sakupljen 2005 u vinogradu u Hautvillersu, Champagne, Francuska, od sorte Pinot Noir). Ukratko, kulture na čvrstoj podlozi sladnog kvasca ostavljene su nedelju dana na 24 stepena pod plavim svetlom. Spore su zatim ostrugane i inokulirane u Erlenmajerovu tikvicu od 500 mL koja je sadržavala 125 mL podloge za kulturu (4{{30}} gL-1glukoze, 7 gL{{10}}glicerol, 0,5 g·L-1L-histidin,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L-1KH2PO4 i 0.7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Nakon 3 dana inkubacije i 2 dana rasta u istom prethodnom mediju, predkulturama je dodana galna kiselina (2 gL-1). Nakon 5 dana, tečni medijum je filtriran, a supernatant je podvrgnut tangencijalnoj filtraciji u Quixstand sistemu za filtraciju (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Engleska) opremljen sa 30 kDa-molekulskom težinom odsečenom membranom. Koncentrat je na kraju podvrgnut dijafiltraciji protiv destilovane vode, a zadržane su samo frakcije koje su pokazale oksidacionu aktivnost prema ABTS (-80 stepen).
3.5. Postupak oksidacije
Otopina lakaze (1 gL-1) u fosfatno-citratnom puferu je prethodno pripremljena i dodata u 6g.L-1( plus )-katehin otopine (model vino) da se dobije konačna koncentracija lakaze od { {6}}.3 gL-1. Dobijeni rastvor je zatim lagano mešan (180 rpm) na sobnoj temperaturi 2 h. Koncentracije su prethodno optimizirane, a eksperiment je izveden u tri primjerka.
3.6. Zaustavljanje reakcije na smolu Amberlite XAD7HP
Amber lite kolona je kondicionirana sa etanolom (apsolutnim) i isprana sa dvije zapremine kolone mili-O vode. Prethodni medij za reakciju lakaza/( plus )-katehin kapao je na kolonu i prvo je eluiran sa dvije zapremine kolone milli-Q vode [37]. Kolona je zatim eluirana etanolom sve dok sakupljena frakcija nije obojena. Samo frakcije etanola su zadržane, isparene i liofilizirane. Prašak je pohranjen na -80 stepen do upotrebe.
3.7.Procedura prečišćavanja dimerne frakcije pomoću fleš hromatografije
Liofilizirani prah je prvo pročišćen korištenjem sistema fleš hromatografije puriflash430 opremljenog UV detektorom postavljenim na 280 nm i Puriflash diol 50 um f0025 kolonom. Binarna mobilna faza se sastojala od acetonitrila (rastvarač A) i metanola (rastvarač B), oba zakiseljena sa 0,1 posto TFA. Serija injekcija je izvedena pri konstantnoj brzini protoka od 20 mL·min-1, koristeći sljedeći gradijent: 100 posto A tokom 4,4 min; 0-10 posto B za 10 min; 10 posto B za 5 min; 10-90 procenat B za 5 min; 90 procenata B za 3 min;90-10 procenat B za 2 min; 10 procenata B za 10 min. Zapremina injekcije bila je 1 mL (300 mg liofiliziranog praha otopljenog u 1 mL rastvarača A). Svaki put su sakupljene tri različite frakcije. Prvi je odgovarao rezidualnom ( plus )-katehinu, a treći je bio mješavina polifenola visoke molekularne težine. Druga eluirana frakcija, koja sadrži mješavinu dimernih oksidacijskih proizvoda, je uparena i liofilizirana prije drugog koraka prečišćavanja.
3.8. Postupak prečišćavanja proizvoda oksidacije iz dimerne frakcije korištenjem polupreparativnog kromatografskog sistema
Frakcija koja sadrži produkte dimerne oksidacije je pročišćena korištenjem polupreparativnog Bio-Rad NGC 10 hromatografskog sistema srednjeg pritiska opremljenog Varian Dynamax C18 Microsorb kolonom obrnute faze (250 × 21,2 mm; 3 um). Binarna mobilna faza sastojala se od milli-O vode (rastvarač A) i 80 posto acetonitrila, 20 posto Milli-Q vode (rastvarač B), oba zakiseljena sa 0,05 posto TFA. Serija injekcija (300 μL) liofiliziranog praha (20 mg rastvorenih u 200 uL rastvarača A i 100 uL ACN) izvedena je pod sljedećim uslovima eluiranja: 100 posto A tokom 4 min; 0-35 posto B za 46 min;35-100 posto B za 2 min; 100 posto B za 5 min. Svaki put je prikupljeno osam različitih frakcija, što odgovara čistim UPLC signalima na 280 nm. Svaka frakcija je uparena i liofilizirana prije NMR analize.
3.9. Priprema uzorka za NMR analizu
Otprilike 1 mg svakog liofiliziranog praha ponderiranog u Eppendorf epruvetama raztopljeno je u 500 μL acetona-dg. Zatim je uzorcima dodato ~10 uL koncentrovanog rastvora kadmijum nitrata u acetonu-d, a dobijeni rastvori su prebačeni u 5 mm NMR cevi za NMR analizu. Dodatni korak je izveden za neke uzorke: nakon solubilizacije liofiliziranih prahova u acetonu-dg u prisustvu kadmijuma u tragovima, uzorci su upareni do suha, a zatim ponovo rastvoreni u acetonu-d bez daljeg dodavanja Cd.
3.10. Specifikacije instrumenta
UPLC-MS analiza. Reakcije su praćene pomoću dva UPLC-MS sistema. Prvi je korišten za preciznu identifikaciju vremena zadržavanja proizvoda korištenjem metode dugog gradijenta. tj. Watersova tečna hromatografija ultra-visokih performansi reverzne faze spojena sa masenom spektrometrijom (UHPLC-MS). Sistem tečne hromatografije bio je Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, SAD) opremljen detektorom fotodiodnog niza. Koristili smo Acquity UPLC HSS T3 kolonu (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Temperatura kolone je bila 25 stepeni. Binarna mobilna faza sastojala se od 0.1 posto mravlje kiseline u vodi (rastvarač A) i acetonitrila (rastvarač B). Odvajanje je izvršeno pri konstantnoj brzini protoka od 0.25mL·min-1, koristeći sljedeći gradijent:8-11 procenat B za 2 min; 11 procenata B za 8 min; 11-25 procenat B za 15 min;25-55 procenat Bin 5 min;55-99 procenat Bin 1 min;99 procenata B za 4 min;99-8 procenat Bin1 min;8 procenat B za 4 min. Zapremina injekcije bila je 5 μL. Maseni spektrometar je bio Waters Acquity QDa electrospray ionization (ESI) jednostavni kvadrupol (Waters, Milford, MA, USA). Kapilarski napon je postavljen na 0,8 kV. Maseni spektri su dobijeni u rasponu masa od 200-900 Razblažite mod pozitivnih jona.
Drugi UHPLC-MS sistem, korišćen za brzu verifikaciju tokom koraka prečišćavanja, bio je isti kao što je prethodno opisano, sa Acquity UHPLC HSS T3 kolonom (1,8 μm, 2,1×100} mm) zagrejanom na 38 stepeni. Odvajanje je izvršeno pri konstantnoj brzini protoka od 0,55 mL·min{10}}, koristeći sljedeći brzi gradijent: 0.1-40 posto B za 5 min; 40-99 posto B za 2 min; 99 posto B za 1 min; 99-0.1 posto B za 1 min. Zapremina injekcije bila je 2 μL. Maseni spektrometar je bio Bruker Amazon X elektrosprej jonizacija (ESI) jonska zamka (Bruker Daltonics, Bremen, Njemačka). Kapilarski napon je postavljen na -5.5 kV. Maseni spektri su dobijeni u rasponu masa od 50-2000 Razblažite mod pozitivnih jona.
Sve UPLC-MS analize su izvedene u tri primjerka.
NMR instrumentacija. Svi NMR spektri su snimljeni na spektrometru Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), koji radi na 500,05 i 125,74 MHz za jezgra protona i ugljika-13, Koristeći sondu za indirektnu detekciju od 5 mm opremljenu gradijentom zavojnice.1D'H i 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY i ROESY, a heteronuklearni lH/13C HSQC i HMBC eksperimenti su izvedeni korištenjem klasičnih impulsnih sekvenci i analizirani korištenjem VNMRJN4.2 i Mest4N .1 (Mestrelab Research, Španija) softver. DOSY mjerenja su dobijena i obrađena kao što je prethodno opisano 38]. Parametri akvizicije DgcsteSL impulsne sekvence bili su sljedeći: vrijeme kašnjenja difuzije i širina gradijenta impulsa postavljeni su na 50 ms i 2 ms, respektivno, jačina gradijenta (g) je povećana u 16 koraka sa jednakim razmakom g2 od 0,3 do 32G·cm-I. Nakon korekcije faze, 2D DOSY spektri su konstruisani na osnovu merenja visine vrha korišćenjem softvera VNMRJ4.2.
Svi spektri su referencirani na signale otapala aceton-dg ('H rezidualni signal na 2,05 ppm i 13C signal na 29,92 ppm).
4. Zaključak
Ispitivano je djelovanje tri različite oksidoreduktaze (polifenol oksidaze ekstrahirane iz grožđa, lakaze iz Botrytis cinerea i lakaze iz Trametes Versicolor) na (plus)-katehin, a rezultujući profili LC-UV-MS su bili vrlo slični, iako su se male razlike ukazuju na moguće razlike u reaktivnosti ovih enzima.
Strukture šest proizvoda oksidacije katehin-lakaza (koristeći lakazu iz Trametes Versicolor) dobijene su na osnovu specifičnih NMR potpisa (četiri čista proizvoda, tj. N2, N3, N6 i N8 i N4, koji odgovaraju mješavini dva izomera). Potpuna atribucija fenolnih OH signala bila je moguća zahvaljujući dodavanju kadmijum nitrata uz postupak pripreme uzorka koji je omogućio nedvosmislenu atribuciju veza između katehinskih jedinica za neka od jedinjenja od interesa. Ovaj postupak će uvelike pojednostaviti NMR analizu mješavina polifenola, sintetiziranih ili ekstrahiranih iz prirodnih proizvoda.
Standardi dobijeni u ovom radu mogu se u budućnosti koristiti kao markeri oksidacije za ispitivanje njihovog prisustva i evolucije tokom zrenja grožđa i starenja vina. Osim katehina, druga polifenolna jedinjenja, uključujući flavonoide i ne-flavonoide, takođe se mogu koristiti kao supstrati lakaze za dobijanje dodatnih novih standarda.
Skraćenice
NMR: nuklearna magnetna rezonanca,
Cd: kadmijum,
TOCSY: totalna korelaciona spektroskopija,
ROESY: nuklearna spektroskopija Overhauserovog efekta s rotirajućim okvirom,
HSQC: heteronuklearni jednokvantni korelacijski eksperiment,
HMBC: heteronuklearna višepojasna povezanost,
DOSY: difuzijsko uređena spektroskopija.
Reference
1. Khan, N.; Mukhtar, H. Polifenoli čaja za promicanje zdravlja. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]
2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Karakterizacija novih flavan{2}}ovih derivata u fermentiranim zrnima kakaa. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]
3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polifenoli iz kakaa i vaskularno zdravlje—kritički pregled. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]
4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Koncentracije polifenola iz ekstrakta komine borovnice pomoću nanofiltracije. Food Bioprod. Proces. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]
5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterizacija polifenola i procjena antioksidativnog kapaciteta u komi grožđa Cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]
6. Saucier, C. Kako se polifenoli vina razvijaju tokom starenja vina? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]
7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Oksidacijski mehanizmi koji se javljaju u vinima. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]
8. Singleton, VL Kiseonik sa fenolima i srodne reakcije u sistemima mošta, vina i modela: zapažanja i praktične implikacije. Am. J. Enol. Vitić. 1987, 38, 69–77.
9. Mathew, AG; Parpia, HAB smeđanje hrane kao reakcija polifenola. In Advances in Food Research; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, SAD, 1971; Tom 19, str. 75–145. [CrossRef]
10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evolucija fenolnih jedinjenja i oporost tokom starenja crnog vina: efekat izlaganja kiseoniku pre i posle flaširanja. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]
