Dva triterpenoida iz listova Rubus Fraxinifolius i njihove aktivnosti inhibicije tirozinaze i elastaze

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Brojna terapeutska jedinjenja izolovana su iz prirodno bogatih organskih resursa, koji mogu ponuditi ekonomične i održive izvore jedinjenja sa sigurnim i efikasnim biološkim aktivnostima. U kozmetičkoj industriji, prirodna jedinjenja sa djelovanjem protiv starenja željno su tražena. Stoga smo pripremili različite ekstrakte iz listova Rubusfraxinifolius i koristili testove inhibicije enzima da izolujemo spojeve sa zaštitnim efektom protiv starenja kože. Iz Rubus fraxinifolius Poir izdvojena su dva triterpenoida. listovi. Strukture su okarakterisane spektroskopskim analizama (LC-ESI-MS,1D/2D NMR) i poređenjem sa prijavljenim podacima. Jedinjenje 1 i 2 su određeni kao 2,3-O-etilen glikol,19-hidroksiurs-12-en-23,28-dioična kiselina i 2,{{15} }O-propandiol,19-hidroksiurs-12-en-28-enska kiselina. Ekstrakt metanola i izolati su procijenjeni zbog njihovog inhibitornog djelovanja na elastazu i tirozinazu. Jedinjenja 1 i 2 su inhibirali elastazu sa ICso 122,199 ug/mL i 98,22 ug/mL, a takođe su inhibirali tirozinazu sa ICso 207,79 ug/armija i 221,51 ug/mL, respektivno. Molekularno spajanje je pokazalo da oba spoja imaju afinitet prema enzimima.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Iako ih je teško postići, prirodne supstance protiv starenja koje su sigurne za ljude mogu se ekonomično i održivo prikupiti iz bogatih prirodnih resursa. Oko 700 vrsta Rubusa (Rosaceae) rasprostranjeno je globalno, iako je nekoliko vrsta pronađeno u tropima. Ovaj rod sadrži nutrijente (šećer, vitamine, itd.), sekundarne metabolite (triterpenoide, flavonoide, polifenole, itd.), i ima mnogo aktivnosti protiv starenja (antioksidans, ant elastaza, ant tirozinaza, anti-kolagenaza, anti-UV, protuupalno, zacjeljivanje rana, itd.)1. Osim toga, vrste Rubus su također prijavile da sadrže različite triterpene s različitim biološkim aktivnostima -'.

U Indoneziji, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) je rasprostranjen na Javi, Borneu, itd., i popularno poznat kao "urbani".šta je cistancheŠtoviše, neki lokalni farmeri beru ove biljke, a bobičasto voće se obično konzumira svježe ili smrznuto. Naša prethodna studija je pokazala da ekstrakt stabljike R. frascinifolius ima aktivnost da inhibira elastazu, tirozinazu i kao antioksidans8. Neka druga istraživanja su također pokazala da list i plod R. fraxinifolius imaju snažno antioksidativno djelovanje?10. Međutim, istraživanje R. fraxinifolius je malo istraženo, a nisu prijavljivane nikakve studije o hemijskim komponentama.

Cistanche može protiv starenja

Elastaza je enzim serin proteaze, koji ima ključnu ulogu u naboranju ili opuštanju kože kroz degradaciju dermalnog elastičnog vlakna (elastina) i uzrokuje gubitak elastičnosti kože. Jedna od njih je elastaza izvedena iz fibroblasta kože. Tako su inhibitori elastaze, kao moderatori degradacije elastinskih vlakana koja uzrokuje starenje kože, privukli pažnju kao agensi za kozmetičke preparate,12. Melanogeneza je posredovana tirozinazom i reguliše biosintezu melanina kroz dvostepenu reakciju. U početnom koraku, L-tirozin se hidroksilira u L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA). U drugom koraku, L-DOPA se oksidira u odgovarajući O-kinon. Stoga se prirodna jedinjenja sa inhibicijskim djelovanjem tirozinaze obično koriste u kozmetici koja inhibira hiperpigmentaciju melaninom i stoga pogoduje izbjeljivanju kože.Cistanche protiv starenjaInhibitori enzima elastaze i tirozinaze mogu se razviti kao sredstva za izbjeljivanje kože, sredstva protiv starenja ili protiv bora za liječenje dermatoloških poremećaja44.

Ova studija je izolovala triterpenoide ursana iz listova R.fraxinifolius i razjasnila njihovu strukturu u spektroskopskim analizama korišćenjem masene spektroskopije ionizacije elektrosprejom (ESI-MS) i 'H NMR, |3CNMR i 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC i HMBC). Nakon toga, izvršili smo testove inhibitornih aktivnosti na elastazu i tirozinazu sirovih ekstrakata, frakcija i izolovanih jedinjenja.

U ovom istraživanju kroz in silico metodu je promatrana i aktivnost dva odabrana spoja. Pristup molekularnom spajanju izveden je sa DockThorl516. Makromolekule korištene u ovom istraživanju su dobijene iz banke podataka o proteinima (RCSB PDB, 2000) sa identitetima 2y9x i 3hgp za tirozinazu i elastazu, odnosno l718. primećeni su sa PyMOL1920.

Rezultati i diskusija

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 posto u 100 ug/mL, dok ekstrakt n-heksana nije imao nikakvu aktivnost (slika 1). Neki Rubusi su također pokazali aktivnost inhibicije elastaze, kao što je R. Sanctus (procentna inhibicija 14.68-49.20 u 100 ug/mL), R.compactus,R. robustus, itd.221. Stoga smo frakcionirali aktivne ekstrakte korištenjem vakuum tečne hromatografije/VLC i sakupili ll frakcije iz svakog. Frakcije iz ekstrakta etil acetata pokazale su slabu inhibitornu aktivnost elastaze (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Izolati su identificirani i okarakterizirani pomoću tečne hromatografije-masene spektroskopije (LCMS), 'H i 13CNMR, DEPT, heteronuklearne jednostruke kvantne koherencije (HSQC), heteronuklearne višestruke kvantne korelacije (HMQC) i heteronuklearne korelacije višestrukih veza (HMBC). Tabela 1, pokazuje NMR spektralne podatke jedinjenja.

Jedinjenje 1: je izolirano kao amorfni bijeli prah. LCMS-ESI spektri za ovo jedinjenje pokazali su molekularni pik jona na m/z 543,32[MH]t, sugerirajući molekulsku formulu C32H48O- sa devet ekvivalenata nezasićenosti. IR spektri su otkrili maksimume apsorpcije koji odgovaraju hidroksilu (3,343,4 cm-l) i olefinske (1,684 cm{14}}) funkcionalne grupe. Štaviše, 'H NMR spektri jedinjenja I otkrili su metin proton (CH) singlet signal na 2,6, karakterističan signal za H-18 tipa ursana triterpeni sa 19-O-zamjenama. Triterpenski tip 19a-hidroksi-ursan takođe ima tipičan protonski signal u području oko 2,6 ppm. Ovaj nezaštićeni signal može se značajno razlikovati od drugih signala ordinalnih I metilen protona, sa karakterističnim pomakom zbog olefinskog protona (H12) na oko 5,28 (t, J=6 Hz).cistanche benefíciosPotpune i nedvosmislene 'H i l3C dodjele hemijskog pomaka potpomognute su HMQC(13Cx'H) i HMBC(15Cx'H) spektrima. Od HMBC ukrštenog vrha, potvrđeno je da je proton na ou 2,60 H{ {5}}(Sl.2a). Ostali specifični karakteri pronađeni su za pet metilnih singleta na 1.89,1.02,0.82,1.32,1.20(svaki,H24-27;29), metil dublet na og 0.92(d, J=6 Hz), i signal olefinskog protona na 5,30(t, J=7 Hz, H-12). Sadašnji 13CNMR spektri pokazuju 32 ugljične rezonancije, a sa DEPT i HMQC spektrima, prikazuju dva karbonilna ugljika (δC183.70,C-28 i 8-178.96,C-23), olefinski ugljik na oc 127.23,C-12,olefinski kvaternarni ugljenik (oc139.49,C-13), kvaternarni ugljenik koji nosi kiseonik （o-72.7, C-19 ）, deset alifatskih metilena i šest metilnih ugljenika. Dva olefinska ugljenika na δ-127.23(C-12) i 139.49(C-13) su bila karakteristična za tip ursan-triterpenoida. Drugi signal koji ukazuje na prisustvo etilen glikola (-OCH-CH-O-) prikazan je na signalima na δ4.62 (d, J=11.5 Hz), 4.05 (d, J=11). 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）i 4.06（d, J=11.5Hz）i podržani sa δ61.27（t）i 63.20（t）. Nalazio se na C-2iC-3 na osnovu prisustva korelacije dugog dometa u HMBC spektrima. Stoga je jedinjenje 1 identifikovano kao 2,3-O-etilen glikol,19-hidroksiurs-12-en-23,28-dioična kiselina (slika 3a).

Jedinjenje 2: dobijeno je kao bijeli amorfni prah.MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (izračunato za 528,3815). U LCMS-ESI spektrima, pik molekularnog jona prisutan je na m/z 527,33 [MH]t, što ukazuje na molekularnu formulu CH Os, koja zahtijeva 8 stupnjeva nezasićenosti." IR spektar je sadržavao maksimume apsorpcije koji odgovaraju hidroksilu (2.927.8 cm{ {15}}) i olefinske (1,686 cm-1) funkcionalne grupe. Štaviše, 'HNMR spektri za jedinjenje 2 su pokazali singlet na 2,42, što je karakteristično za H18 triterpena tipa ursan sa {{24 }}O-zamjena.Ekstrakt Cistanche protiv zračenjaDrugi specifični karakteristični spektri uključivali su prisustvo šest metil singleta na og1.22 0.76,0.97,0.69,1.30i 1.17(svaki,H -24-28,H-30), metil dublet na 0,91 (d,J=7Hz), i signal olefinskog protona na ou 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Odgovarajući l3 (CNMR i DEPT spektri pokazuju 33 ugljične rezonancije, a HSQC i HMQC spektri ukazuju na prisustvo karbonilnog ugljika (oc 182.23, C-28), olefinskog ugljika （δ-129.36, C -12）, olefinski kvaternarni ugljik （δ-140.24, C-13）, kvaternarni ugljenik koji nosi kiseonik (oc73.68, C-19), jedanaest alifatskih metilen i sedam metil ugljenika. Ovi podaci ukazuju na to da jedinjenje 2 nosi skelet ursan-triterpenoid. Ostali signali ukazuju na prisustvo 1,3-propandiol funkcionalne grupe, na og 3.22(d,J=11 0,5 Hz), 3,42 (d, J=10, 5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) i 4,02 (d, J=11, 5 Hz) i 3,36 (t, J{) {57}}.5Hz).Njegova funkcionalna grupa ima korelaciju dugog dometa sa C2-C3. Na osnovu ovih rezultata, jedinjenje 2 je stoga identificirano kao 2,3-O-propanediol,{{ 66}}hidroksiurs-12-en-28-oična kiselina (slike 2b i 3b). Slično jedinjenje je 2,3-O-izopropiliden muči kiselina, izolovana iz Rubus xanthocarpus.7

U tabeli 1, svi 'H i ''C NMR spektri su upoređeni sa kiselinom mučenja (TA/2a,3a,19-trihidroksi-12-ursen-28-oična kiselina)², koja je ursan triterpenoid koji je pronađen u nekoliko vrsta Rubus-p Tormentična kiselina je imala jake sličnosti sa jedinjenjima 1 i 2, osim što su se hemijski pomaci vezani za C-23 i C31-33 razlikovali. Ovaj dio je također potvrđen u DEPT, HMQC i HMBC eksperimenti (Sl.2).

Triterpenoidna kiselina je široko rasprostranjena u prirodnoj biljnoj hrani. Ima različite bioaktivnosti: hipoglikemijsko djelovanje, protuupalna i anti-aterogena svojstva smanjuju proliferaciju vaskularnih glatkih mišićnih ćelija i antiproliferativne aktivnosti u ćelijskim linijama raka bubrega, prostate i melanoma2426. Stoga, budući da ova jedinjenja imaju isti kostur, oni ne mogu imati odgovarajuće potencijalne aktivnosti.

Slika 4, predstavlja inhibitornu aktivnost elastaze i tirozinaze izolata. Podaci dobijeni in vitro testovima inhibicije enzima izraženi su kao standardna devijacija (SD). Jedinjenja 1 i 2 inhibiraju elastazu sa ICso 122,199 i 98,22 ug/mL, a takođe inhibiraju tirozinazu sa ICso 207,79 i 221,51 ug/mL, respektivno. Neki pentaciklički triterpenoidi (ursolna kiselina i oleanolna kiselina) su prijavili da imaju aktivnost inhibicije elastaze2728. Vrijednost inhibicije elastaze jedinjenja 2 je niža od vrijednosti jedinjenja 1. Oba spoja su imala manju inhibicionu aktivnost od pozitivne kontrole oleanolne kiseline, koja je imala ICso vrijednost od 90,39 ug/mL. U skladu s tim, prethodne studije su pokazale ICso za oleanolnu kiselinu od 76,5 ug/mL i ICso vrijednost od 31,0 ug/ml za ursolnu kiselinu28. Prethodno objavljene kinetičke analize pentacikličnih triterpena pokazale su da ovi spojevi kompetitivno i reverzibilno inhibiraju neutrofilnu elastazu. U istoj studiji, eksperimenti molekularnog spajanja pokazali su da su molekularni dio skele 28-COOH i dvostruke veze u pentacikličkim triterpenima esencijalni za njihovu inhibitornu aktivnost

Jedan od problema koji se javlja sa starenjem je hiperpigmentacija.cistanche herbaStoga je u toku potraga za agensima za posvjetljivanje kože ili novim depigmentiranjem. Supresija tirozinaze može djelovati protiv melanogeneze". Kao što je prikazano na slici 4, metanolni ekstrakt i jedinjenja I i 2 pokazali su umjerenu aktivnost kao inhibitori tirozinaze.

U ovom istraživanju, molekularno spajanje je također korišteno za analizu aktivnosti vezivanja odabranih spojeva za tirozinazu i elastazu kao njihove mete. Korištene kristalne strukture su 2Y9X, kristalna struktura tirozinaze iz Agaricus bisporus sa inhibitorom tropolonom; i BHGP, kristalna struktura svinjske pankreasne elastaze u kompleksu sa snažnim peptidil inhibitorom FR130180. Oba su odabrana jer su dobivena iz istog organizma korištenog za in vitro test ovog istraživanja. Makromolekule su također vezane za svoje inhibitore tako da se može dobiti aktivno stanje konformacija enzima. Kokristali su korišteni kao centar molekularne mete za spajanje kako bi se suzile vjerovatnoće vezivanja jedinjenja kako bi proces bodovanja postao efikasniji.

Iz molekularnog spajanja dobijeni su prosječni afiniteti vezivanja za oba spoja kao što je prikazano na slikama 5 i 6. Predviđanje afiniteta se koristi za rangiranje različitih liganada s obzirom na gornju energetsku pozu svakog jedinjenja, predviđanje bolje energetske poze je prikazano kao niži rezultati afiniteta vezivanja16. Redocking naznačenog inhibitora tropolona je urađen sa prosječnim afinitetima vezivanja od -7.41 kcal/mol. Prosječni afiniteti vezivanja jedinjenja 1 i 2 za tirozinazu bili su -7,84 kcal/mol i -8,37 kcal/mol, respektivno (Tabela 2). Predviđeno je da oba spoja imaju bolji afinitet od inhibitora.

U međuvremenu, prosječni afiniteti vezivanja elastaseredockinga bili su -7,84 kcal/mol. Prosječni afiniteti vezivanja jedinjenja 1 i 2 za elastazu bili su -7,58 kcal/mol i -8,06 kcal/mol, respektivno. Iako je rezultat pokazao da jedinjenje 1 ima manji afinitet od kokristala, ono je malo drugačije (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Metode

Opći eksperimentalni postupci. 'H i ' NMR spektri su snimljeni na 500 MHz pomoću JEOL JNM-ECZ500R/S1 instrumenta. Infracrveni (IR) spektri su mjereni FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Ostale analize su obavljene korišćenjem Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof instrumenta, VersaMax Microplate čitača i BioTek ELX800 Microplate Reader, aluminijumskih limova obloženih lore TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Nemačka) , kolonska hromatografija (CC) izvedena je korištenjem Silika gela 60 (Merck, Darmstadt, Njemačka) sa 70-230 mrežicom za otvorenu hromatografiju i 230-400 mrežicom za vakuum hromatografiju. Biljni materijali. Listovi R. fraxinifolius sakupljeni su sa plantaže u planini Pangrango, Zapadna Java na visini od 4.343 stope, u decembru 2018. Uzorak je identifikovao botaničar (dr. Joni Setijo) u Istraživačkom centru za biologiju, Indonezijski institut za Sciences, Indonezija, sa uzorkom broj 033/IPH.1.01/If.07. Sakupljanje biljnog materijala je dobilo dozvolu od farmera i bilo je u skladu sa institucionalnim propisima i smjernicama.

Ekstrakcija i izolacija. Na zraku osušeni listovi u prahu (2300} g) ekstrahirani su korištenjem Soxhlet aparata sa gradijentom rastvarača (n-heksan, EtOAc i MeOH) kako bi se dobili odgovarajući ekstrakti, a zatim su upareni na rotacionom isparivaču i vakumsku pećnicu. Ekstrakt metanola (291 g) i ekstrakt etil acetata (65 g) su adsorbovani na silika gelu i izvedena vakuumska tečna hromatografija/VLC, eluiranjem stepenastim gradijentom EtOAc:MeOH (od 1:0 do 0:1) do proizvode frakcije za svaki ekstrakt (Eal-Hall i M1-Mill i). Slične frakcije koje su imale pozitivne reakcije sa vanilin sumpornim reagensima u TLC su kombinovane. Prinos frakcije: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); i M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }}(2.9g). Sve frakcije su ispitane na aktivnost inhibitora elastaze, Fr. M8 je dao najveći prinos i imao je snažnu aktivnost. o. M8 sukcesivno dalje razdvajanje pomoću CC preko silika gela (eluent CH2Cl2/MeOH sa stepenastim gradijentom) i pročišćavanje pomoću Sephadex LH-20 kolone (eluiranje sa CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Dvije frakcije pokazivali su čvrstu prirodu i kristalizirani su sa hloroformom i metanolom kako bi se dobila dva izolata: jedinjenje 1 (18 mg) i:2 (31 mg).Čistoća svih izolata procijenjena je dvodimenzionalnom TLC i vizualizacijom mrlje koristeći 5 posto sumporne kiseline. kiseline u metanolu, nakon čega je usledilo zagrevanje ploča na 110 stepeni 5 min.

Kristali su identificirani i okarakterizirani pomoću tečne hromatografije-masene spektroskopije (LCMS), LH i '3C izobličenja poboljšanja prijenosom polarizacije (DEPT)NMR, heteronuklearne jednostruke kvantne koherencije (HSQC), heteronuklearne višestruke kvantne korelacije (HMQC) i heteronuklearne višestruke korelacija veza (HMBC).

Test inhibicije elastaze. Test inhibicije elastaze je izveden kao što je prethodno opisano uz neke modifikacije32. Ukratko, u mikrotitarskim pločama Nunc-96 jažica, 20-μL alikvoti 0.8-jedinica/mL PPE u baferu baznog stupnja Trizma （pH 8.0 ） su pomiješani sa 20- μL uzorcima, a smjese su zatim razrijeđene na 180 μL u Trizma stepen baznog pufera. Ekstrakti testa su prethodno inkubirani sa enzimom 15 min, a 20-μL alikvoti supstrata N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (A3PVN; 2,9 mM) su dodani i inkubirani još 15 min. Pozitivna kontrola i prazne jažice sadržavale su oleanolnu kiselinu i vodu. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a stope inhibicije su određene prema apsorpciji; na 401 nm pomoću VersaMax čitača mikropločica. Procenat inhibicije izračunat je pomoću sljedeće jednačine:

gdje je E apsorbancija enzimske reakcije, Eb je apsorbancija slepog enzima, T je apsorbanca test uzorka, a Tb je apsorbanca slepog uzorka. također su vrijednosti određene iz linearnog grafikona procenta inhibicije elastaze u odnosu na koncentraciju (50,75,100,125,150 ug/mL). Test inhibicije tirozinaze. Inhibicija tirozinaze određena je metodom formiranja DOPA-hroma kao što je prethodno opisano uz male modifikacije13. Ukratko, u 96-pločama s bunarima, alikvoti od 20 μL DMSO (kontrola) ili testnih jedinjenja u različitim koncentracijama pomiješani su sa alikvotima od 40 μL od 30 U/mL tirozinaze pečuraka (Sigma Aldrich) i 100- μL 0.1-M fosfatni pufer （pH 6,8）. Prethodno su inkubirani 10 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcije su pokrenute dodavanjem alikvota od 10 mML-DOPA u svaku jažicu i inkubiranjem na 37 stepeni 20 minuta. Aktivnost tirozinaze je zatim određena mjerenjem apsorbancije na 475 nm. Kao pozitivna kontrola korištena je Kojična kiselina. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Procenat inhibicije tirozinaze izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

gdje je E apsorbancija enzimske reakcije, Eb je apsorbancija slepog enzima, T je apsorbanca uzorka za ispitivanje, a Tb je apsorbanca slepog uzorka. također su vrijednosti određene iz linearnog grafikona procenta inhibicije elastaze u odnosu na koncentraciju (250,125,62,5,31,25,15,6 ug/mL).

Molekularno spajanje. U ovom istraživanju in silico farmakološka aktivnost je predviđena molekularnim spajanjem uz pomoć liječnika. Ciljano molekularno spajanje je urađeno korištenjem kokristaliziranog liganda kao centra aktivnog mjesta. Struktura 2Y9X je korištena za spajanje molekula tirozinaze sa tropolonom, inhibitorom tirozinaze gljiva, kao kokristalom. Centar mjesta molekularnog pristajanja definiran je na -10.032;-28.769 i -43.467 kao X, Y i Z dimenzija respektivno. Lanac A je odvojen za upotrebu i atom Holmija je uklonjen iz strukture pomoću UCSF Chimera.

Struktura 3HGP, svinjske elastaze je također korištena u ovom istraživanju. FR130180, jer je kokristal korišten kao centar mjesta za spajanje molekula. Koordinate su bile 12.453,9.237, odnosno 1.199 za dimenzije X,Y,Z. Afinitet vezivanja je analiziran iz deset najboljih konformera svakog izračunavanja molekularnog spajanja.

Ovaj članak je preuzet iz Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x