Tuliposidi H–J i bioaktivne komponente iz lukovice Amana Edulis

sažetak:

Tri nove strane tulipana H–J (1–3) i 11 poznatih jedinjenja dobijene su po prvi put iz metanolnih ekstrakata lukovica Amana edulis. Njihove strukture su razjašnjene NMR, MS i IR spektroskopskim podacima, optičkom rotacijom i Mosherovom metodom. Svojstva melanogeneze svih izolata procijenjena su u B16 ćelijama melanoma. Posljedično, tributil citrat (9) je imao anti-melanogenezu aktivnost, ali je bio citotoksičan prema B16. ( plus )-piroglutaminska kiselina (4), ( plus )-butil 5-okso pirolidin-2-karboksilat (6), (-)-3-hidroksi-2-metil butirolakton (10 ), i 5- (hidroksimetil)furfural (12) je povećao proizvodnju melanina i aktivnosti tirozinaze. Te aktivne komponente mogu se dalje proučavati kao kandidati protiv melanoma i vitiliga za kožne bolesti ili izbjeljivanja/hipopigmentacije za kosu.

U istraživanju izbjeljivanja otkrili smo da Cistanche ima i učinak izbjeljivanja

Prije svega, Cistanche je bogat polisaharidima i flavonoidima. Ovi spojevi djeluju kao antioksidansi i mogu pomoći tijelu da ukloni slobodne radikale, usporavajući starenje kože i time poboljšavajući ten.

Drugo, Cistanche takođe sadrži razne aminokiseline, minerale i vitamine, koji su veoma korisni za popravku i regeneraciju kože. Cistanche može promovirati metabolizam stanica kože, poboljšati sposobnost samopopravke kože i vratiti koži zdravu boju.

Konačno, Cistanche sadrži i neke organske kiseline i alkalne tvari, a ovi sastojci također imaju određeni učinak na kondicioniranje i metabolizam zanoktica kože. Ove supstance mogu efikasno uravnotežiti pH vrednost kože, poboljšati debljinu stratum corneuma i učiniti kožu prozirnom i delikatnijom.

Kliknite gdje kupiti cistanche

1. Uvod

Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, sin. Tulipa edulis (Miq.) Baker pripada porodici Liliaceae i narodna je ljekovita biljka koja se koristi za liječenje bolesti raka [1,2]. Međutim, do sada je bilo nekoliko fitokemijskih i bioloških studija o ovoj vrsti.

Na primjer, 95 posto i 50 posto EtOH ekstrakti mogu izazvati apoptozu u ljudskim ćelijama karcinoma želuca (SGC7901) [1] i hepatoma (BEL7404, HepG2 i Huh7) [2]. Polisaharidi pripremljeni od A. edulis imaju antioksidativna svojstva, uključujući DPPH, OH- i ABTS plus aktivnosti čišćenja [3-5]. U istraživanju novih agenasa iz prirodnih proizvoda za kožne poremećaje, otkrili smo da MeOH ekstrakti lukovica A. edulis pokazuju potencijalnu regulaciju melanogeneze koja još nije istražena. Kada je izložena ultraljubičastom zračenju sunčeve svjetlosti ili štetnim kemikalijama i patogenim faktorima, umjerena melanogeneza može zaštititi našu kožu od stvaranja reaktivnih kisikovih vrsta u keratinocitima i melanocitima [6]. Tirozinaza je važan enzim u melanogenezi koji proizvodi više melanina za odbranu od gore navedenih opasnih stanja [7].

Stoga su aktivne komponente A. edulis vrijedne da budu očišćene za daljnju medicinsku primjenu. U ovom istraživanju, tri nove strane tulipana H–J (1–3) i 11 poznatih jedinjenja (4–14) (Slika 1) izolovane su iz A. edulisa i strukturno identifikovane NMR, MS i IR spektroskopskim podacima, optičkom rotacijom , ili reakcija Mosher estera. Spoj 9 bi mogao smanjiti sadržaj melanina, ali biti citotoksičan prema B16 stanicama melanoma. Jedinjenja 4, 6, 10 i 12 su povećala proizvodnju melanina i aktivnosti tirozinaze. Sve u svemu, ovaj rad je dokazao da A. edulis i njegove aktivne komponente mogu biti novi uzročnici bolesti povezanih s melaninom, kao što su melanom i hipopigmentacija (vitiligo kože ili izbjeljivanje kose).

2. Rezultati i diskusija

2.1. Objašnjenja strukture izolata 1–3

Ekstrakt MeOH (TEM) iz lukovica A. edulis odvojen je na frakcije rastvorljive u EtOAc (TEE), n-BuOH rastvorljive (TEB) i HO rastvorljive (TEW). Razlomak. djelovanje TEE i TEB ekstrakata dalo je nove izoprenoidne glikozide 1-3 i poznata jedinjenja 4-14 (Slika 1). Osim toga, glavne komponente TEW ekstrakta bili su ugljikohidrati.

HRESIMS (masena spektrometrija jonizacijske elektrosprej visoke rezolucije) od 1 pokazala je (M - H- jon na m/z 351,1652, što ukazuje na molekularnu formulu CsH2gOg (izračunato za C;5HoOg; 351,1655) i dva stepena spektra nesaturacije. pokazao apsorpciju za hidroksil (3376 cm-l) i karbonil (1725 cm-l) funkcionalnosti Petnaest signala ugljika, uključujući dva metila, pet metilena, sedam metina i jedan kvaternarni ugljik, uočeno je u jednodimenzionalnoj (1D) NMR spektri 1 (Tabela 1). Kvaternarni ugljik je identificiran kao karbonil ugljik na osnovu hemijskog pomaka 6c 176.6 1D i HSOC (heteronuklearna pojedinačna kvantna koherencija) NMR spektri su pokazali jedan anomerni (0/8c: 4,27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4.9), pet oksimetolona (0h/8c: 3.21(t, J { {34}}.0 Hz)/75.1, 3.28 (preklapanje)/71.6, 3.28 (preklapanje)/78.0, 3.35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 i 3,89 (td, I=7.0, 2,5 Hz)/73,6), i tri oksimetilena (6,/6c: 3,57 (dd, J {{64} }.5, 7.0 Hz)4.01 (dd, I {{70}}.5, 2.5 Hz)/73.1, 3.66 (dd, I { {78}}.0, 5.0 Hz), 3.85 (brd, I=12.0 Hz)/62.7 i 4.10 (2H, t, J=7.5 Hz)/65.5) signali. HMBC (heteronuklearna korelacija višestrukih veza) korelacije (slika 2) jedinjenja 1 na metinskim protonima H-2 (8 2.67, kvinta sa C-1 (6 176). 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) sa C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) sa C-4, i metil protoni H-5 (8 1.14 , d) sa C-1/C-2/C-3 sugerira da su metilni i hidroksilni dijelovi pozicionirani na C-2 i C-3, respektivno. metilenski protoni na H,-1" (8 4.10, t) i H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) su pokazali 3 interakcije sa C{{ 142}} i C-1' (8 104.9), redom, u HMBCspectrum-u (slika 2) koji je podržavao dodjele n-butil grupe na C-1 i jednu beta -glukoza (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) na C-4 8].

Slika 2 prikazuje ključne korelacije COZY i HMBC uočene za 1. Relativne konfiguracije na C-2 i C-3 (3-hidroksi-2-metil dio) od 1 mogu se odrediti protiv -form po 3 JH2-H3 vrijednosti od 7.0 Hz (anti-form: 7.0 Hz; sin-form: 4.0 Hz) [ 9]. Da bi se odredila apsolutna konfiguracija, jedinjenje 1 je tretirano odvojeno sa (R)- i (S)- -metoksi- -(trifluorometil)-fenil acetil hloridom [(R)- i (S)-MTPA- Cl] u prisustvu piridina-d5 da bi se dobili (S)- i (R)-MTPA esteri (1a i 1b), respektivno. MTPA estri su uspješno generirani na C-3 i C-20/C-30/C-40 , kao što je razjašnjeno iz 1H NMR i 1H-1H COZY spektri (1a, H-3, δ 5,82, m; H-20, δ 5,70, t, J=9,5 Hz; H-30, δ 4,39, t, J=9.5 Hz; H-40, δ 5.76, t, J=9.5 Hz; 1b, H-3, δ 5.81, m; H{{64 }} , δ 5.56, t, J=9.5 Hz; H-30 , δ 4.12, t, J=9.5 Hz; H-40 , δ 5.66, t, J=9.5 Hz). Razlike između 1H NMR hemijskih pomaka za 1a i 1b (vrijednosti ∆ prikazane na slici 3) dovele su do dodjele S- i R-konfiguracija na C-3 i C-2, respektivno. Shodno tome, jedinjenje 1 je razjašnjeno kao butil 4- -D-glukopiranoza-(S)-3-hidroksi-(R)-2-metil butanoat i nazvano strana tulipana H.

Jedinjenje 2, strana tulipana I, dalo je molekularnu formulu, C15H28O8, ustanovljenu HRESIMS-om (m/z 359,1686 [M plus Na] plus, izračunato za 359,1682). 1D NMR spektri za 2 su također bili slični onima za 1, osim činjenice da su hemijski pomaci metilenskog signala δH 1,65 (sext, J=7.0 Hz) i 1,96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34,6 su identificirani umjesto jednog metina na C-3 od 1 (Tabela 1). Na osnovu podataka COZY i HMBC (Slika 2), pretpostavljeno je da se spoj 2 sastoji od izoprenoida, jedne glukoze i n-butil grupa. HMBC 3 J korelacije H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) sa C-1 (δ 178.5) i H-10 (δ 4.19, d, J=8.0 Hz/δC 104.4) sa C-4 (δ 68.4) sugeriraju da n-butil grupa i jedna -glukoza dio [8] je povezan na C-1 i C-4, respektivno (slika 2). Ključne korelacije HMBC i COZY prikazane su na slici 2. R-konfiguracija H3-5 na C-2 od 2 je određen kiselom hidrolizom 2 da bi se dobilo odgovarajuće jedinjenje tulipalina, 3-metildihidrofuran-2(3H)-on (Slika S28) [8] sa pozitivnom optičkom rotacijom vrijednost ([ ] 23 D plus 18,7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D plus 14,7, CHCl3) [10]. Struktura jedinjenja 2 identificirana je kao butil 4- -D-glukopiranoza-(R){{ 81}}metil butanoat.

Molekularna formula 3 je izvedena kao C11H20O8 zbog pojave [M plus Na] plus jona na m/z 303,1049 (izračunato za 303,1050) u HRESIMS. Jedanaest ugljikovih signala, uključujući jedan metil (δ 17.6), tri metilena (δ 34.7, 62.8 i 68.6), šest metina (δ 37.6, 71.6, 75.1, 77.9, 78.0 i 104.4) i jedan ugljik δ06na. , uočeni su u 1D NMR spektrima 3 (Tabela 1). Kvaternarni ugljenik je identifikovan kao karbonil ugljenik na osnovu hemijskog pomaka ugljenika na δ 180,6. Nadalje, spoj 3 je pokazao slične spektroskopske podatke kao i spoj 2, osim za n-butil signale. U HMBC spektru (Slika S15), anomerni proton na δ 4.23 (d, J=8.0 Hz) pokazao je interakciju od 3 J sa C-4 (δ 68.6) što je dovelo do -glukoze koja se nalazi na C-4. Ključne HMBC i COZY veze su prikazane na slici 2. Jedinjenje 3 nije izolovano u dovoljnoj količini da odredi apsolutnu konfiguraciju na C-2. Konačno, strana tulipana J (3), 4- -D-glukopiranoza-(R)-2-metil butanska kiselina, identifikovana je zbog gore navedenih strukturnih objašnjenja 1 i 2 u ovoj studiji.

Jedinjenja 1-3 su bokovi tulipana, vrsta specijalizovanog proizvoda koji se sastoji od 4-hidroksi2-metilen butanske kiseline (HMBA) i/ili (3S)-3,4-dihidroksi -2-grupe metilen butanoične kiseline (DHMBA) acilirane na C-1 i/ili C-6 pozicijama -D-glukoze (Glc) koje se uglavnom nalaze u rodu Tulipa [8,11] . Do sada, analozi sa strane tulipana, uključujući 1-lale strane A, 6-lale strane A, 1-lale strane B, 6-lale strane B i strane tulipana D–G , izolovani su iz Tulipa [8,11]. Međutim, struktura strane C tulipana nije prijavljena i mogla bi nedostajati u prethodnoj literaturi [11]. Tulipalini, kao što su tulipalin A i (-)-tulipalin B, su aglikonski dijelovi strana tulipana, koji spontano laktoniraju nakon otpuštanja HMBA i/ili DHMBA grupa pomoću enzima koji konvertiraju stranu tulipana [8,11]. U ovoj studiji, spojevi 1-3 pod nazivom strane tulipana H–J pripadaju stranama tulipana, ali su njihove dvostruke veze na C-2 smanjene i grupe -D-glukoze su vezane za C-4 (oksimetilen ), umjesto C-1 (O-acil funkcionalnost) u HMBA ili DHMBA (Slika 1). Dodatno, jedinjenje 10 (2S,3S) je tulipalin, ali se ne može metabolizirati iz 1 (2R,3S) zbog različitih konfiguracija na C-2. Moguća biosinteza strana tulipana 1–3 prikazana je na slici S29 [8,11].

Osim toga, 11 poznatih jedinjenja uključujući tri analoga piroglutaminske kiseline (4-6), tri derivata limunske kiseline (7-9), dva furanona (10-11), jedan furan (12) i dva steroida (13-14) izolovan iz A. edulis po prvi put. Jedinjenja 1–9 i 10–14 su dobijena iz TEB i TEE sirovih frakcija, respektivno. Identifikovani su kao ( plus )-piroglutaminska kiselina (4) [12], ( plus )-metil 5-okso pirolidin-2-karboksilat (5) [12], ( plus )- butil {{23 }}okso pirolidin-2-karboksilat (6) [12], 1-butil citrat (7) [13], 1,10 -dibutil 5-metil citrat (8) [ 13], tributil citrat (9) [13], (–)-3-hidroksi-2-metil butirolakton (10) [14–16], (–)- metil 3-hidroksi{{ 44}}okso tetrahidrofuran-3-karboksilat (11) [17], 5-(hidroksimetil)furfural (12) [18], sitosterol (13) [19] i sitosterol-3- -D -glukoza (14) [20] iz spektroskopskih podataka i upoređena sa literaturom.

2.2. Objašnjenje hemijskih komponenti TEW

1H i 13C NMR spektri TEW, u vodi rastvorljive sirove frakcije iz TEM ekstrakta, pokazali su vrlo slične spektrima ugljenih hidrata (Slike S16 i S17). Prijavljeno je da polisaharidi pripremljeni od ove vrste posjeduju ramnozu, ksilozu, arabinozu, galaktozu, manozu, glukozu i fruktozu nakon analize monosaharida [3,8]. NMR spektroskopski podaci i TLC (tankoslojna hromatografija) retencijski faktor TEW u poređenju sa onima standarda šećera (Slike S18–S23) sugeriraju da su D-glukoza i D-fruktoza glavne komponente u TEW ekstraktima.

2.3. Efekti ekstrakata i izolata na melanogenezu

Ekstrakt MeOH (TEM) ove vrste je razdvojen na TEE, TEB i TEW sirove frakcije, a prethodno spomenuta četiri ekstrakta procijenjena su na citotoksičnost i efekte melanogeneze u B16 ćelijama melanoma u koncentracijama od 12,5 do 200 µg/mL (Slika S24) . TEE je pokazao očiglednu citotoksičnost prema B16 na 200 µg/mL, a TEB kao i TEW su imali citotoksične aktivnosti u koncentracijama od 12,5 do 200 µg/mL (Slika S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). U biološkom testu, -melanocit-stimulirajući hormon (-MSH) je korišten za aktiviranje B16 ćelija da sintetiziraju više melanina, a TEM je mogao umjereno stimulirati melanogenezu (Slika S24A-2).

Većina svih izolata (Slika 1), isključujući 13 i 14, dodatno je ispitana za regulaciju efekata melanogeneze u koncentracijama od 10 do 40 µM, pri čemu je arbutin korišten kao pozitivna kontrola (Slika 4). Kao što je prikazano na slici 4, jedinjenje 9 je očigledno i ovisno o dozi inhibiralo proizvodnju melanina koja je rezultat citotoksičnosti prema B16 stanicama sa vrijednošću IC50 (polovina maksimalna inhibitorna koncentracija) od 81,9 µM (Slika S25). Izolati 4, 6, 10 i 12 povećali su sadržaj melanina ovisno o dozi do maksimalnih postotaka od 11,9 posto, 29,8 posto, 27,2 posto i 17,6 posto, respektivno, pri 40 µM bez ćelijske toksičnosti. Tirozinaza igra ključnu ulogu u prva dva koraka melanogeneze [6]; stoga su dalje procenjeni efekti jedinjenja 4, 6, 10 i 12 na intracelularnu tirozinazu. -MSH je povećao aktivnost tirozinaze do 254,3–305,5 posto u poređenju sa kontrolnom grupom (100 posto) (slika 5 i tabela S1).

Shodno tome, 4 (14,1–21,9 posto), 6 (15,8–21,9 posto), 10 (8,5–13,1 posto) i 12 (7,5–11,8 posto) umjereno je povećalo aktivnost enzima, tirozinaze, na način ovisan o dozi. u koncentracijama od 10 do 40 µM, dok se upoređuje sa -MSH grupom (Slika 5 i Tabela S1). Grafikon korelacije između sadržaja ćelijskog melanina i efekata na tirozinazu jedinjenja 4, 6, 10 i 12 prikazan je na slici S26. Nadalje, da bi se potvrdili efekti induciranja melanogeneze 4, 6, 10 i 12, svako jedinjenje je dodano u B16 ćelije bez kotretiranog -MSH koji je korišten kao pozitivna kontrola u ovom testu (Slika S27). Shodno tome, pojedinci 4, 6, 10 i 12 nisu sami povećali proizvodnju melanina (Slika S27) slično onima prikazanim na Slici 4. Predloženo je da gore spomenuta četiri jedinjenja mogu samo poboljšati efekte melanogeneze -MSH. Shodno tome, dodatni signalni putevi u melanogenezi, kao što su protein povezan s tirozinazom-1 (TRP-1), TRP-2, transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom, receptor melanokortina 1, ciklički adenozin monofosfat, protein kinaza A, cAMPresponse element-vezujući protein, c-Jun N-terminalne kinaze, kinaza regulirana ekstracelularnim signalom, p38 i fosfoinozitid 3-kinaza/protein kinaza B [7,21], treba dalje testirati i potvrditi za te aktivne komponente.

3. Materijali i metode

3.1. Opće eksperimentalne procedure

NMR spektri su mjereni na Bruker Avance Ill 500 MHz instrumentu (BrukerBillerica, Amerika) za 1H i 125 MHz za 13C-NMR. Vrijednosti hemijskog pomaka (0) bile su u ppm, a konstante spajanja () bile su u Hz sa CD-om; OD, CDCl i/ili D, O su korišteni kao rastvarači. Optičke rotacije su dobijene na JASCO-P-2000 polarimetru (JASCO, TokyoJapan) (dužina ćelije 10 mm). IR spektri su snimljeni na PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR spektrometru (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). ESIMS elektrosprej jonizaciona masena spektrometrija niske i visoke rezolucije) izmjerene su na Bruker Daltonics EsquireHCT masenom spektrometru ultra velikog kapaciteta i Orbitrap masenom spektrometru (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific), respektivno. TLC je obavljen na Kieselgel60 F254 (0,25 mm; Merck) i/ili RP-18 F254S (0,25 mm; Merck), premazanim pločama i zatim obojenim prskanjem sa 5 posto (o/u) sumpora kiseline u otopini MeOH i zagrijavanje na vrućoj ploči. Silika gel (Silicycle: 70 230 i 230 400 mreža), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE epizoda 0 pe open w Bre primijenjen foSupelcoTM, Bellefonte), i MCI CHP20P (SupelcoTcolumn kromatografija. Shimadzu LC-20AT pumpa i Shimadzu RID-10Detektor indeksa refrakcije (Shimadzu Inc, Kyoto, Japan), zajedno sa Cosmosil 5C18-MS-II ( 250 x10 mm id, 5 um) kolona sa brzinom protoka od 2,0 mL/min, korišteni su za HPLC. Šećerni reagensi uključujući D-glukozu (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Francuska) i D-fruktozu (TCI, Tokyoapan) su korišteni koristi se za analizu sirove frakcije rastvorljive u vodi (TEW).

3.2. Biljni materijal

Suhe lukovice A. edulis (ranije T. edulis) kupljene su u ljekarni tradicionalne kineske medicine u Taichungu, Tajvan, u septembru 2018. godine i identificirane od strane autora prof. Changa. Uzorak vaučera (TE201809) deponovan je u Centru za istraživanje i razvoj kineske medicine, CMUH Tajvan.

3.3. Ekstrakcija i izolacija

Lukovice A. edulis (5.0 kg) ekstrahovane su osam puta sa MeOH (8.0 L svaka) na sobnoj temperaturi da bi se dobio sirovi ekstrakt. Ekstrakt MeOH (TEM, 525.0 g) podijeljen je tri puta između etil acetata (EtOAc) i H2O (1500:1500, v/v) da se dobije EtOAc -rastvorljiva frakcija (TEE, 45,0 g) i vodena faza, koja je dalje podijeljena sa n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3), a zatim razdvojena na n-BuOH-topivu (TEB, 53,6 g ) i H2O-rastvorljive (TEW, 410,0 g) frakcije.

TEE je podvrgnut hromatografiji na otvorenoj koloni na silika gelu ({{0}}.063–0.200 mm, kolona: 7 × 26 cm, prečnik × dužina), koristeći gradijente heksan–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) i dao je 14 podfrakcija (TEE1–TEE14). Precipitat 14 (249.0 mg; prinos izolacije: 0.{{100}}0498 posto) dobijen iz subfrakcije TEE12 (2,2 g) je filtriran i ispran sa MeOH. TEE9 (3,6 g) je frakcionisan u sedam podfrakcija (TEE9-1 do 9-7) silika gelom (kolona: 5 × 24 cm; CH2Cl2–MeOH, 7:1; 1:1; 0:1 , v/v), sa subfrakcijom TEE9-4 (1,1 g), a zatim podvrgnut hromatografiji na koloni Sephadex LH-20 (kolona: 5 × 54 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1 do 0: 1, v/v), da dobijemo sedam podfrakcija (TEE9-4-1 do 9-4-7). TEE9- 4-5 i TEE9-4-6 su kombinovani (ukupno 551,7 mg) i više puta prečišćeni RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55; 20:80, v/v) da bi se dobilo 12 (21,0 mg) ; tR=13 min; prinos izolacije: 0,00042 posto) i matičnu tečnost (131,2 mg), koja je dalje podvrgnuta RP-HPLC (MeOH–H2O; 10:90, v/v) da bi se dobila jedinjenja 10 ( 35,5 mg; tR=13 min; prinos izolacije: 0,00071 posto) i 11 (1,2 mg; tR=15 min; prinos izolacije: 0,000024 posto). Frakcija TEE6 (2,7 g) je izolovana pomoću Sephadex LH-20 (kolona: 2,5 × 45 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1; 0:1, v/v) da se dobije 13 (6,8 mg; prinos izolacije: 0,000136 posto).

TEB je kromatografiran preko Diaion HP{{0}} kolone (6 × 60 cm; H2O–MeOH– aceton, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} 0}}:0:100, v/v/v) da dobijemo šest podfrakcija (TEB1–TEB6). Subfrakcija TEB5 (502.0 mg) je pročišćena pomoću RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) da bi se dobila jedinjenja 8 (9,3 mg; tR {{34} } min; prinos izolacije: 0.000186 posto ) i 9 (144,2 mg; tR {{4{{2{{2{{218}) }9}}3}}}} min; prinos izolacije: 0,002884 posto). Frakcija TEB3 (5,5 g) je podvrgnuta RP-18 hromatografiji (kolona: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v), a subfrakcija TEB3-6 ( 1,0 g) je dalje izolovan sa Sephadex LH-20 (kolona: 5 × 54 cm; MeOH) da se dobije sedam podfrakcija (TEB3-6-1 do 3-6-7). TEB3-6-4 (377,1 mg) je odvojen MCI gel hromatografijom (kolona: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) da se dobije sedam podfrakcija (TEB3-6-4-1 do 3-6-4-7). TEB3-6-4-4 (38,1 mg) je prečišćen pomoću RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55 u 0,1 posto mravlje kiseline, v/v) da se dobije čisti 1 (12,2 mg; tR=17 min; izolacijski prinos: 0,000244 posto). Dodatno, TEB3-6-4-6 (31,0 mg) je proveden sa RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 u 0,1 posto mravlje kiseline, v/v) da se dobije 6 (7,1 mg; tR=28 min izolacijski prinos: 0,000142 posto). TEB3-6-5 (410,7 mg) je izolovan MCI gel hromatografijom (kolona: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) da dobijemo osam podfrakcija (TEB3-6-5-1 do 3-6-5-8). TEB3-6-5-3 (75,1 mg) je prečišćen MCI gel hromatografijom (kolona: 1 × 20 cm; H2O–MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) da bi se dobila jedinjenja 4 (59,3 mg; prinos izolacije: 0,001186 posto) i 5 (10,2 mg; prinos izolacije: 0,000204 posto). Subfrakcija TEB3-6-5-4 (97,0 mg) je pročišćena pomoću RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 u 0,1 posto mravlje kiseline, v/v) da se dobije 7 (46,4 mg; tR=18 min; izolacijski prinos: 0,000928 posto). TEB3-10 (925,4 mg) je hromatografisan preko MCI gel hromatografije (kolona: 2,5 × 28 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30 :70; 10:90; 0:100, v/v) da bi se dobilo osam podfrakcija (TEB3-10-1 do 3-10-8) i čista 2 (393,4 mg; prinos izolacije: 0,007868 procenata). Jedinjenje 3 (6,3 mg; tR=8 min; prinos izolacije: 0,000126 posto) je dobijeno iz TEB3-10-2 (20,9 mg) prečišćavanjem RP-HPLC (MeOH–H2O, 30:70 u 0,1 posto mravljeg kiselina, v/v).

3.3.1. tulipozid H (1)

[ ] 23 D −23,1 (c 0.12, MeOH); IR (čist) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, 1075, 10 C), 926, 900, 632, 521 cm−1; 1H i 13C NMR spektroskopski podaci, vidi tabelu 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M − H]− (izračunato za C15H27O9, 351,1655).

3.3.2. tulipozid I (2)

[ ] 23 D −25.8 (c 0.2, MeOH); IR (uredno) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1076, 1076, 10-0 C), 897, 736, 625, 517 cm−1; 1H i 13C NMR spektroskopski podaci, vidi tabelu 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M plus Na] plus (izračunato za C15H28O8Na, 359,1682).

3.3.3. Tuliposide J (3)

[ ] 23 D plus 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (uredno) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1182, 1182 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm−1; 1H i 13C NMR spektroskopski podaci, vidi tabelu 1; HRESIMS m/z 303.1049 [M plus Na] plus (izračunato za C11H20O8Na, 303.1050).

3.4. (R)- i (S)-MTPA derivati ​​od 1

Priprema esterskog derivata (S)-MTPA od 1 izvedena je prikladnom procedurom Mosher estera [22,23]. Jedinjenje 1 (3,4 mg, 0.01 mmol) je prebačeno u čistu NMR epruvetu i zatim potpuno osušeno pod vakuumom prije nego što je bilo puno dušika. Nadalje, C5D5N ({{20}},5 mL) i (R)-(−)- -metoksi- -(trifluorometil)-fenil-acetil hlorid (MTPA hlorid, 12,2 mg, 0,05 mmola) su odmah dodani u zatvorenu NMR epruvetu koja je dalje pažljivo protresena da se uzorak i MTPA hlorid pomiješa. Snimljeni su 1H NMR i 1H-1H COZY spektri smeše nakon reakcije tokom 24 h na sobnoj temperaturi. (R)-MTPA estar 1 je također pripremljen na sličan način gore navedenim postupkom. Jedinjenje 1: 1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,78 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,28 (H3-5, d), 1,52 ( H-200, kvinta), 3,08 (H-2, kvinta), 3,95 (H-50, m), 4,03 (H-4a, dd), 4,05 (H -20, preklapanje), 4.15 (H-100, t), 4.23 (H-30, preklapanje), 4.23 (H-40, preklapanje), 4.36 (H{{ 68}a, dd), 4,39 (H-3, preklapanje), 4,43 (H-4b, dd), 4,53 (H-60b, d) i 4,95 (H -10, d).

3.4.1. (S)-MTPA estar od 1 (1a)

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,77 (H-400, t), 1,17 (H-300, sext), 1,21 (H3-5, d) , 1,37 (H-200, kvinta), 3,18 (H-2, kvinta), 3,92 (H-100, t), 3,97 (H-4a, dd), 4.33 (H-50, m), 4.39 (H-30, t), 4.49 (H-4b, brd), 4.64 (H-60a, dd), 4,96 (H-10, d), 5,05 (H-60b, d), 5,70 (H-20, t), 5,76 (H-40, t) i 5,82 (H-3, m).

3.4.2. (R)-MTPA ester od 1 (1b)

1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0,79 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,30 (H3-5, d) , 1.50 (H-200, kvinta), 3.33 (H-2, kvinta), 3.60 (H-50 , m), 3.94 (H-4a, dd), 4.11 (H-100, t), 4.12 (H-30 , t), 4.13 (H-60a, dd), 4.50 (H-4b, brd), 4,70 (H-10, d), 4,85 (H-60b, d), 5,56 (H-20, t), 5,66 (H-40, t) i 5,81 (H-3, m).

3.5. Kisela hidroliza tulipozida I (2)

Izolat 2 (78,6 mg) je hidrolizovan u 1 M HCl (1,5 mL) na 100 ◦C tokom 2 h [8]. Nakon hlađenja, reakciona smjesa je ekstrahovana sa CH2Cl2 (2,0 mL × 3) da bi se dobio analog tulipalina, 3-metildihidrofuran-2(3H)-on (11,1 mg). [ ] 23 D plus 18,7 (c 1,1, CH2Cl2); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1,30 (3H, d, J=7.0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (Slika S28); ESIMS m/z 101.06 [M plus H] plus .

3.6. Cell Culture

Mišje ćelije melanoma B16 uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom mediju Eagle (DMEM; GIBCO Invitrogen corporation, New York, NY, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina. ◦C u inkubatoru sa 5% CO2.

3.7. Mjerenje vitalnosti B16 ćelija

Citotoksičnost B16 ćelija za ispitivana jedinjenja merena je MTT sa prethodno opisanim protokolom sa malim modifikacijama [6]. Ćelije su posađene u 96-ploče sa jažicom (1 × 103 ćelije/jažicu) i kultivisane 24 h pre nego što su tretirane jedinjenjima još 72 h. Nakon toga, podloga je uklonjena, 100 µL MTT reagensa (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (u konačnoj koncentraciji od 0,5 mg/mL) je dodano u svaku jažicu i zatim inkubirano na 37 ◦C 1 h. Kristal formazana je otopljen u 100 µL DMSO, a optička gustina je izmjerena korištenjem čitača mikroploča (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Njemačka) na 570 nm.

3.8. Mjerenje sadržaja melanina u B16 ćelijama

Sadržaj melanina u B16 ćelijama je analiziran prema prethodno opisanoj metodi uz male modifikacije [6]. Ćelije su zasijane u gustini od 5 × 103 ćelije/jažici u 24-ploče sa jažicom tokom 24 h. Medijum je zamenjen sa 500 µL svežeg medijuma za kulturu koji sadrži 0,5 µM -MSH sa ili bez jedinjenja tokom 72 h. Arbutin (1 mM) je korišten kao pozitivna kontrola. Nakon toga, medijum je uklonjen i ispran sa PBS (pH 6,8) dva puta. Ćelije su sakupljene pomoću NaOH (200 µL, 2 N) i zatim zagrejane na 85 ◦C 30 min. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu i centrifugiranja, mjerena je apsorpcija na 405 nm pomoću čitača mikroploče.

3.9. Intracelularna aktivnost tirozinaze

Ispitivanje intracelularne aktivnosti tirozinaze izvedeno je malo modifikovanom metodom, o kojoj je ranije objavljeno [6]. Ćelije su zasijane u 24-ploče sa gustinom od 5 × 103 ćelije/jažici tokom 24 h. Ćelije su tretirane u DMEM koji sadrži 0,5 µM -MSH sa ili bez jedinjenja tokom 72 h. Nakon uklanjanja medijuma, ćelije su dva puta isprane hladnim PBS (pH 6,8). Ćelije su lizirane sa 100 µL pufera za lizu (1 posto tritona X-100 u PBS-u) i zamrznute na -80 ◦C 15 min.

Zatim su ćelijski lizati centrifugirani na 13.200 × g na 4 ◦C tokom 30 minuta da bi se dobio supernatant. Ukupni sadržaj proteina u supernatantu je kvantificiran BCA proteinskim testom. Zatim, svaki kvantifikovani lizat (30 µg/90 µL) je pomešan sa 10 µL L-DOPA (15 mM) u ploči sa 96-jažicom i zatim inkubiran na 37 ◦C tokom 1 h, a apsorbancija je izmerena na 405 nm pomoću čitača mikropločica.

4. Zaključak

Sveukupno, 14 čistih jedinjenja, uključujući tri nova izoprenoidna glikozida, i strane tulipana H–J (1–3), izolovano je iz A. edulisa. Derivat limunske kiseline 9, tributil citrat, imao je značajnu aktivnost protiv melanogeneze, ali je pokazao citotoksičnost prema B16 ćelijama melanoma koje bi se mogle dalje istraživati ​​za lijekove protiv melanoma. Dok su analozi piroglutaminske kiseline 4 i 6, furanon 10 i furan 12 imali ovisno o dozi povećani sadržaj melanina i aktiviranu tirozinazu, što bi se moglo dalje proučavati za kožnu bolest vitiliga ili sredstva protiv izbjeljivanja i hipopigmentacije kose. Međutim, potrebno je detaljnije istražiti in vitro mehanizme i/ili in vivo studije kako bi se potvrdila efikasnost aktivnih komponenti.

Dodatni materijali:

Sljedeće je dostupno na internetu, slike S1–S5: NMR spektralni podaci jedinjenja 1, Slike S6–S10: NMR spektralni podaci jedinjenja 2, Slike S11–S15: NMR spektralni podaci jedinjenja 3, Slike S16–S22: NMR spektralni podaci TEW, Slika S23: TLC analiza TEW, Slika S24: Citotoksičnost i regulacija efekata melanogeneze TEM, TEE, TEB i TEW, Slika S25: Podaci o citotoksičnosti jedinjenja 1–12, Slika S26: Grafikon korelacije između sadržaj ćelijskog melanina i efekti na tirozinazu jedinjenja 4, 6, 10 i 12, Slika S27: Efekti melanogeneze samo jedinjenja 4, 6, 10 i 12 bez -MSH, Slika S28: Podaci o NMR spektru i optičkoj rotaciji proizvod dobijen kiselinskom hidrolizom jedinjenja 2, Slika S29: Moguća biosinteza jedinjenja 1-3, Tabela S1: Efekti na aktivnost tirozinaze jedinjenja 4, 6, 10 i 12.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, C.-LL; identifikacija biljnog materijala, Y.-SC; provođenje izolacije i prečišćavanja, C.-LL i Z.-AG; provođenje bioloških testova, Y.-LJ; sve spektralne analize i određivanje strukture, C.-LL i C.-JC; pisanje originalnog nacrta pripreme, C.-LL Svi autori su pročitali i složili se sa objavljenom verzijom rukopisa.

finansiranje:

Ovo istraživanje je finansirano od strane Ministarstva nauke i tehnologije (MOST 108-2320-B039-035-) i Kineskog medicinskog univerziteta (CMU108-MF-84), Tajvan. APC je finansiran od strane "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" iz programa The Featured Areas Research Center Program u okviru projekta Higher Education Sprout od strane Ministarstva obrazovanja (MOE) u Tajvanu (CMRC-CHM{{5} }).

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:

Nije primjenjivo.

Izjava o informiranom pristanku:

Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka:

Nije primjenjivo.

Priznanja:

Ovaj rad su finansijski podržali Ministarstvo nauke i tehnologije (MOST 108-2320-B-039-035-) i Kineski medicinski univerzitet (CMU108-MF-84), Tajvan, kao i "Centar za istraživanje kineske medicine, Kineski medicinski univerzitet" iz programa The Featured Areas Research Centre Program u okviru projekta Higher Education Sprout od strane Ministarstva obrazovanja (MOE) u Tajvanu (CMRC-CHM-1) dodijeljen C .-LL

Sukobi interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Dostupnost uzorka:

Uzorci jedinjenja 1–14 dostupni su od autora.

Reference

1. Lin, R.; Li, Z.; Lin, J.; Ye, J.; Cai, Q.; Chen, L.; Peng, J. Etanolni ekstrakt Tulipa edulis Bak inducira apoptozu u SGC-7901 ćelijama humanog karcinoma želuca putem mitohondrijalnog signalnog puta. Oncol. Lett. 2015, 10, 2371–2377. [CrossRef] [PubMed]

2. Fan, Y.; Hou, X.; Guo, P.; Lv, X.; Zhao, L.; Wang, H.; Zhou, L.; Feng, Y. Ekstrakcija Amana edulis inducira apoptozu raka jetre. Evid.-Based Complement. Altern. Med. 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]

3. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Fizičko-hemijski i antioksidativni potencijal polisaharida sekvencijalno ekstrahiranih iz Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 131, 453–460. [CrossRef]

4. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Reološka svojstva i emulgirajuće ponašanje polisaharida sekvencijalno ekstrahiranih iz Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 137, 160–168. [CrossRef]

5. Cao, YY; Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Hu, F.; Zhang, JG; Wei, ZJ Efekti sulfatiranih, fosforiliranih i karboksimetiliranih modifikacija na antioksidativne aktivnosti in vitro polisaharida sekvencijalno ekstrahiranih iz Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2020, 146, 887–896. [CrossRef]

6. Lai, KY; Hu, HC; Chiang, HM; Liu, YJ; Yang, JC; Lin, YA; Chen, CJ; Chang, YS; Lee, CL Novi diterpeni leojaponini G-L iz Leonurus japonicus. Fitoterapia 2018, 130, 125−133. [CrossRef]

7. Ullah, S.; Chung, YC; Hyun, CG Indukcija melanogeneze fosfomicinom u B16F10 ćelijama putem regulacije P-JNK i P-p38 signalnih puteva. Antibiotici 2020, 9, 172. [CrossRef] [PubMed]

8. Christensen, LP; Kristiansen, K. Izolacija i kvantifikacija strana tulipana i tulipana u tulipanima (Tulipa) tečnom hromatografijom visokih performansi. Kontaktirajte Dermat. 1999, 40, 300−309. [CrossRef]

9. Tripathi, A.; Puddick, J.; Prinsep, MR; Lee, PPF; Tan, LT Hantupeptini B i C, citotoksični ciklodepsipeptidi iz morske cijanobakterije Lyngbya majuscula. Phytochemistry 2010, 71, 307−311. [CrossRef]

10. Qabaja, G.; Wilent, JE; Benavides, AR; Bullard, GE; Petersen, KS Jednostavna sinteza svestranih enantioobogaćenih -supstituiranih hidroksi estera kroz kinetičku rezoluciju kataliziranu Brønsted kiselinom. Org. Lett. 2013, 15, 1266−1269. [CrossRef]

11. Nomura, T.; Kato, Y. Identifikacija tulipozida G, novog tulipozida tipa glukozidnog estera, i njegova distribucija u tulipanu. Z. Naturforsch. CJ Biosci. 2020, 75, 75−86. [CrossRef]

12. Gang, FL; Zhu, F.; Li, XT; Wei, JL; Wu, WJ; Zhang, JW. Sinteza i procjena bioaktivnosti analoga L-piroglutaminske kiseline iz prirodnog olova. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 4644–4649. [CrossRef]

13. Vereshchagin, AL; Anikina, EV; Syrcina, AI; Lapin, MF; Azin, LA; Semenov, AA Hemijsko ispitivanje gorkih materija ploda Lonicera caerulea. Chem. Nat. Compd. 1989, 25, 289−292. [CrossRef]

14. Jaime, C.; Ortuño, RM; Font, J. Di- i trisupstituirani -laktoni. Konformaciona studija proračunima molekularne mehanike i analizom konstante sprege. J. Org. Chem. 1986, 51, 3946−3951. [CrossRef]

15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Enantiomerno čisti, -epoksiesteri iz -hidroksilaktona: Sinteza -hidroksiestera i (−)-GABOB. Tetrahedron 1990, 46, 4277−4282. [CrossRef]

16. Jaime, C.; Segura, C.; Dinarés, I.; Font, J. Supstituirani -laktoni sa susjednim atomima vodika. Studija konformacije MM2 proračunima i analizom konstante sprege. J. Org. Chem. 1993, 58, 154−158. [CrossRef]

17. Mori, K.; Fukamatsu, K. Sinteza (1R,5S)-( plus )-frontalina iz (S)-(−)-2-hidroksiparakonske kiseline. Liebigs Ann. Chem. 1992, 11, 1191−1193.

18. Miyazawa, M.; Anzai, J.; Fujioka, J.; Ishikawa, Y. Insekticidna jedinjenja protiv Drosophila melanogaster iz Cornus officinalis Sieb. et Zucc. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 337−339. [CrossRef] [PubMed]

19. Lee, CL; Wang, CM; Hu, HC; Jen, HR; Song, YC; Yu, SJ; Chen, CJ; Li, WC; Wu, YC Indol alkaloidi indigo-doli A–C iz nadzemnih dijelova kuhinje Strobilanthes u tradicionalnoj kineskoj medicini Qing Dai imaju anti-IL-17 svojstva. Phytochemistry 2019, 162, 39−46. [CrossRef] [PubMed]

20. Faizi, S.; Ali, M.; Saleem, R.; Irfanullah; Bibi, S. Kompletna 1H- i 13C-NMR dodjela stigma-5-en-3-O- -glukozida i njegovog acetilnog derivata. Magn. Reson. Chem. 2001, 39, 399–405. [CrossRef]

21. Kuo, YH; Chen, CC; Wu, PY; Wu, CS; Sung, PJ; Lin, CY; Chiang, HM Mehanizmi inhibicije melanogeneze izazvane N-(4-metoksifenil) kafeamidom. BMC Complement. Altern. Med. 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]

22. Ohtani, I.; Kusumi, T.; Kashman, Y.; Kakisawa, H. FT NMR visokog polja primjena Mosherove metode. Apsolutne konfiguracije morskih terpenoida. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4092−4096. [CrossRef]

23. Lee, CL; Chang, FR; Hsieh, PW; Chiang, MY; Wu, CC; Huang, ZY; Lan, YH; Chen, M.; Lee, KH; jen, HF; et al. Citotoksični ent-abietan diterpeni iz Gelonium aequoreum. Phytochemistry 2008, 69, 276−287. [CrossRef] [PubMed]

1 Department of Cosmeceutics, Kineski medicinski univerzitet, Taichung 406040, Tajvan.

2 Centar za istraživanje i razvoj kineske medicine, Kineska medicinska univerzitetska bolnica, Taichung 40402, Tajvan.

3 Istraživački centar kineske medicine, Kineski medicinski univerzitet, Tajčung 40402, Tajvan.

4 Odsjek za kineske farmaceutske nauke i resurse kineske medicine, Kineski medicinski univerzitet, Taichung 40402, Tajvan.

5 Graduate Institute of Integrated Medicine, Kineski medicinski univerzitet, Taichung 40402, Tajvan.

6 Proteomics Core Laboratory, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.

For more information:1950477648nn@gmail.com