Tubulozid B iz Cistanche Salse spašava PC12 neuronske ćelije od 1-metil-4-fenilpiridinijum-indukovane apoptoze i oksidativnog stresa

Uvod

Patološki, sporadičnu Parkinsonovu bolest (PD) obično karakteriše gubitak kateholaminergičkih neurona, posebno dopaminergičkih neurona supstancije nigra pars compacta (SNc), i prisustvo karakterističnih intraneurona| inkluzije zvane Lewyjeva tijela u zahvaćenim regijama mozga. Unatoč raznim faktorima koji su uključeni u patogenezu PD, mehanizmi uključeni u inicijaciju i progresiju PD ostaju neizvjesni, iako je i dalje odgovoreno na uzrok PD, nekoliko linija dokaza snažno sugerira uključenost oksidativnog stresa, što je konačno vodeći do smrti neurona ili apoptoze prekomjernim stvaranjem slobodnih radikala. Činjenica da nigralni dopaminergički sistem može proizvesti visoke nivoe slobodnih radikala i da ima relativno nizak nivo oksidativnog odbrambenog sistema dodatno podržava ovu hipotezu. I in vivo i in vitro studije su pokazale neurotoksičnost MPP ＋ posredovanu oksidativnim stresom, aktivnog metabolita l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) na dopaminergičke neurone. Učešće slobodnih radikala prekomjerno proizvedenih oksidativnim stresom kao neposrednog uzroka neurodegenerativnih poremećaja kao što je PD sugerira ključnu ulogu antioksidansa. Tubulozid B (slika l) je jedan od feniletanoidnih jedinjenja izolovanih iz stabljika salse Cistanche. Prethodne studije su otkrile da su mnogi feniletanoidi, uključujući tubulozid B, pokazali jaku aktivnost uklanjanja slobodnih radikala.

Uzimajući u obzir ove nalaze, istražili smo u ovoj studiji učinak tubu]nzida B na neurotoksičnost izazvanu MPP+- in vitro, koristeći ćelijsku liniju feohromocitoma simpatičkog živca PC12 koja je uspješno korištena tokom godina za proučavanje neuronske funkcije.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREVENCIJU PARKINSONOVE BOLESTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materijali i metode

Materijali

Tubuloside B iz Cistanche Salse ljubazno je isporučio dr. Li Lei (Odsjek za prirodne proizvode, Fakultet farmaceutskih nauka, Univerzitet u Pekingu, Peking, Kina). Čistoća jedinjenja bila je više od 98% prema HPLC analizi. Dulbeccov modifikovani orlov medijum (DMEM), konjski serum i fetalni teleći serum kupljeni su od GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridionijum jon (MPP+), poli-L-lizin, 3-(4,{ {8}}dimetil tiazol-2 -il)-2,5- difeniltetrazolijum bromid (MTT), propidijum jodid (PI), RNKaza A, proteinaza K i 2; 7'-dihlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kupljen je od Sigme.

Ćelijska kultura

PCI2 ćelije su održavane u DMEM sa dodatkom 10% konjskog seruma, 5% fetalnog telećeg seruma, 100U/ml penicilina i 100ug/ml streptomicina. Ćelije su kultivisane u vlažnom inkubatoru sa 95% vazduha i 5% CO2 na 37 stepeni. Svi eksperimenti su izvedeni 24-48 h nakon što su ćelije zasijane. Ćelije su rutinski sakupljene tripsinizacijom od 0,25% kada su se ćelije približile subkonfluentnom stadiju i stavljene u tikvice za kulturu od 25 cm podijeljene u omjeru 1:8.

Analiza vitalnosti ćelija

Vijabilnost ćelija je određena korišćenjem modifikovanog MTT testa kao što je prethodno opisano [10], Ukratko, PC12 ćelije su zasijane u 96-ploče sa gustinom od I × 104 ćelije po jažici. Kulture su uzgajane 48 h, a zatim je medij promijenjen u onaj koji sadrži različite koncentracije burnside B ili MPP＋. Nakon inkubacije do 48 h i 72 h, MTr rastvor (5 mg/ml u DMEM) je dodat u 96- ploče sa bunarima, a ćelije su ostavljene da se inkubiraju 4 h na 37 stepeni. Nakon što je medij uklonjen, ćelije i kristali boje su rastvorljivi dodavanjem 200 μL DMSO, a apsorpcija je izmjerena na 570 nm (540 nm kao referenca) sa modelom 550 čitačem mikroploča (Bio-Rad). Vijabilnost ćelija je takođe analizirana metodom isključenja tripan plavog. Ćelije su sakupljene, lagano peletirane i obojene 0,6% rastvorom tripan plavog za 3 kiše. Procenat neobojenih ćelija je naknadno procenjen u deset nasumično odabranih polja mikroskopa. Kao pozitivan lijek korišteno je 100 ng／ml epidermalnog faktora rasta (EGF).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA AKTIVNOST SKLAĐIVANJA SLOBODNIH RADIKALA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Detekcija apoptoze protočnom citometrijom

Apoptotične ćelije su otkrivene protočnom citometrijom upotrebom propidijum jodida (PI) [11]. Ukratko, oko 1 × 106 ćelija inkubiranih sa ispitivanim supstancama sakupljeno je centrifugiranjem i jednom isprano PBS. Ćelije su fiksirane sa 70 % etanola tokom 24 h na - 20 stepeni i jednom isprane sa PBS. Ćelije su zatim resuspendirane u 300 μL PBS-a koji je sadržavao 0,5 mg/ml RNKazeA i 0,5 mg/ml PI. Nakon dalje inkubacije od 30 minuta u mraku, izvršena je protočna citometrija sa FACScan-om (Becton Dickinson, Heidelberg, Njemačka).

Analiza fragmentacije DNK elektroforezom

Primijenili smo Mooreov protokol [12] koji je izolirao samo fragmentiranu DNK i eksperimenti su normalizirani korištenjem jednakog broja kultura iz svake test grupe. Ukratko, 3 × 106 neurona iz svakog od tretiranih uzoraka isprano je u Hankovom izbalansiranom rastvoru soli (1000g tokom 10 min), a pelete formirane na dnu epruvete su homogenizovane sa 1 ml pufera za lizu (10 mM Tris pri pH 7,4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) 20 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 11,000 g za 20 kiše na 4 stepena, supernatanti koji sadrže fragmentiranu DNK su uklonjeni i digestirani sa 20 mg/ml RNase A na 37 stepeni tokom 1 h i 0,1 mg/ml proteinaze K na 56 stepeni za dodatnih 1 h. Fragmentirana DNK je ekstrahirana fenolom i hloroformom i centrifugirana na 10,000g za 1 kišu na 4 C. Vodena faza je prebačena u novu Eppendorfovu epruvetu, pomiješana sa 2 zapremine ledeno hladnog etanola, a zatim stavljen na 20 stepeni najmanje 1 h da se istaloži DNK. Nakon centrifugiranja na 15,000g 20 minuta na 4 stepena, supernatanti su uklonjeni, a DNK pelete su jednom isprane sa 80% etanolom (15.000 g 15 min na 4 stepena), osušene na zraku i rastvorene u 20μL TE pufer na pH 7,6. Cijeli uzorak je zatim podvrgnut elektroforezi na 1,5% agaroznom gelu u trajanju od 1 h na 85 V. Gel je ispitan i fotografiran pomoću Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, SAD).

Mjerenje intracelularnog formiranja ROS

Formiranje intracelularnih peroksida detektovano je konfokalnim skenirajućim laserskim mikroskopom koristeći nefluorescentno jedinjenje, 2"7"-diklorofluorescein diacetat (DCFH-DA) [13], koje se unutar ćelija deesterifikuje endogenim esterazama u slobodne jonizovane kiselina, 2;7"-dihlorofluorescein. 2",7-Dihlorofluorescein je sposoban da se oksidira u fluorescentni 2"7"-dihlorofluorescein (DCF) hidroantioksidansima. Ćelije su inkubirane sa 10 μM DCFH-DA 30 minuta na 37 stepeni. Kulture su dva puta isprane Hankovom izbalansiranom otopinom soli i snimljene u istom mediju. Snimanje je urađeno pomoću konfokalnog skenirajućeg laserskog mikroskopa, DCF je bio pobuđen na 488 nm, a emisioni filter je bio filter barijere od 510 nm. Da bi se obezbijedilo valjano poređenje, isti parametri akvizicije su korišteni za sva opažanja. Postavljena je optimalna vertikalna pozicija u sredini ćelija, a zatim je polje brzo skenirano. Budući da je osvjetljenje na talasnoj dužini pobude od 488 nm izazvalo povećanu fluorescenciju zbog oksidacije ove boje, svako polje je bilo izloženo svjetlosti u isto vrijeme. Polazne vrijednosti iz nestimuliranih stanica korištene su kao kontrolne vrijednosti za poređenje sa MPP＋ tretiranim ćelijama u prisustvu ili odsustvutubulozid B. Nakon skeniranja, prosječni relativni intenzitet fluorescencije u 15-20 tijelima neuronskih ćelija po polju mikroskopa kvantificiran je u četiri odvojene kulture po stanju liječenja.

Statistička analiza

Sve dobijene vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ±SD. Statistička značajnost razlika između grupa određena je Studentovim t-testom; Izračunate p vrijednosti manje od 0.05 smatraju se statistički značajnim.

Rezultati

Kao što je prikazano na slici 2, MPP+ je proizveo smanjenje vitalnosti PCI2 ćelija zavisno od doze. Nasuprot tome, EGF, dobro poznati neurotrofni faktor, proizveo je značajnu zaštitu vitalnosti ćelija pri 100ng/mL MPP＋-inducirani citotoksični efekti također su oslabljeni u prisustvu tubulozida B (5, 10, 50 ili 100 ug-ml{{12} }), iako sa manjom snagom od reference

droga (slika 3). Tubulozid B u ovim koncentracijama pokazao je citoprotektivne efekte na način ovisan o dozi i samo jedinjenje nije izazvalo nikakvu očiglednu citotoksičnost (podaci nisu prikazani). Gel elektroforeza DNK ekstrakta iz PCI 2 ćelija tretiranih sa 200 µM MPP+ tokom 48 sati pokazala je DNK ljestvicu. klasično obeležje apoptoze, tubulozid B, u dozama od 10 i 100 μ g·ml-1 izaziva formiranje DNK merdevine (Slika 4) . Slika．5 prikazuje tipične histograme protočne citometrijske analize apoptotske ćelijske smrti izazvane MPP＋ u PC12 ćelijama u prisustvu ili odsustvu tubulozida B. Kvantifikacija profila ćelijskog ciklusa sa PI otkrila je broj ćelija sa subdiploidnim karakteristikama (M1 regija) ukazuje na apoptotičku fragmentaciju DNK. U netretiranim ćelijama, apoptotička subdiploidna frakcija bila je minimalna do 5．94% od ukupno 10000 ćelija (Slika．5 A). Nakon 48 sati izlaganja MPP＋, postotak apoptoze se povećao na 43．02;j;(Slika 5B)． Kada se doda u ćelijsku kulturu, tubulozid Binhibirao MPP+-indukovanu apoptozuna način ovisan o dozi. U koncentraciji od 10 ug·ml-1zaštita tubulozida B nije bila statistički značajna, ali na 50 i 1 00ug·ml-1, 45 ％ odnosno 63 %, je primećeno. povećanje procenta ćelija preživljavanja (Slika ．5D, E).

Akumulacija intracelularnog ROS-a može se otkriti upotrebom DCFH-DA．PC12 ćelija tretiranih sa 200 uM MPP＋ tokom 48 h, pokazuju intenzivnu fluorescenciju unutar ćelije nakon bojenja DCFH-DA bojom (Slika 6). Istovremeni tretman sa tubulozidom B (u dozama od 10 i 100 ug·ml) inhibirao je MPP＋一 indukovanu proizvodnju ROS (smanjeni procenat je bio 24．52% odnosno 55．63%).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA LIJEČENJE PARKINSONOVE BOLESTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskusija

Patogeneza PD uključuje snažan oksidativni stres, smanjen nivo antioksidansa i mitohondrijalne defekte. za sve je poznato da izazivaju apoptozu u nekoliko ćelijskih sistema. Konkretno, pokazalo se da slobodni radikali izazivaju aktivnu ćelijsku smrt u neuronima[14]. MPTP proizvodi ireverzibilan i ozbiljan Parkinsonov sindrom koji uzrokuje selektivnu degeneraciju nigrostriatalnih dopaminergičkih neurona kod ljudi. Ovaj neurotoksin je korišten za stvaranje. životinjski modeli PD[15]．MPTP se pretvara pomoću monoamin oksidaze B u Mpp＋, koji se akumulira u mitohondrijima. gdje inhibira mitohondrijski kompleks I i taj mitohondrijski dis. funkcija uzrokuje apoptozu[16]. Stoga se neurotoksičnost izazvana MPP+ 一 u dopaminergičkim neuronima intenzivno koristi kao etiološki model PD za skrining neuroprotektivnih agenasa.

U ovoj studiji, pokazali smo da je tubulozid B reducirao ćelijsku smrt izazvanu MPP+- putem oksidativnog stresa u PC12 ćelijama. Nadalje, pokazali smo da tubulozid B također štiti na dozno ovisan način od MPP{{ 3}}indukovana DNK ljestvica i apoptoza, mjereno korištenjem DNK gel elektroforeze i protočne citometrijske analize. Štaviše, istovremeni tretman sa višim koncentracijama tubulozida B inhibirao je proizvodnju ROS-a izazvanu MPP-om. Stoga je tubulozid B pokazao multifunkcionalno neuro-zaštitno djelovanje. Nekoliko mehanizama, odvojeno ili zajedno, može biti uključeno u djelovanje tubulozida B. Antioksidativni učinak je mogući mehanizam za neuroprotekciju posredovanu tubulozidom B. Xiong Q je otkrio da tubulozid B pokazuje jaku aktivnost uklanjanja slobodnih radikala na 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal i ksantin]ksantin oksidazu generiran superoksid anjonski radikal.

Nedavno je objavljeno da nekoliko feniletanoida posjeduju svojstva uklanjanja slobodnih radikala i štite toksične ozljede izazvane oksidativnim stresom. ROS proizveden od strane MPP+, kao što su vodikov peroksid, superoksidni anion i hidroksilni radikal, lako oštećuju biološke molekule, što u konačnici može dovesti do apoptotske ili nekrotične smrti stanice. Stoga, tubulozid B može imati direktne efekte uklanjanja ROS-a. Dok naši podaci ne utvrđuju tačno mjesto na kojem tubulozid B djeluje na suzbijanje akumulacije ROS, oni sugeriraju da neuroprotektivni mehanizam uključuje stimulaciju antioksidativnih puteva. Proučavanje molekularne strukture tubulozida B također ukazuje da on posjeduje moćan kapacitet zauklanjanje slobodnih radikala(osobna komunikacija).

Drugi mehanizmi bi takođe mogli biti relevantni. Na primjer, tubulozid B može imati sposobnost da se suprotstavi toksičnosti MPP＋ inhibicijom otvaranja prelaznih pora mitohondrijalne permeabilnosti i disfunkcije. Osim toga, treba uzeti u obzir da li tubulozid B ima direktan učinak na rast neuronskih stanica. Tačan mehanizam neuroprotektivnog djelovanja tubulozida B ostaje nejasan. Potrebne su dodatne studije kako bi se razjasnila potpuna slika njegovog neuroprotektivnog efekta.

Konačno, tubulozid B izEkstrakt Cistanche salsaima očigledne zaštitne efekte na MPP+-indukovanu apoptozu i oksidativni stres. Njegovi neuroprotektivni efekti protiv MPP ＋ toksičnosti mogu biti važni i sugeriraju da može imati terapeutski potencijal u prevenciji i liječenju PD.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA LIJEČENJE PARKINSONOVE BOLESTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%