Ukupni glikozidi Cistanche Deserticola pospješuju oporavak neuroloških funkcija indukcijom neurovaskularne regeneracije putem Nrf- 2/Keap-1 puta kod MCAO/R pacova

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng i Yong Jiang

Pozadina:Tradicionalna kineska medicina Cistanche deserticola je prijavljena kao validna za kardiovaskularne i cerebrovaskularne bolesti. Međutim, njegove aktivne komponente za zaštitu od ishemijskog moždanog udara nisu jasne. Cilj nam je bio da istražimo aktivne komponenteC. deserticolaprotiv ishemijskog moždanog udara kao i njegovih potencijalnih mehanizama.Metode:Istraživali smo zaštitne efekte ekstrakata izC. deserticola, ukupni glikozidi (TG), polisaharidi (PS) i oligosaharidi (OS) u štakorskom modelu okluzije-reperfuzije srednje cerebralne arterije (MCAO/R). 2, 3, 5-Bojenje trifenil tetrazolijum hloridom (TTC) korišćeno je za procenu zapremine cerebralnog infarkta, a Evansov plavi test je usvojen za procenu permeabilnosti krvno-moždane barijere (BBB). Zatim, izrazi CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, okludin, Keap-1 i Nrf{{ 12}} su analizirani pomoću western blotinga ili imunofluorescencije, a aktivnosti MDA, SOD, CAT i GSH-Px su analizirane pomoću kompleta.Rezultati:Tretman TG-om značajno je smanjio rezultate neurološkog deficita i volumena infarkta, promovirao angiogenezu i neuralno remodeliranje i efikasno održavao integritet krvno-moždane barijere u poređenju sa modelnom grupom. Nadalje, TG su značajno smanjile nivoe MDA i povećale antioksidativne aktivnosti (SOD, CAT i GSH-Px) u mozgu. U međuvremenu, TG-ovi su značajno smanjili Keap-1 ekspresiju i olakšali Nrf{4}} nuklearnu translokaciju. Naprotiv, nisu uočeni zaštitni efekti za grupe PS i OS.zaključak:TG su glavne aktivne komponenteC. deserticolaprotiv cerebralne ozljede izazvane MCAO/R, a zaštita je uglavnom putem Nrf-2/Keap-1 puta.

Ključne riječi: Cistanche deserticola, cerebralna povreda, ukupni glikozidi, polisaharidi, oligosaharidi, Nrf-2/Keap- 1 put

UVOD

Moždani udari se smatraju glavnim uzrokom smrti i invaliditeta u svijetu (Donnan et al., 2008). Gotovo 87 posto svih slučajeva moždanog udara izazvano je ishemijskim moždanim udarom (Ovbiagele i Nguyen-Huynh, 2011.). Trenutno, najefikasnije sredstvo i jedini lijek koji je odobrila FDA i koji se koristi za liječenje ishemijskog moždanog udara je rekombinantni tkivni aktivator plazminogena. Međutim, veliki broj pacijenata sa moždanim udarom ne reaguje na ovaj lijek, zbog njegovog uskog terapijskog vremenskog okvira i ozbiljnog rizika od hemoragijskih komplikacija (Lee et al., 2012; Schellinger i Kohrmann, 2014). Glavni izazov trombolitičkog liječenja je ishemijska/reperfuzijska (I/R) ozljeda, koja se smatra glavnim uzrokom ozljede mozga i destrukcije funkcije. Reperfuzija nakon cerebralne ishemije povećava rizik od krvarenja u mozgu dok dovodi do neurovaskularnih ozljeda i proizvodnje prekomjernih reaktivnih vrsta kisika (ROS) koje oštećuju krvno-moždanu barijeru (Alluri et al., 2015.). Nekoliko studija je potvrdilo da je poremećaj BBB glavni uzrok patogeneze ishemijskog moždanog udara (Cao et al., 2016b).

BBB se uglavnom sastoji od endotelnih ćelija, pericita, astrocita, neurona i bazalnih membrana. Osnovne komponente BBB-a su cerebralne mikrovaskularne endotelne ćelije koje su spojene čvrstim spojevima, ograničavajući tako egzogene molekule u mozak. Patološke promjene uskih spojeva—posebno okludin, claudin-5 i zonula occludens-1 (ZO-1)—značajno utiču na funkciju BBB tokom ishemijskog moždanog udara, posebno na propusnost barijere (Liu et. al., 2014.; Hu i sur., 2018.; Liu i sur., 2019.). Tokom I/R perioda, prekomjerni ROS je jedan od glavnih faktora koji dovode do direktnog oštećenja moždanih neurona (Ding et al., 2014). Prekomjerna proizvodnja ROS-a dovodi do degradacije određenih spojeva i poremećaja BBB-a, što dovodi do toga da egzogeni molekuli ulaze u mozak kroz BBB, što dovodi do pogoršanja oštećenja mozga (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Stoga se zaštita BBB antioksidansima smatra potencijalnim načinom za sprječavanje reperfuzijskih ozljeda.

Osim razgradnje BBB-a, I/R može dovesti do neurovaskularnih ozljeda i neuronske smrti (Jung et al., 2010). Tokom moždanog udara, povećana smrt neuronskih ćelija može biti rezultat oksidativnog stresa (Chi et al., 2018), a brojne studije su pokazale da ROS pogoršava težinu moždanog udara i neurološka oštećenja (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Iako klinička ispitivanja nisu dala zadovoljavajuće rezultate, neuroprotekcija je i dalje obećavajuća strategija za liječenje akutnog ishemijskog moždanog udara (Moretti et al., 2015). Stoga je pronalaženje učinkovitih neuroprotektivnih lijekova za liječenje moždanog udara korist za pacijente s moždanim udarom.

Tradicionalna kineska medicina (TCM) poduzima mjere kako bi intervenirala protiv unutrašnje neravnoteže tijela (Gaire, 2018). Zbog složene patogeneze ishemijskog moždanog udara, multifaktorski učinak TCM i njegovih aktivnih sastojaka igra ključnu ulogu u liječenju moždanog udara. Cistanche deserticola YC Ma, rasprostranjena u sušnim ili polusušnim područjima širom Mongolije i sjeverozapadne Kine, bila je široko korištena TCM biljka za liječenje raznih bolesti kao što su zaboravnost i depresija više od 1,000 godine u Kini . Modernafarmakološke studije su pokazale da sirovi ekstrakti izC. deserticolapokazali su višestruke farmakološke aktivnosti, kao što su poboljšanje funkcije učenja i pamćenja, neuroprotekcija, jačanje imuniteta, antioksidativni, anti-aging efekti i efekti protiv umora (Ko i Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Hemijska analiza C. deserticola je pokazala da njeni glavni sastavi uključuju feniletanoidne glikozide, iridoidne glikozide, polisaharide i oligosaharide (Jiang i Tu, 2009). Međutim, aktivne komponente C. deserticola za zaštitu mozga nisu sasvim jasne.Neuroprotektivna svojstva C. deserticola impliciraju njen terapeutski potencijal kod kognitivnih bolesti kao što su moždani udar i depresija, kao i kod Alchajmerove bolesti (Wang et al., 2017). Međutim, istraživanje o uticajuC. deserticolana udare, uključujući njegove aktivne komponente i mehanizme djelovanja, vrlo je ograničen. U ovom radu istražili smo zaštitni učinak tri ekstrakta iz C. deserticola, ukupnih glikozida (TG, feniletanoidnih glikozida i drugih glikozida), polisaharida (PS) i oligosaharida (OS) na cerebralne I/R ozljede. Naši nalazi mogu doprinijeti preciznoj kliničkoj primjeniC. deserticolai obezbijediti sredstvo kandidata za terapiju ishemijskog moždanog udara.

MATERIJALI I METODE

Hemikalije i reagensi

Stabljike Cistanche deserticola kupljene su iz Alashana, Unutrašnja Mongolija, i identificirane od strane jednog od autora (P.-F. Tu). TG, PS i OS pripremljeni su prema našoj prethodno objavljenoj metodi (Gao et al., 2015). Kvantitativna analiza TG je izvršena tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) kako je prethodno opisano (Li et al, 2019), a njen hromatogram je prikazan na slici 1. Glavne komponente TG su ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izo- akteozid i 2'-acetilakteozid; njihov sadržaj je 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g, odnosno 12,045 mg/g. Sadržaj PS i OS je 69,42 posto i 65,24 posto, respektivno, kako je utvrđeno HPLC i analizom fenol-sumporna kiselina (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

Standardne reference ehinakozida (A0282), tubulozida A (A0942), akteozida (A0280), izo-akteozida (A0281) i 2'-acetilakteozida (A0943) kupljene su od Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Kina). Čistoća svih standarda je više od 98 posto. Nissl Stain H&E kompleti su kupljeni od Bostera (Wuhan, Kina). Edaravone (T0407-1) je kupljen od Target Mola (Šangaj, Kina). Kupljeni su zečji anti-pacovski MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) i miš CD31 protiv pacova (ab24590) iz Abcam Inc (Cambridge, MA, SAD). Zečji anti-pacov Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) i Occludin (BS72035) kupljeni su od Bioworld Technology (Nanjing, Kina). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, SAD) je bio izvor zečjeg anti-pacova Synapsina-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actina (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) je kupljen od Proteintech Group, Inc. (Čikago, SAD). Sekundarna antitijela su isporučena od Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Kina). Hoechst 33258 je nabavljen od Beyotime (Jiangsu, Kina).

Životinje

Sprague-Dawley pacovi (mužjaci, težine 250-300 g) su dobijeni od Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Kina) i smješteni u klimatiziranoj prostoriji koja je držana u ciklusu svjetlo/mrak od 12 sati. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su prema smjernicama ARRIVE istraživanja na životinjama (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010), a odobreni su od strane Institucionalnog odbora za negu i upotrebu životinja pri Univerzitetskom zdravstvenom centru Pekinga (LA2019123).

Eksperimentalni protokoli na životinjama

Pacovi su podvrgnuti MCAO/R, kao što je prethodno opisano (Wang et al., 2018). Ukratko, otkrivena je lijeva zajednička karotidna arterija (CCA), vanjska karotidna arterija (ECA) i unutrašnja karotidna arterija (ICA), a 3-0 najlonski monofilamentni šav je umetnut iz ECA u ICA do sredine cerebralna arterija (MCA). Nakon 1,5 h MCA okluzije, reperfuzija je simulirana uklanjanjem filamenta. Tokom hirurškog zahvata, telesna temperatura svih pacova održavana je na 37,0 stepeni.

Uprava za lijekove

Pacovi su nasumično podijeljeni u šest grupa korištenjem SPSS softvera verzije 22.0 kako je opisano (Jiang et al., 2014): normalna grupa (NOR); grupa modela (MOD); grupa edaravona (pozitivan lijek, 6 mL/kg, EDI); TG grupa (280 mg/kg, TG); PS grupa (280 mg/kg, PS) i OS grupa (280 mg/kg, OS). TG, PS i OS su davani jednom dnevno nakon MCAO/R tokom 14 dana. Grupe NOR i MOD tretirane su normalnom fiziološkom otopinom. Broj životinja prikazan je u tabeli 1.

Mjerenje težine i modificiranog neurološkog deficita (mNSS)

Telesna težina je praćena 14. dana pomoću ADVENTURE™ digitalne vage (OHAUS, New Jersey, SAD). mNSS je procijenjen prema metodi koju je opisao FJ Wang (Wang et al., 2018), uz manje izmjene.

2, 3, 5-Bojenje trifeniltetrazolijum hloridom (TTC)

Volumen infarkta je mjeren kako je prethodno opisano (Wang et al., 2015). Ukratko, mozgovi su podijeljeni u sedam jednako raspoređenih koronalnih blokova (2 mm). Ovi preseci su obojeni sa 2% TTC (Coolaber, Peking, Kina) na 37 stepeni tokom 15 minuta. Volumen infarkta ( posto )=(volumen ipsilateralne ishemijske hemisfere − zapremina kontralateralne ishemijske hemisfere)/volumen kontralateralne ishemijske hemisfere × 100.

Nissl i H&E bojenje

Pacovi su duboko anestezirani, a cijeli mozak je zatim brzo uklonjen iz lubanje i fiksiran korištenjem 4 posto paraformaldehida i ugrađen u parafinski vosak, te izrezan na kriške debljine 7 µm. Isječci su obojeni Nisslom i H&E. U ovoj studiji, šest nasumičnih polja 200 × 200 µm je uhvaćeno u svakom uzorku tkiva svjetlosnim mikroskopom. Broj Nisslovih tijela prebrojan je pomoću IPP softvera verzije 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, SAD).

Evans Blue Assay

Pacovima je ubrizgan 2 posto EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) nakon MCAO/R. Dva sata kasnije, pacovi su anestezirani, a cijeli mozak je zatim brzo uklonjen i homogeniziran u acetonu. Supernatanti su analizirani na 620 nm pomoću čitača apsorbancije 800 TS (BioTek, SAD).

Mjerenje aktivnosti katalaze (CAT), superoksid dismutaze (SOD), malondialdehida (MDA) i glutation peroksidaze (GSH-Px)

Svi uzorci seruma su centrifugirani na 4,000 × rpm 15 minuta na 4 stepena, a zatim analizirani da bi se otkrile aktivnosti MDA, CAT, SOD i GSH-Px prema uputama proizvođača (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Kina).

Western blotting analiza

Tkiva mozga (100 mg) sakupljena od svakog štakora su homogenizovana i lizirana u RIPA puferu za lizu, a zatim analizirana da bi se otkrila koncentracija proteina korišćenjem BCA kompleta (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Ukupni proteini tkiva su napunjeni na 10 posto SDS-PAGE gelova i prebačeni na nitroceluloznu membranu. Membrana je blokirana korištenjem 5 posto obranog mlijeka, a zatim inkubirana preko noći s primarnim antitelima na 4 stepena. Membrana je zatim inkubirana sa sekundarnim antitelom. Western blot analiza je analizirana korišćenjem Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Kina).

Imunofluorescentna analiza

Urađeno je imunofluorescentno bojenje za CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 i Keap-1. Primarna antitijela protiv Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 i Keap{15}} su razrijeđena do 1:200 i 1:100, respektivno. Sekundarno antitelo Alexa Flur 488 mišjeg anti-zečjeg IgG i rodaminskog (TRITC) kozjeg anti-zečjeg IgG-a razblaženo je do 1:200. Jezgra su obojena Hoechst 33258. Slike su snimljene korišćenjem Vectra® Polaris™ automatizovanog kvantitativnog sistema za slikanje patologije (PerkinElmer, SAD). Ekspresija proteina je analizirana korištenjem IPP softvera verzije 6.0.

Statistička analiza

Svi podaci su opisani kao srednja vrijednost ± SD. SPSS softver verzija 22.0 je izvršen za statističku analizu. Jednosmjerna ANOVA korištena je prilikom poređenja različitih grupa. P < 0.05="" se="" smatra="" statističkom="">

REZULTATI

TG povećavaju tjelesnu težinu i smanjuju oštećenja mozga kod MCAO/R pacova

Nakon 14 dana izlječenja sa TG, PS, Oss i EDI, procijenjene su tjelesne težine, neurološki deficiti i volumeni infarkta I/R pacova. Rezultati su pokazali da je tjelesna težina u MOD grupi značajno smanjena, dok je smanjena težina u grupama TG, PS i EDI povećana (Slika 2A). Rezultati neurološkog deficita su značajno smanjeni EDI i TG (Slika 2B). Rezge mozga u pacovima NOR grupe bile su tamno crvene i nije bilo infarkta, dok su štakori iz grupe MOD pokazali veliki ipsilateralni cerebralni infarkt. Nakon tretmana TG, volumen infarkta je značajno smanjen (Slike 2C, D). Tretman PS i OS nije pokazao očigledan učinak na gore navedene indekse. Gore navedeni podaci su pokazali da TG mogu značajno ublažiti cerebralnu ozljedu izazvanu I/R, ali PS i OS ne mogu.

TG ublažavaju histopatološka oštećenja kod MCAO/R pacova

Da bi se odredili neki od efekata tretmana TG, PS i OS na histopatološka oštećenja, H&E bojenje je urađeno kako bi se otkrila patološka oštećenja. Histomorfološke strukture mozga u NOR grupi su redovno raspoređene. Morfološke promjene u TG grupama bile su manje od onih u MOD grupi. Međutim, grupe za liječenje PS i OS nisu pokazale značajno poboljšanje morfoloških promjena (Slika 3).

TGs ublažavaju neuronske ozljede nakon I/R-induciranih pacova

Nisslovo bojenje je pokazalo histopatološke promjene neurona u polusjeni ishemijskog područja. Kao što je prikazano na slici 4, normalni neuroni su imali jasnu nukleolu i netaknutu strukturu. U MOD grupi, neuroni su imali povećane međućelijske prostore. Nisslova tijela su nestala, smežurana i duboko umrljana. Međutim, ove promjene su rijetko uočene u grupama EDI, TG i PS. Ovi rezultati su ilustrirali da TG i PS mogu značajno umanjiti oštećenje neurona izazvano ishemijom/reperfuzijom.

TG smanjuju poremećaj BBB-a nakon pacova tretiranih I/R

Evansov plavi test je klasična metoda za istraživanje promjene permeabilnosti BBB-a. Rezultati eksperimenta su pokazali da je povećana Evans plava opažena u MOD grupi, dok je značajno smanjena Evans plava kod pacova tretiranih TGs i EDI. Štaviše, nije bilo značajne razlike između grupa na terapiji PS i OS (Slika 5). Ovi rezultati sugeriraju da TG mogu značajno umanjiti BBB poremećaj.

TG promovišu angiogenezu kod I/R povrijeđenih pacova

Novije studije pokazuju da angiogeneza igra ključnu ulogu u neurološkom funkcionalnom oporavku i prognostičkom ishodu nakon akutnog ishemijskog moždanog udara (Yuen et al., 2015). Za procjenu efekata TG, PS i OS na angiogenezu, CD31 i a-SMA su korišteni za kvantifikaciju kapilarnih brojeva. Imunofluorescentno bojenje je pokazalo da je MOD grupa izazvala značajno smanjenje ekspresije CD31 (Slike 6A, B) i a-SMA (Slike 6C, D) u polusjeni ishemijskih područja I/R štakora, u poređenju sa normalnim štakorima. . Ovaj rezultat je pokazao da I/R može uzrokovati vaskularno oštećenje u polusjeni korteksa ishemijskih hemisfera. Međutim, tretman TGs i EDI značajno je povećao gustoću kapilara, angiogenezu i arteriogenezu na što ukazuje povećana ekspresija CD31 i a-SMA. Ovi rezultati sugeriraju da bi TG mogli promovirati angiogenezu u ishemijskoj polusjeni I/R štakora, ali PS i OS ne bi mogli.

TG povećavaju ekspresiju proteina čvrstog spoja kod I/R ozlijeđenih pacova

Poremećaj BBB-a može povećati sadržaj vode u mozgu i oticanje tkiva, što dovodi do ozljede mozga. Proteini čvrstog spoja su važne strukturne komponente BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Da bi se testiralo da li tretman TG, PS i OS nakon moždanog udara može uticati na integritet BBB, imunofluorescentnom analizom su izvršene ekspresije ZO-1, claudin-5 i okludina. Rezultati su pokazali da su izrazi claudin-5, occludin i ZO-1 bili vidno smanjeni u MOD grupi. Međutim, oni su značajno povećani nakon 14 dana primjene TG. Grupe PS i OS nisu pokazale značajne promjene u ekspresiji ovih proteina (Slika 7). Ovi podaci su pokazali da TG mogu regulisati ekspresiju proteina tesnog spoja i vjerovatno održati integritet BBB nakon I/R ozljede. TG povećavaju pokrivenost kapilarima pericitima kod I/R povrijeđenih pacova Pokrivenost kapilarima pericitima igra ključnu ulogu u održavanju integriteta BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Stoga smo testirali da li se pokrivenost pericitima može povećati tretmanom TG, PS i OS. Rezultati analize intenziteta imunofluorescencije pokazali su da su ekspresije i PDGFRb i CD31 dramatično smanjene u MOD grupi. Davanje TG-a I/R štakorima značajno je oporavilo ili čak povećalo intenzitet ekspresije PDGFRb i CD31, ali nije uočena razlika u grupama koje su tretirane PS i OS (Slika 8). Stoga bi tretman TG mogao značajno povećati pokrivenost pericitima. Ovi nalazi su dalje potvrdili da TG mogu održati integritet BBB nakon I/R.

TG-ovi promovišu neuronsko remodeliranje kod I/R ozlijeđenih pacova

Prema brojnim studijama, neurogeneza nakon moždanog udara može značajno poboljšati funkcionalni oporavak (Grefkes i Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Sinaptofizin (SYN), proteini postsinaptičke gustine 95 (PSD-95) i protein 2 povezan s mikrotubulama (MAP-2) korišteni su kao markeri za ispitivanje neuronske plastičnosti u ishemijskoj polusjeni korteksa. Da bi se procijenili efekti tretmana TG, PS i OS na neurogenezu kod I/R povrijeđenih pacova, izvršena je imunofluorescencija i western blot za SYN, PSD95 i MAP-2 ekspresije. Kao što je prikazano na slikama 9 i 10, nivoi ekspresije SYN, PSD95 i MAP{12}} kod I/R štakora nakon 14 dana reperfuzije su se smanjili u poređenju sa NOR štakorima, dok bi izlječenje TGs i PSs moglo značajno povećati- regulišu nivoe njihove ekspresije. Grupa OS nije imala značajne promjene u poređenju sa grupom MOD. Podaci su pokazali da je TGs i PSs lijek bio u stanju dramatično promovirati neuronsko remodeliranje nakon I/R ozljede.

TGs Alter Nrf-2 i Keap{1}} ekspresije kod I/R ozlijeđenih štakora

Oksidativni stres je glavni patogeni mehanizam u I/R ozljedi (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Studije su potvrdile da je Nrf-2 glavni regulator antioksidativnih odgovora (Thompson et al., 2015). Da bismo istražili oksidativne odgovore posredovane Nrf-2 i Keap-1 nakon I/R ozljede, procijenili smo citoplazmatsku ekspresiju kao i nuklearnu translokaciju Keap-1. U međuvremenu, ekspresija Nrf-2 u I/R oštećenom moždanom tkivu pacova je takođe ispitana (Slike 10 i 11). Na osnovu imunofluorescentne analize, utvrđeno je da se Nrf-2 uglavnom nalazi u citoplazmi u NOR grupi. U grupi TGs, ekspresija Nrf-2 u citoplazmatskoj lokalizaciji je smanjena, ali povećana u jezgru, a također je uočena smanjena Keap{12}} ekspresija. Podaci su pokazali da se zaštita mozga TG može povezati s modulacijom Nrf-2 i Keap-1

TGs ublažavaju oksidativni stres moždanog tkiva kod I/R ozlijeđenih štakora

Da bi se potvrdili antioksidativni efekti TG, aktivnosti SOD, CAT, GSH-Px i MDA su procijenjene kod I/R povrijeđenih pacova. Na slici 12, sadržaj MDA je značajno povećan u MOD grupi, a istovremeno je smanjena aktivnost SOD, CAT i GSH-Px u odnosu na normalne pacove. Suprotno tome, tretman TG je doveo do značajnog smanjenja sadržaja MDA i povećanja aktivnosti SOD, CAT i GSH-Px. Ovi rezultati su dodatno potvrdili antioksidacionu aktivnost TG.

DISKUSIJA

Mnoga istraživanja sugeriraju da TCMC. deserticolaima opsežne biološke aktivnosti, npr. poboljšava sposobnost učenja, pamćenja i imuniteta (Dong et al., 2007; Jiang i Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). Međutim, aktivne komponente C. deserticola za neuroprotekciju ostaju nejasne. Trenutni rad ima za cilj da prikaže aktivne komponente izC. deserticolaprotiv ishemijskog moždanog udara na MCAO/R modelu. Tri ekstrakta iz C. deserticola (TG, PS i OS) korištena su za procjenu njihovog djelovanja na MCAO/R pacove, kao i mogućih mehanizama.

Moždani udar je uobičajena akutna cerebrovaskularna bolest. Epidemiološke studije pokazuju da je moždani udar češći kod muškaraca nego kod žena (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik i Bushnell, 2017). Tako su u našem eksperimentu za testove usvojeni mužjaci pacova. Naši rezultati su dokazali da je indukcija I/R ubrzala oksidativni stres i volumen infarkta, razbijajući BBB i dovodeći do nervnih i cerebrovaskularnih ozljeda. Nakon skrininga, utvrđeno je da TG smanjuju volumen infarkta i potiču neuralno remodeliranje i angiogenezu. Štaviše, uočeno je da TG održavaju integritet BBB nakon I/R ozljede. Naprotiv, PS i OS ne donose značajno ublažavanje I/R povreda. Stoga se TG smatraju glavnom aktivnom frakcijomC. deserticolaza neuroprotekciju, potencijalno kroz promoviranje neuralnog remodeliranja, angiogeneze i integriteta BBB putem aktiviranja Nrf- 2/Keap-1 puta.

Sve više dokaza ukazuje na to da je uspostavljanje efikasne kolateralne cirkulacije značajno važno za izbjegavanje formiranja infarkta i ishemijske polusjenice, te je kritičan tretman u ranoj fazi ishemijskog moždanog udara (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Proliferacija vaskularnih endotelnih ćelija i glatkih mišićnih ćelija nakon ishemijskog infarkta određuje uspostavljanje kolateralne cirkulacije. Međutim, modeli ishemije imaju zajednički fenomen - to jest, oksidativni stres široko je postojao u mikrovaskulaturi mozga. Podaci istraživanja su pokazali da veliki broj antioksidanata može poremetiti funkciju BBB i svojstva angiogeneze (Mentor i Fisher, 2017). CD31 i a-SMA su markeri vaskularnih endotelnih ćelija, kao i ćelija glatkih mišića (Saboor et al., 2016). Istražiti učinak ekstrakata na gore spomenutu ćelijsku proliferacijuC. deserticola, ispitali smo ekspresiju CD31 i a-SMA u cerebralno ishemijskom penumbra homogenatu. Naši podaci su pokazali da TG upadljivo pojačavaju ekspresiju CD31 i a-SMA. Međutim, nije bilo značajnih razlika za grupe PS i OS. Stoga smo zaključili da TG mogu smanjiti oštećenje mozga promicanjem angiogeneze povećanjem ekspresije CD31 i a-SMA, dok PS i OS ne pružaju takvu zaštitu od oštećenja mozga. Ovi rezultati su dalje potvrdili da samo TG mogu spriječiti cerebralnu I/R ozljedu.

Ishemijski moždani udar može se smatrati rezultatom cerebralne ishemije uzrokovane oštećenjem neuronske plastičnosti ili remodeliranjem područja mozga. Većina pacijenata sa moždanim udarom pati od neuroloških deficita. Aktiviranje neurogeneze je obećavajuća strategija za pacijente s moždanim udarom za poboljšanje njihovih neuroloških funkcija (Cramer i Chopp, 2000). Neurogeneza direktno sudjeluje u oporavku neuroloških funkcija nakon I/R ozljede mozga (Zhang et al., 2019). Prethodna istraživanja pokazuju da TG mogu poboljšati stopu preživljavanja hipokampalnih piramidalnih stanica i inducirati neurogenezu (Lian et al., 2017). Oksidativni stres uzrokuje gubitak neurona tokom mnogih bolesti, kao što su Parkinsonova bolest, moždani udar i tako dalje (Duan i Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transkribuje mnogo gena povezanih sa neuroprotekcijom u njihovoj promotorskoj regiji, uglavnom uključujući SOD, MDA, CAT i g glutamil cistein ligaze, itd (Satoh et al., 2006). SYN, PSD-95 i MAP-2 proteini, koji su blisko povezani sa sinaptičkim formiranjem i neurotransmisijom, mogu se smatrati markerima istraživačke neuronske plastičnosti u regiji ishemijske penumbre. Nakon proučavanja, otkrili smo da lijek sa TG može značajno povećati ekspresiju PSD95, SYN i MAP-2, što ukazuje da je cerebralna zaštita TG-a u korelaciji sa povećanom plastičnošću neurona tokom I/R. Međutim, šteta je što nema očigledne razlike između PS-ova i OS grupa. Ovi rezultati su pokazali da TG mogu povećati neuroplastičnost nakon cerebralne I/R ozljede.Slikovno istraživanje pacijenata sa moždanim udarom pokazalo je da se disfunkcija BBB-a može smatrati upečatljivim atributom periishemijskog mozga (Bang et al., 2007). TJ, koji se sastoje od citoplazmatskih proteina, transmembranskih proteina i spojnih adhezionih molekula između kapilarnih endotelnih ćelija, vrlo su važni u održavanju integriteta BBB (Ye et al., 2019). Među njima, ZO-1, claudin-5 i okludin su najvažniji proteini u TJ. Sve više dokaza ukazuje na to da povećana permeabilnost BBB izazvana ishemijom generalno korelira sa promenama ZO-1, claudin-5 i okludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017.; Liu et al., 2018.). U ovom radu, rezultati su pokazali da iako TG mogu značajno povećati ekspresiju proteina ZO-1, claudin-5 i okludina u moždanim tkivima izazvanim MCAO, ni PS ni OS to nisu učinili. BBB se sastoji od cerebralnih endotelnih ćelija i usko je povezan sa pericitima (Nyul-Toth et al., 2016). Periciti su vitalni za integritet BBB (Bell et al., 2010). Ishemijski moždani udar izaziva smrt pericita i odvajanje od endotelnih stanica mozga u akutnoj fazi, destabilizirajući tako mikrovaskulaturu i mijenjajući svojstva BBB (Zechariah et al., 2013). Naši podaci su pokazali da TG mogu povećati pokrivenost pericita na kapilarama i povećati nivoe ekspresije ZO-1, claudin-5 i okludina. Ovi fenomeni su dokazali da TG mogu efikasno zaštititi integritet BBB nakon cerebralne I/R ozljede. Ukratko, TG mogu ublažiti cerebralnu ozljedu na više načina, kao što je promoviranje angiogeneze, poboljšanje plastičnosti neurona i održavanje integriteta BBB-a.

Zatim smo istražili signalni put kako bismo istražili mehanizam koji leži u osnovi zaštite mozga TG. Proces I/R ozljede je multifaktorski, te su stoga brojni mehanizmi uključeni u patogenezu. Oksidativni stres je osnovni faktor rizika koji doprinosi povredama mozga izazvanim I/R (Suda et al., 2013), kao što su oštećenje strukture BBB, disfunkcija vaskularnog endotela i pogoršanje ishemijske povrede neurona (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2019.; Priestley et al., 2019.). Stoga je oksidativni stres postao atraktivna terapijska meta kod ozljeda mozga uzrokovanih I/R. Enzimi faze 2, koji su posredovani nuklearnim faktorom E2-faktorom povezanim-2 (Nrf-2), smatraju se važnim sredstvom pomoću kojeg se neuroni štite od oksidativnog stresa (Suzuki i Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Sve više dokaza ukazuje da je aktivacija Nrf-2 tokom I/R potencijalna terapijska meta za neuroprotekciju (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, kao važan regulator endogene antioksidativne odbrane, posreduje u nivou heme oksigenaze 1 (HO-1) i drugih antioksidativnih enzima, kao što je NAD(P)H kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH i MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Štaviše, Nrf-2 igra važnu regulatornu ulogu u angiogenezi. Ova studija pokazuje da se Nrf-2 može značajno pojačati i aktivirati u procesu vaskularnog razvoja (Wei et al., 2013).

Kao što je prethodno opisano (Jiang i Tu, 2009), TG sadrže mnogo bioaktivnih spojeva, na primjer, ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izo-akteozid i 2'-acetilakteozid, a neki od njih su pokazali neuroprotektivne funkcije nakon cerebralne I/R povreda (Peng et al., 2016). Ehinakozid ima mnogo farmakoloških efekata, kao što su antioksidacija, anti-senescencija, neuroprotekcija, anti-inflamacija, promocija cikatrizacije, hepatoprotekcija, promocija formiranja kostiju i antitumorske aktivnosti (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji i sur., 2019; Xu et al., 2019). Nedavno je ehinakozid identifikovan kao moćan antioksidans u centralnom nervnom sistemu (Lu et al., 2016). Ehinakozid može smanjiti sadržaj MDA i poboljšati aktivnosti SOD i GSH Px kod ishemijske ozljede mozga, a molekularna analiza je pokazala da se ehinakozid može vezati za Keap-1, što dovodi do nuklearne translokacije Nrf-2 (Li et al., 2018). Studija Xia je pokazala da akteozid može smanjiti volumen infarkta i sadržaj vode u mozgu kako bi poboljšao neurološke deficite kod MCAO/R pacova kroz ublažavanje oksidativnog stresa (Xia et al., 2018). Druge studije su pokazale da izo-akteozid može povećati aktivnosti ćelijskih antioksidativnih enzima, SOD i CAT u V79-4 ćelijama tretiranim H2O2-(Chae et al., 2005). Na osnovu gornjih izvještaja o aktivnim spojevima sadržanim u TG, moguće je zaključiti da bi TG mogli zaštititi od ishemijskog moždanog udara putem antioksidacijskih puteva.

Li je izvijestio o neuroprotektivnim efektima feniletanoidnih glikozida (PhG) na H2O2-indukovanu apoptozu na PC12 stanicama putem Nrf2/ARE puta (Li et al., 2018). Ovi PhG su značajno potisnuti pokretanjem nuklearne translokacije Nrf2 i povećanjem ekspresije HO-1, NQO1, katalitičke podjedinice glutamat-cistein ligaze (GCLC) i podjedinice modifikatora glutamat-cistein ligaze (GCLM) (Li et al., 2018). ; Gong et al., 2019.). Stoga, ovi nalazi sugeriraju da put Nrf-2/ARE igra ključnu ulogu u zaštitnim efektima posredovanim PhGs na neuronske ćelije. Slično, u ovoj studiji smo otkrili da TG mogu smanjiti nivo MDA i povećati nivoe SOD, CAT i GSH-Px kod I/R štakora. U međuvremenu, TG bi mogli povećati ekspresiju Nrf2 u jezgru, smanjiti odgovarajuću ekspresiju u citoplazmi i značajno smanjiti Keap{16}} ekspresiju. Stoga, put Nrf-2/Keap-1 može biti uključen u neuroprotektivne efekte posredovane TG. Dalja validacija ovog puta bi se izvršila in vitro ćelijskom kulturom sa modelima oštećenja deprivacije kiseonika i glukoze/reoksigenacije u budućnosti. Štaviše,C. deserticolaekstrakti su davani u našoj studiji 14 dana u kontinuitetu. Pošto bi neurogeneza odraslih uticala na tumačenje neuroprotektivnih efekata tokom 14 dana reperfuzije, neurogeneza se ne može isključiti u našem trenutnom dizajnu eksperimenta u istraživanju neuroprotektivnog efekta CT-a. Ovo je ograničenje našeg istraživanja.

U zaključku, radi se o TG-ovima izC. deserticolakoji mogu poboljšati angiogenezu i neurogenezu, kao i održati integritet BBB kod pacova sa I/R ozljedom, ali ne i PS i OS. Efekti bi mogli biti posredovani aktivacijom Nrf-2/Keap-1 puta.