Disregulacija RNK prijenosnih elemenata u mutantnim KRAS(G12C) 3D sferoidima raka pluća
Oct 27, 2023
SAŽETAK
Mutantni KRAS reguliše ekspresiju RNK prenosivih elemenata (TE) i interferonom stimulisanog gena (ISG), ali ostaje nejasno da li različite mutacije u KRAS-u utiču na različite TE RNK u čitavom genomu. Analizirali smo transkriptome 3D ljudskih sferoida raka pluća koji sadrže KRAS(G12C) mutacije kako bismo odredili krajolik TE RNA reguliranih mutantnim KRAS(G12C). Otkrili smo da je KRAS(G12C) signalizacija potrebna za ekspresiju LINE- i LTR izvedenih TE RNK koje se razlikuju od TE RNK za koje je ranije pokazano da su regulirane mutantnim KRAS(G12D) ili KRAS(G12V). Štaviše, KRAS(G12C) inhibicija specifično reguliše TE RNK izvedene iz SINE iz najmlađe Alu podfamilije AluY. Naši rezultati otkrivaju da je disregulacija TE RNK u ćelijama raka pluća izazvana KRAS-om ovisna o mutaciji, dok također ističu podskup mladih TE RNA dobivenih od Alu-a koji se koordinirano aktiviraju s genima urođenog imuniteta nakon inhibicije KRAS(G12C).
Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor
UVOD
RNK transpozibilnog elementa (TE) su stalno disregulirane u kontekstu raka 1. U mutantnim KRAS ćelijama raka pluća, KRAB cink-prsti (KZNF) geni su u velikoj mjeri smanjeni, što dovodi do aberantne regulacije TE RNA izvedene iz LINE, SINE i LTR elementi 2,3. Pored TE RNK, duge nekodirajuće RNK (lncRNA) su također koordinirano regulirane sa RAS signalnim genima 4, a njihovi ekspresijski obrasci su na sličan način promijenjeni kod mnogih karcinoma 5-8. Za TE RNK, njihova pojačana regulacija kod raka izaziva stanje virusne mimikrije, što dovodi do intrinzične aktivacije gena urođenog imuniteta kao što su geni stimulirani interferonom (ISG) 3,9,10. Konkretno, Alu porodica SINE je dominantan izvor imunogenih TE RNK 11, koje su inducirane epigenetskim promjenama uzrokovanim inhibitorima DNK metiltransferaze (DNMTi) ili mutantnom KRAS-posredovanom inhibicijom KZNF 3,9,10.
Da bismo istražili kako uobičajena mutacija u KRAS-u utječe na TE RNA krajolik u stanicama raka pluća, okarakterizirali smo transkriptome 3D sferoida raka pluća koji sadrže KRAS(G12C) mutacije u prisustvu ili odsustvu mutantnog KRAS(G12C) inhibitora 12. Pokazali smo da je KRAS(G12C) signalizacija potrebna za ekspresiju LINE i LTR izvedenih TE RNK, dok inhibicija KRAS(G12C) specifično pojačava TE RNK izvedene iz SINE i podskup gena povezanih s interferonom (IFN). Naši nalazi otkrivaju složenu interakciju između mutantne KRAS signalizacije i TE disregulacije u ćelijama raka pluća, gdje se definirani skup mladih AluY elemenata povećava na način koji ovisi o mutaciji.
Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor
REZULTATI
KRAS(G12C) inhibicija mijenja kodirajući i nekodirajući transkriptom
Da bismo utvrdili kako onkogena KRAS(G12C) signalizacija regulira kodirajući i nekodirajući transkriptom, izvršili smo sekvenciranje RNA (RNA-seq) na 3D mutantnim KRAS(G12C) sferoidima raka pluća. Za RNA-seq, koristili smo protokol pune dužine sa 5' jedinstvenim molekularnim identifikatorima (UMI) kako bismo omogućili precizno brojanje RNA uz ublažavanje pristranosti PCR amplifikacije 13 (Slika 1A). Uporedili smo transkriptome sferoida raka pluća H358 tretiranih KRAS(G12C) inhibitorom ARS-1620 (ARS) sa kontrolnim sferoidima (tretiranim DMSO) (slika S1A) i vidjeli da liječenje ARS-om značajno smanjuje nivoe fosforiliranog ERK-a (p-ERK) (Slika S1B), što ukazuje da je tretman ARS inhibirao nizvodno KRAS(G12C) signalizaciju. Supresija KRAS(G12C) signalizacije ARS tretmanom je takođe dokazana smanjenjem veličine sferoida i vitalnosti ćelije (Slike S1C i S1D).
Na nivou RNK, procijenili smo relativnu količinu različitih biotipova i TE superfamilija u 3D sferoidima raka pluća tretiranim ARS ili DMSO, što je otkrilo dinamičke promjene u sastavu TE RNK nakon inhibicije KRAS(G12C) (Slika 1B). Dok smo otkrili samo 32% gena za kodiranje proteina označenih GENCODE-om i 15% gena lncRNA, 92-96% TE superfamilija (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) je bilo zastupljeno u našim UMI-označenim RNA-seq podaci, koji otkrivaju široku disregulaciju TE RNA u transkriptomu vođenom KRAS(G12C). Do četvrtine svih otkrivenih RNA molekula u sferoidima raka pluća tretiranih ARS-om izvedeno je iz TE, što ukazuje da TE RNA predstavljaju značajan dio transkripcionog izlaza mutantnih KRAS(G12C) ćelija raka pluća.
cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem
Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Zatim smo odredili značajno različito eksprimirane gene između 3D sferoida raka pluća tretiranih ARS-om i DMSO-om kako bismo identificirali biološke procese koji su regulirani onkogenom KRAS(G12C) signalizacijom. Sferoidi raka pluća sa intaktnom KRAS(G12C) signalizacijom su značajno obogaćeni za gene uključene u G2M kontrolnu tačku, E2F mete, MYC ciljeve i mitotičko vreteno (slika 1C). Međutim, nakon inhibicije KRAS(G12C), sferoidi raka pluća su eksprimirali značajno više razine gena uključenih u oksidacijsku fosforilaciju, komplement i IFN alfa i gama odgovore (slika 1C), pružajući daljnje potkrepljujuće dokaze za uključenost KRAS signalizacije u regulaciju gena vezanih za IFN 2,3.
KRAS(G12C) inhibicija koordinira inducira ISG i mlade AluY elemente
Da bismo dalje razjasnili intrinzičnu regulaciju ISG-a nakon inhibicije KRAS(G12C), identifikovali smo koji geni i TE su značajno različito eksprimirani u svakom skupu gena i TE superfamiliji, respektivno. U oba gena za IFN alfa i IFN gama odgovor, najjače inducirani gen nakon inhibicije KRAS(G12C) u sferoidima raka pluća bio je RTP4 (Slika 2A), protein transporter receptora koji negativno reguliše TBK1 signalizaciju 14. Dodatno, kompleks MHC klase I gen beta-2-mikroglobulina (B2M), koji se rekurentno inaktivira kod karcinoma pluća 15, također je značajno pojačan u oba seta gena povezanih s IFN-om kod sferoida raka pluća tretiranih ARS (Slika 2A).
S obzirom na direktnu ulogu onkogene KRAS signalizacije u regulaciji 3 TE RNA, istražili smo koje su podfamilije TE RNA zavisne od mutantnog KRAS(G12C). U sferoidima karcinoma pluća sa intaktnom KRAS(G12C) signalizacijom, otkrili smo da su LINE potfamilije L1M6B i L1PA12 bile visoko eksprimirane i zavisne od KRAS(G12C), što je dokazano njihovom smanjenom regulacijom u sferoidima raka pluća liječenim ARS (Slika 2B). Štaviše, dok je samo jedna DNK podfamilija MER44D ovisila o KRAS(G12C) signalizaciji, preko desetak LTR podfamilija je regulirano mutantnim KRAS(G12C), uključujući MLT1A0-int, LTR51, MER50B i LTR1B0 (Slika 2B). Nasuprot tome, sve podfamilije SINE bile su značajno povećane nakon inhibicije KRAS(G12C) i koordinirano inducirane specifičnim ISG genima (slika 2A) u sferoidima raka pluća. Sve ove SINE TE RNK su izvedene iz podfamilije AluY (slika 2B), što ukazuje da inhibicija KRAS(G12C) disreguliše specifičnu podskupinu mladih AluY elemenata.
KRAS(G12C) inhibicija smanjuje regulaciju dugih nekodirajućih RNK
Da bismo dalje razjasnili efekte inhibicije KRAS(G12C) na transkriptom, ispitali smo sve značajno različito eksprimirane lncRNA u sferoidima raka pluća tretiranih ARS ili DMSO kontrolom. Otkrili smo da je veliki broj lncRNA zavisan od KRAS(G12C) signalizacije za njihovu ekspresiju, jer su mnoge od ovih lncRNA bile značajno smanjene nakon inhibicije KRAS(G12C) (slika 3A). Tri od ovih smanjenih lncRNA, AC114546.3, NCMAP-DT i AC073575.2, nemaju poznate funkcije, ali se preklapaju u antisens orijentaciji na kodirajuće gene ZNF770, RCAN3 i ERP29, respektivno. Kao klasu nekodirajuće RNK, uočili smo široku regulaciju lncRNA nakon tretmana ARS kod sferoida raka pluća (slika 3B), što ukazuje da mnoge lncRNA zavise od KRAS(G12C) signalizacije za njihovu ekspresiju.
cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem
DISKUSIJA
Ovdje pokazujemo da je onkogena KRAS(G12C) signalizacija potrebna za ekspresiju specifičnih TE superfamilija, naime LINE i LTR elemenata, kao i podskupa lncRNA, što dalje pokazuje kako RAS signalizacija reguliše nekodirajući transkriptom 2-4. Također smo koristili 3D model sferoida raka pluća za naše eksperimente s inhibitorom KRAS(G12C) budući da se pokazalo da 3D modeli vjernije rekapituliraju in vivo odgovor na lijekove u poređenju sa 2D modelima kulture 16. Nadalje, naša primjena potpunog UMI baziranog Tehnika RNA-seq dužine 13 omogućila nam je da preciznije uhvatimo sastav i dinamiku TE RNK u našim sferoidima raka pluća uklanjanjem PCR duplikata u našim RNA-seq podacima.
Naši nalazi su u skladu s prethodnim studijama inhibicije KRAS(G12C), gdje su geni IFN alfa i gama odgovora bili pojačano regulirani u ARS-liječenim ćelijama raka pluća H358 17. Na osnovu poznatih imunogenih svojstava RNK dobijenih od Alu 11, naši rezultati sugeriraju da specifična regulacija mladih AluY elemenata nakon inhibicije KRAS(G12C) je barem dijelom odgovorna za snažnu regulaciju ISG-a u sferoidima raka pluća tretiranih ARS. Značajno obogaćivanje gena povezanih s IFN-om kao odgovor na liječenje inhibitorima KRAS(G12C) ne uključuje daljnju regulaciju ISG senzora RNA kao što su MDA-5, RIG-I ili PKR, koji se inicijalno povećavaju u ćelije pluća kao odgovor na onkogenu KRAS signalizaciju 2,3.
Ranije smo pokazali da je samo mutantna KRAS signalizacija dovoljna da inducira regulaciju TE RNK u ljudskim plućnim stanicama koje su transformirane in vitro 2,3, a naši rezultati opisani ovdje proširuju ova opažanja na ćelije raka pluća s različitom aktivirajućom mutacijom KRAS. KRAS(G12D) ili KRAS(G12V) mutacije induciraju značajnu regulaciju LTR12C podfamilije u transformiranim plućnim stanicama 3, ali nismo vidjeli značajno obogaćivanje TE RNA dobijenih iz LTR12C u našim KRAS(G12C) sferoidima raka pluća. Umjesto toga, vidjeli smo povećanje regulacije LTR51, LTR1B0, LTR14B i LTR28B, što sugerira da različite mutacije pojačanja funkcije u KRAS-u regulišu različite aspekte TE RNA transkriptoma.
Naš rad pruža sveobuhvatnu procjenu kako nekodirajući/TE RNA transkriptom dinamički odgovara na KRAS(G12C) inhibiciju. Buduće studije mogu pružiti nove uvide u potencijalnu ulogu nekodirajućih/TE RNK u mehanizmima rezistencije na KRAS(G12C) inhibitor. Nadalje, TE RNA koje se luče iz ćelija raka nakon inhibicije KRAS-a mogu poslužiti kao ekstracelularni RNA biomarkeri 2,3,5,18,19 odgovora i/ili rezistencije na terapije inhibitorima KRAS 20.
MATERIJALI I METODE
Ćelijske linije
Ćelijske linije raka pluća H358 koje sadrže KRAS(G12C) mutaciju uzgajane su u mediju RPMI 1640 (Invitrogen) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Sigma) na 37 stepeni, 5% CO2 u vlažnom inkubatoru. Sve ćelijske linije su bile negativne na mikoplazmu. Ćelijske linije su kupljene od American Type Culture Collection (ATCC).
Testovi vitalnosti ćelija
Za testove vijabilnosti sferoida, 10,000 ćelija/jažici je zasijano u ploče sa okruglim dnom 96-jažica niske adhezije i inkubirano na 37 stepeni, 5% CO2 tokom 24 sata. Zatim su ćelijama dodani serijski razrijeđeni ARS- 1620 ili DMSO, a ploče su inkubirane u standardnim uslovima kulture 72 sata, sa svakodnevnom zamjenom svježeg ARS i DMSO medija. Vijabilnost ćelija je merena korišćenjem Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kita (Promega) prema protokolu proizvođača. Signal luminiscencije uzoraka tretiranih ARS normaliziran je na DMSO kontrolu. Luminescencija je mjerena na SpectraMax iD3 molekularnom uređaju.
RNA izolacija
Ukupna masa RNK je izolirana iz približno 100 H358 sferoida (po stanju) korištenjem Quick-RNA Mini-Prep kita (Zymogen) prema protokolu proizvođača. RNK je kvantificirana putem NanoDrop{4}} spektrofotometra.
Priprema biblioteke RNA-seq
Prilagođeni Smart-seq3 protokol 13 korišten je za generiranje RNA-seq biblioteka iz ukupne RNK za brojanje i procjenu RNA molekula pune dužine. Ukratko, 10 ng ukupne RNK je reverzno transkribovan korišćenjem oligoDT prajmera (125 nM), nakon čega je usledilo prebacivanje šablona sa oligo preklopnikom šablona sa bar kodom (125 nM). Ove oligo sekvence su služile kao prajmeri za PCR amplifikaciju. Nextera HT kit (Illumina) korišten je za pretvaranje cDNK biblioteka u biblioteke za sekvenciranje uz dodatak prajmera specifičnog za UMI za amplifikaciju krajeva cDNK koji sadrže molekularne barkodove kako je opisano u Smart-seq3 protokolu. cDNK i kvalitet biblioteke su procijenjeni korištenjem Agilent bioanalizer DNK čipa visoke osjetljivosti i kvantificirani korištenjem DNK analize visoke osjetljivosti na Qubit 3.0.
Western blot
Približno 100 H358 sferoida (po stanju) je izolovano nakon tretmana ARS ili DMSO. Sferoidi su zatim inkubirani na ledu u RIPA puferu sa dodatkom inhibitora proteaze 15 minuta. Lizati su zatim centrifugirani na 10,000 RCF 10 minuta. Supernatant je zatim prebačen u novu epruvetu za naknadnu pripremu SDS-PAGE uzorka u Laemmli puferu, kuvan 5 minuta na 95 C do konačne koncentracije od 1 mg/ml. SDS PAGE je izveden za razdvajanje proteina po veličini, nakon čega je uslijedio prijenos na PVDF membranu. Membrane su inkubirane sa primarnim p-ERK (CST) i HSP90 (CST) antitelima preko noći na 4 C. Sekundarna antitela (Abcam) su zatim inkubirana na 3 puta ispranim TBST membranama u puferu za blokiranje za naknadno snimanje.
cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem
UMI deduplikacija
Upareni očitavanja krajnjeg svjetla su isječeni adapterom pomoću FastP 21 sa zadanim postavkama. UMI-ovi su ekstrahovani iz pročitanog i premješteni u readname koristeći umi_tools_izvod iz paketa UMI-tools 22 sa uzorkom barkoda postavljenim na "NNNNNNNN". UMI uklonjena očitavanja su poravnata u odnosu na HG38 pomoću STAR poravnanja sa skupom napomena GENCODE v38. Poravnana čitanja su uklonjena pomoću "UMI-tools dedup" sa zadanim postavkama.
RNA-seq analiza
Svi fastq fajlovi su izrezani sa Trimmomatic 2 (0.38) 23, a rezultujući obrezani fajlovi su procijenjeni sa FastQC 24, a zatim obrađeni sljedećim analitičkim kanalom: Salmon (1.3.0): pseudousklađivanje RNA -seq čitanja obavljena sa Salmon 25 koristeći sljedeće argumente: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 koristeći indeks kreiran iz GENCODE verzije 35 transkriptom fasta fajla koristeći mamce sekvence kako bi se omogućilo selektivno poravnanje. Dodatni, TE-svjestan indeks kreiran je na sličan način, ali dopunjen sekvencama generiranim iz UCSC Repeat Masker trake. DESeq2 (1.32.0): Salmon izlaz je uvezen u DESeq objekat koristeći tximport 26 i analiza diferencijalnog izraza je izvedena sa standardnim argumentima 27. Svi rezultati su filtrirani da imaju padj < 0,05. Tamo gdje su korišteni podaci o brojanju, normalizirani su po uzorcima pomoću DESeq-a.
Analiza obogaćivanja genskog skupa
Diferencijalno izraženi geni su rangirani prema skupljenim vrijednostima log2FoldChange koje je generirao DESeq2. Skupovi gena su nabavljeni pomoću R paketa msigdbr (7.4.1) i filtrirani da sadrže samo setove gena sa statusom 'Hallmark'. R paket fgsea (1.18.0) je korišten za generiranje procjena obogaćivanja skupa gena koje su filtrirane do rezultata s prilagođenim pvrijednostima < 0.05.
REFERENCE
1. Burns, KH (2017). Prenosivi elementi kod raka. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Epigenomsko reprogramiranje ponavljajućih nekodirajućih RNA i gena stimuliranih IFN-om od strane mutantnog KRAS-a. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L ., et al. (2022). Mutantni KRAS reguliše RNK prenosivog elementa i urođeni imunitet preko KRAB gena cinkovog prsta. Cell Reports 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, i Wold, BJ (2015). Analiza transkriptoma jedne ćelije otkriva dinamičke promjene u ekspresiji lncRNA tokom reprogramiranja. Matična ćelija 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV, i Kim, DH (2022). LncRNA biomarkeri upale i raka. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Schmitt, AM, i Chang, HY (2016). Duge nekodirajuće RNA u putevima raka. Ćelija raka 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Rinn, JL, i Chang, HY (2020). Duge nekodirajuće RNA: molekularni modaliteti za funkcije organizma. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem{7}}.
8. Slack, FJ, i Chinnaiyan, AM (2019). Uloga nekodirajuće RNK u onkologiji. Ćelija 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., et al. (2015). Inhibiranje metilacije DNK uzrokuje interferonski odgovor kod raka putem dsRNA, uključujući endogene retroviruse. Ćelija 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.
10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J., et al. (2015). Sredstva za demetilaciju DNK ciljaju ćelije raka debelog crijeva indukcijom virusne mimikrije endogenim transkriptima. Ćelija 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.
11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S ., et al. (2020). Epigenetska terapija inducira transkripciju invertiranih SINE-ova i ovisnost o ADAR1. Priroda 588, 169-173. 10.1038/s41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, i Shokat, KM (2013). K-Ras(G12C) inhibitori alosterički kontrolišu GTP afinitet i efektorske interakcije. Priroda 503, 548- 551. 10.1038/nature12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, i Sandberg, R. (2020). Brojanje jednoćelijske RNK u rezoluciji alela i izoforme pomoću Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10.1038/s41587-020- 0497-0.
14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020). RTP4 inhibira IFN-I odgovor i pojačava eksperimentalnu cerebralnu malariju i neuropatologiju. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G., et al. (2017). Genomsko profilisanje ksenotransplantata dobijenih od pacijenata za rak pluća identifikuje B2M inaktivaciju koja narušava imunoprepoznavanje. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D., i Gomperts, BN (2022). Trodimenzionalni modeli pluća: prošlost, sadašnjost i budućnost: mini pregled. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P., et al. (2022). Terapeutska inhibicija KRAS(G12C) pokreće efikasan antitumorski imunitet posredovan interferonom kod imunogenih karcinoma pluća. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., i Kim, DH (2022). Ekstracelularni RNK potpisi mutantnih KRAS(G12C) ćelija adenokarcinoma pluća. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, i Demirci, U. (2021). Ka izolaciji i detekciji egzozoma zasnovanoj na mikrofluidima za terapiju tumora. Nano Danas 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., i Malek, S. (2021). RAS ciljane terapije. Nat Rev Drug Discov. 10.1038/s41573-021-00220-6.
21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., i Gu, J. (2018). fastp: ultra-brzi sve-u-jednom FASTQ predprocesor. Bioinformatika 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatics/bty560.
22. Smith, T., Heger, A. i Sudbery, I. (2017). UMI-alati: modeliranje grešaka sekvenciranja u jedinstvenim molekularnim identifikatorima radi poboljšanja tačnosti kvantifikacije. Genom Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.
23. Bolger, AM, Lohse, M., i Usadel, B. (2014). Trimmomatic: fleksibilni trimer za Illumina sekvence podataka. Bioinformatika 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatics/btu170.
24. Brown, J., Pirrung, M., i McCue, LA (2017). FQC Dashboard: integriše FastQC rezultate u web-bazirani, interaktivni i proširivi FASTQ alat za kontrolu kvaliteta. Bioinformatika. 10.1093/bioinformatics/btx373.
25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, i Kingsford, C. (2017). Losos omogućava brzu kvantifikaciju ekspresije transkripta sa svesnom pristrasnošću. Nat metode 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Soneson, C., Love, MI i Robinson, MD (2015). Diferencijalne analize za RNA-seq: procjene na nivou transkripta poboljšavaju zaključke na nivou gena. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Love, MI, Huber, W. i Anders, S. (2014). Umjerena procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke sa DESeq2. Genom Biol 15, 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8.
ZAHVALNICA
Zahvaljujemo članovima Kim Lab-a na korisnim raspravama. Ovaj rad je podržan sredstvima Baskin School of Engineering (do DHK). DC je podržan od strane Predoctoral Fellowship Award iz Programa za istraživanje bolesti povezanih s duhanom (T30DT0997), RER je podržan od strane F99/K00 NIDDK KUH Preddoktorske na Postdoctoral Fellow Transition Award od Nacionalnog instituta za zdravlje (1F99DK{ {7}}), a potpredsjednik je podržan od strane Predoctoral Fellowship Award iz Programa za istraživanje bolesti povezanih s duhanom (T32DT4904).
DOPRINOSI AUTORA
DHK je koncipirao istraživanje, DC i DHK su dizajnirali istraživanje, DC, JL i GM su izvodili eksperimente, RER i VP su analizirali podatke, a DC i DHK su napisali rad uz doprinose autora.
FIGURE
Slika 1. KRAS(G12C) inhibicija mijenja kodirajući i nekodirajući transkriptom A. Eksperimentalna šema. B. Distribucija broja koji je dodijeljen GENCODE kodirajućim, lncRNA i TE/ponavljajućim superfamilijama u ARS-tretiranim (ars) ili DMSO-tretiranim (dmso) sferoidnim RNA-seq bibliotekama raka pluća, gdje svaka kolona predstavlja biološku repliku. C. Rezultati analize obogaćivanja značajnog skupa gena uočeni kod sferoida karcinoma pluća tretiranih DMSO (desno, pozitivan NES) ili ARS (lijevo, negativan NES) koristeći različito eksprimirane gene rangirane prema normaliziranom rezultatu obogaćivanja (NES).
Slika 2. KRAS(G12C) inhibicija koordinira inducira ISG i mlade AluY elemente
A. Vulkanski dijagrami koji prikazuju značajnu diferencijalnu ekspresiju uočenu u ključnim genskim skupovima između sferoida raka pluća tretiranih DMSO (desno, pozitivna promjena nabora) ili ARS-tretiranih (lijevo, negativna promjena nabora). B. Vulkanski dijagrami koji prikazuju značajnu diferencijalnu ekspresiju uočenu u TE superfamilijama između DMSO tretiranih (desna, pozitivna promjena nabora) ili ARS tretiranih (lijevo, negativna promjena nabora) sferoida raka pluća.
Slika 3. Inhibicija KRAS(G12C) smanjuje regulaciju dugih nekodirajućih RNK
A. Vulkanski dijagram značajne diferencijalne ekspresije RNK koje kodiraju protein GENCODE i lncRNA između DMSO tretiranih (desno, pozitivna promjena nabora) ili ARS tretiranih (lijevo, negativna promjena nabora) sferoida raka pluća. B. Boks dijagram značajne diferencijalne ekspresije RNK koje kodiraju protein GENCODE i lncRNA između DMSO tretiranih (gornja, pozitivna promjena nabora) ili ARS tretiranih (donja, negativna promjena nabora) sferoida raka pluća (Wilcoxon).
DODATNA FIGURA
Slika S1.
A. H358 3D sferoidi raka pluća liječeni ARS ili DMSO. B. Western blot za p-ERK i HSP90 koristeći H358 3D sferoide raka pluća tretirane ARS ili DMSO. C. Mjerenja prečnika (u mikrometrima) (lijeva grafika) i vitalnost ćelije (vijabilnost ćelije Titer-Glo® luminescentne ćelije u relativnim jedinicama fluorescencije) (desna grafika) H358 3D sferoida raka pluća tretiranih ARS ili DMSO nakon 3 ili 5 dana tretmana (500 nM ARS-1620 ili DMSO). D. Mjerenja promjera (u mikrometrima) H358 3D sferoida raka pluća tretiranih različitim koncentracijama ARS-1620 (nM) tokom 7 dana.
