Sklapanje transkriptoma i otkriće gena mesnate stabljike Cistanche Deserticola-Ⅱ

Funkcionalna klasifikacija svih izraženih transkripata zasnovana na ontologiji gena i bazama podataka KEGG

Gene ontology (GO) anotacija je dobivena iz UniProt anotacije i datoteke asocijacije identiteta. Ukupno, 20.907 transkripata, što čini 32,69% od ukupno izraženih sekvenci, dodeljeno je 1.745 funkcionalnih termina. Od ukupnih funkcionalnih termina GO, pripisivanja biološkom procesu činili su većinu (1.116, 63,95%), zatim ćelijska komponenta (329, 18,85%) i molekularna funkcija (300, 17,20%). Dodijeljene funkcije ekspresiranih transkripata pokrivale su širok raspon kategorija GO, a 10 najboljih GO pojmova sa najnaglašenijim transkriptima je navedeno u Tabeli 3. Pružamo distribuciju svih izraženih transkripata u tri kategorije ontologije gena (molekularna funkcija, ćelijska komponenta i biološki proces) u dopunskoj datoteci (S3 Dataset). GO termini koji se odnose na funkcije vezivanja i aktivnost transferaze bili su pretežno zastupljeni u kategoriji molekularne funkcije. Što se tiče funkcija vezivanja, najzastupljenije je vezivanje katjona (4.394 transkripta), zatim vezivanje nukleotida/nukleozida (3.404 transkripta u prosjeku) i vezivanje za protein (2.422 transkripta). Dok u grupi sa aktivnošću transferaze, najviše je onih sa transfernim grupama koje sadrže fosfor (2.256 transkripata, 65,77%). U kategoriji ćelijskih komponenti transkripti su više locirani intracelularno (10.581 transkript u prosjeku), dok su u kategoriji bioloških procesa transkripti bili više uključeni u metabolički proces biopolimera (6.683 transkripta u prosjeku), nakon čega slijedi regulacija ćelijskog procesa (4.841 transkript ), ekspresija gena (4.678 transkripata) i transport (3.512 transkripata).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREVENCIJU ALZHEIMEROVE BOLESTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Za rudarenje gena uključenih u biosintezu lignina i PhG, pretraženo je 21.358 neredundantnih potencijalnih proteinskih sekvenci u odnosu na sekvence gena 13 biljnih organizama u bazi podataka KEGG, i oni su dodijeljeni 275 KEGG puteva sa najmanje 5 pogodaka. Prvih 10 puteva s najviše usklađenih sekvenci je navedeno u Tabeli 4. Većina puteva je uključena u primarne metaboličke procese, kao što su metabolizam aminokiselina ili proteina (ko01230, ko04141 i ko04120), metabolizam ugljikohidrata (ko01200 i ko00500) i nukleotida metabolizam nukleozida (ko03018, ko00230 i ko00240). Osim toga, postoji 27 sekundarnih puteva povezanih s metabolizmom (slika 2), kao što su biosinteza terpenoidne kičme, biosinteza fenilpropanoida, biosinteza karotenoida, biosinteza izohinolinskih alkaloida i biosinteza alkaloida tropana, piperidina i piridina. Ovi rezultati daju dodatnu indikaciju da su aktivni metabolički procesi u tokuC. deserticolatkivo stabljike. Svi izraženi transkripti povezani sa KEGG putevima navedeni su u dodatnom fajlu (S4 Dataset). Iako postoje neki značajno promijenjeni putevi između C. deserticola i drugih biljaka, kao što je riža (S5 Dataset), naš glavni cilj u ovoj studiji je otkriti cijeli profil transkriptoma stabljike C. deserticola i prikazati povezane puteve biosinteze PhGs što bi moglo biti korisno za vođenje kultivacije.

Geni kandidati koji kodiraju enzime uključene u biosintezu lignina

Lignin je drugi najzastupljeniji prirodni kopneni polimer u biljnom carstvu, koji čini do jedne trećine materijala koji se nalazi u zidovima biljnih ćelija. Kao važna komponenta ćelijskih zidova, lignini pomažu u transportu vode, pružaju mehaničku podršku i strukturni integritet, te brane od patogena i biljojeda. Te uloge lignina su vrlo vrijedne u podržavanju podzemnog erektivnog rasta C. deserticola u pustinji. U ovoj studiji predstavili smo kompletnu sliku puteva biosinteze lignina u C. deserticola (slika 3), u kojoj se monomeri lignina biosintetiziraju iz fenilalanina kroz niz enzimskih reakcija, uključujući hidroksilaciju, metilaciju, redukciju i proces oksidativne polimerizacije. Enzimi povezani s biosintezom lignina otkriveni su za tri uglavnom sintetizirana oblika u vaskularnom tkivu (p-hidroksil-fenil (H), gvajacil (G) i siringil (S) lignin) i 5-hidroksil-guaiacil lignin koji je tek identificiran u COMT (kafeinska kiselina 3-O-metiltransferaza, EC 2.1.1.68) deficitarnim biljkama (kao što je srušena).

Fenilalanin amonijak-lijaza (PAL, EC 4.3.1.24) je prvi ključni enzim u putu biosinteze lignina (slika 3) koji transformiše fenilalanin u cimetnu kiselinu neoksidativnom deaminacijom. Ukupno 6.297 PAL očitavanja je sekvencirano i 7 PAL transkripata je sastavljeno u C. deserticola (Tabela 5). Poređenjem sličnosti sekvenci, otkrili smo da 4 od njih (comp28550_c1_seq1/2/3/5) imaju više od 95% sličnosti sa poznatom sekvencom mRNA C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), dok su comp28550_c1_seq4 i comp{25}}c0_seq1 imali 77% i 82% sličnosti, respektivno. ORF predviđanje je otkrilo da 5 transkripata ima potencijal kodiranja proteina i nosi domen aromatične aminokiseline (PF00221.14). Među njima, samo comp{33}}c1_seq4 transkript može kodirati kompletnu sekvencu proteina od 718 aminokiselinskih ostataka. Prijavljeno je da je PAL kodiran od strane male multigenske porodice u većini biljnih vrsta, kao što su 4 u Arabidopsis thaliana, 5 u Populus trichocarpa, 3 u Scutellaria baicalensis, i 7 Cucumis sativus, itd. Naša filogenetska analiza sugerira da postoje 4 PAL-kodirajući geni u C.

deserticola i nazvali smo ih CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 i CdPAL4, redom (S2 sl.). 4-kumarat-CoA ligaza (4CL, EC 6.2.1.12) i trans-cinamat 4-monooksigenaza (CYP73A, EC 1.14.13.11) su dva enzima odgovorna za transformaciju cimetove kiseline u dikumarol-CoA u dvije obrnute naređenja. Oni su takođe u okosnicama, a njihove ekspresne FPKM vrednosti su 39,57 i 51,93, respektivno.

Četiri tipa lignina su biosintetizovane različitim putevima koji su kontrolisana tri ključna enzima, cinamoil-CoA reduktaza (CCR, EC 1.2.1.44), šikimat o-hidroksicinamoiltransferaza (HCT, EC 2.3.1.133{1{ferulat) {56}}}}hidroksilaza (F5H, EC 1.14.-.-). CCR je prijavljen kao kontrolna tačka puta lignina [50, 51] koji je katalizirao X-CoA (X uključujući dikumarol, kafeoil, feruloil, 5-hidroksil-feruloil i sinapoil) u Y-aldehid (Y uključujući p -kugar, kafeoil, koniferil, 5-hidroksil-koniferil i snap), dok je HCT katalizirao p-kumaroil-CoA u p-kumaroil šikimsku kiselinu/p-kumaroil kininsku kiselinu. Dva enzima su, baš kao prekidač, regulisala biosintezu P-hidroksil-fenil lignina ili druge tri vrste lignina. F5H je bio još jedan prekidač koji je regulisao siringil lignin i 5-hidroksil-gvajacil lignin. Ostali važni enzimi uključujući kafeinsku kiselinu 3-O-metiltransferazu (COMT, EC 2.1.1.68), kafeoil-CoA O-metiltransferazu (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) i cinamil-alkohol dehidrogenazu (CAD1.11 EC.195 ) također su otkriveni izraženi. Detaljne informacije o ekspresiji su navedene u Tabeli 6. Ovi enzimski geni identificirani u ovoj studiji pružit će vrijedan resurs za funkcionalne genomske studije ove važne ljekovite biljke. 10 gena vezanih za put biosinteze lignina u Tabeli 6 odabrano je za RT-qPCR verifikaciju kako bi se potvrdili naši RNAseq rezultati (slika 4), a njihove visoke korelacije (Pearsonov koeficijent korelacije: 0,90343) ukazuju na visoku tačnost i reproduktivnost naše analize transkriptoma. S1 skup podataka navodi sekvence prajmera korišćene u ovoj analizi.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Geni kandidati koji kodiraju enzime uključene u biosintezu PhGs

Poznato je da su feniletanoidni glikozidi (PhG) primarni aktivni sastojci u C. deserticola sa aktivnostima poboljšanja seksualne potencije, uklanjanja slobodnih radikala i protiv starenja. Tri hemijske komponente PhG su organska kiselina, saharid i feniletanol aglikon (slika 3). Organske kiseline uključujući kafeinsku kiselinu, ferulinsku kiselinu i kumaličnu kiselinu su produkti puta biosinteze fenilpropanoida. Komponente saharida uključujući glukozu i ramnozu su produkti puteva metabolizma ugljikohidrata, kao što su metabolizam škroba i saharoze, metabolizam amino šećera i nukleotidnog šećera, metabolizam fruktoze i manoze, itd. Međutim, put biosinteze feniletanolnog dijela još nije jasan. Ovdje smo predložili dva moguća puta biosinteze feniletanola na osnovu naših podataka o sekvenci. Jedan je prijavljeni put kafeinske kiseline ili ferulinske kiseline, također poznat kao put cimetne kiseline koji je sličan putu kičme biosinteze lignina. Drugi se zasniva na putu metabolizma fenilalanina (slika 3), u kojem je fenilalanin do feniletanola postignut poznatim 'Enrlichovim putem' koji je prvi put pronađen u kvascu prije jednog stoljeća i potvrđen u cvjetovima petunije, paradajzu i ruži. Četiri gena enzima koji kodiraju aspartat/tirozin aminotransferazu, histidin-fosfat aminotransferazu i primarnu-amin oksidazu koji su odgovorni za konverziju fenilalanina u feniletanol su otkrivena eksprimirana u stabljici C. deserticola. Produkt fenil etanola može se dalje oksidirati monooksigenazom ili metilirati metiltransferazom u njegove derivate (fenil etanol aglikon) koji učestvuju u biosintezi PhG. Ukratko, dva pretpostavljena puta biosinteze feniletanol aglikona su predložena zaC. deserticolaali još uvijek treba dalje proučavati.

Diskusije

Posljednjih godina, biljna genomika se brzo razvijala primjenom tehnologije sekvenciranja sljedeće generacije, dok je malo istraživanja bilo usmjereno na genomiku pustinjskih ljekovitih biljaka. Hitno je potrebno izvršiti genomsko ili transkriptomsko istraživanje kako bi se razumjela njegova adaptacija na sušu i salinitet okruženja i put biosinteze glavnih bioaktivnih komponenti. De novo otkriće transkriptoma za neke medicinske biljke,

kao što su Panax ginseng, Ginkgo biloba i Glycyrrhiza uralensis su prvi put eksploatisani koristeći Roche 454 platformu zbog svoje duge dužine čitanja. Zbog efikasne sposobnosti sastavljanja sa kratkim čitanjima, posebno kod čitanja sa uparenim krajevima, sekvenciranje transkriptoma zasnovano na Illumini i sastavljanje se takođe intenzivno koriste za modelne i nemodelne organizme. U ovoj studiji generisali smo oko 8G od 101 bp čitanja uparenih krajeva i proizveli duže unigene sekvence sa prosječnom dužinom od 725 bp. Veliki podaci o transkriptomu specifičnim za stablo mogli bi pružiti korisne referentne podatke i koristiti za istraživanje sekundarnog metabolizma bioaktivnih komponenti C. deserticola. Postoji 81,62% ukupnih neobrađenih čitanja koje je prošlo stroge filtere kvaliteta (uključujući skraćivanje adaptera i odbacivanje čitanja niskog kvaliteta) prije sklapanja, što sugerira visok kvalitet naših podataka o sekvenciranju, a 82,08% visokokvalitetnih čitanja bilo je korisno za sastavljanje. Ostala očitavanja koja nisu uspjela biti korištena za sklapanje mogu biti posljedica grešaka u sekvenciranju, parametara sklopa i dr. Ta neiskorištena čitanja visokog kvaliteta ostala su od pomoći u poboljšanju de novo sklapanja u kombinaciji s dužim čitanjima s druge platforme (kao što je Roche 454) u budućnosti.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Veliki broj sakupljenih transkripata (30 098) pokazao je visoku sličnost sekvenci sa poznatim genima u javnim bazama podataka, što sugeriše da naši podaci o uparenim krajevima bazirani na Illumini pokrivaju značajan dio transkripata C. deserticola. Transkripti bez BLAST pogodaka mogu biti posljedica 3' ili 5' neprevedenih regija, nekodirajuće RNK ili novih genskih sekvenci C. deserticola. Izraženi transkripti su označeni širokim spektrom GO kategorija i KEGG puteva (Tabele 3 i 4), u kojima su mnogi transkripti pripisani sekundarnim putevima povezanim sa metabolizmom. Kao što znamo, fenilpropanoid može funkcionisati kao inducibilno antimikrobno jedinjenje sa velikim spasonosnim efektom za podzemni način života [1], a takođe može delovati i kao signalni molekul u interakcijama između biljaka i mikroba pored svoje medicinske upotrebe [68, 69]. Terpenoid se koristi za biosintezu bioaktivnih komponenti (kao što je 6- deoksikatalpol) [70]. Otkrili smo da su geni uključeni u put biosinteze kičme fenilpropanoida i terpenoida bili veoma zastupljeni u C. deserticola. Još važnije, otkriće dobro predstavljenih puteva biosinteze lignina (slika 3) ukazuje na aktivni metabolički proces lignina u stabljici C. deserticola. Svi poznati enzimski geni uključeni u biosintezu lignina (slika 3) su otkriveni ekspresirani, a četiri ključna enzima uključujući PAL, CCR, HCT i F5H imala su nižu ekspresiju (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 i 3,83, respektivno) u poređenju sa drugi geni enzima (Tabela 6). Da li bi promjena ekspresije ova tri gena mogla utjecati na proizvodnju lignina u C. deserticola ili ne, vrijedno je daljeg proučavanja. PAL je ključni enzim u biosintezi lignina, a također je uključen u biosintezu fenilpropanoida, resveratrola, flavonoida i kumarina [71-74]. Otkrili smo četiri različita gena PAL u genomu C. deserticola (S2 slika) što se poklopilo s tim da je PAL kodiran od strane male multigenske porodice [39, 43, 45–49] i dalje dokazali da može igrati važnu ulogu u metaboličkom protoku ugljika. .

PhG je primarni aktivni sastojak C. deserticola. Geni uključeni u biosintezu feniletanola važni su za kvalitet C. deserticola. Zaključili smo dva različita puta biosinteze fenil etanola i 17 gena enzima uključenih u biosintezu PhG u stabljici C. deserticola. Mogući procesi nakon kafeinske/ferulne kiseline (slika 3) također su prvi put izvedeni na osnovu strukturne formule intermedijara i katalitičkih svojstava odgovarajućih enzima, u kojima bi kafeinska/ferulna kiselina prvo bila oksidirana u derivat fenilpiruvata; zatim, karboksilna grupa je lišena dekarboksilazama; konačno, aldehidna grupa je dehidrogenazom pretvorena nazad u alkoholnu grupu. Ovo je prva primjena Illumina tehnologije sekvenciranja parnih krajeva za istraživanje cijelog transkriptoma C. deserticola i sastavljanje RNA-seq očitavanja bez referentnog genoma. Ova studija će pružiti korisne resurse i sekvence gena za funkcionalno istraživanje genomike i proteomike C. deserticola u budućnosti.

Zaključci

U ovoj studiji profilirali smo transkriptom stabljike C. deserticola na osnovu podataka sekvencioniranja visoke propusnosti, identificirali gene uključene u puteve biosinteze lignina, a također smo prvi put zaključili potencijalni put biosinteze PhG, što će svakako ubrzati razumijevanje dvosmislenih fizioloških procesa i velike medicinske vrijednosti na molekularnom nivou. Do sada, ovo je prvi pokušaj da se de novo sastavi ceo transkriptom stabljike C. deserticola i da se otkrije put biosinteze medicinskih komponenti korišćenjem skupova podataka sekvenciranja zasnovanih na Illumini. Naša studija može promovirati razvoj prirodnih lijekova i selekciju sorti sa ljekovitim svojstvima.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%