Tolerancija na NADH/NAD plus neravnoteža predviđa starenje i intervencije protiv starenja

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

SAŽETAK

Redox parovi koordiniraju ćelijsku funkciju, ali su posljedice njihove neravnoteže nejasne. Ovo je donekle povezano s ograničenjima njihove eksperimentalne kvantifikacije. Ovdje zaobilazimo ove poteškoće predstavljanjem pristupa koji karakterizira profile tolerancije zasnovane na fitnesu na redoks neravnoteže parova koristeći silikonsku prezentaciju metabolizma. Fokusirajući se na NADH/NAD1 redoks par u kvascu, demonstriramo da reduktivna neravnoteža stvara metaboličke sindrome uporedive s onima uočenim u stanicama raka.prednosti ekstrakta cistancheTolerancija mutanata kvasca na redoks neravnotežu također može objasniti 30 posto varijabilnosti u njihovom eksperimentalno izmjerenom hronološkom vijeku. Štaviše, predviđanjem značaja nekih metabolita za održavanje neravnoteže, mi ispravno identificiramo nutrijente koji su u osnovi mehanizama patologije, molekule koji štite životni vijek ili oponašaju kalorijske restrikcije. Tolerancija na redoks neravnotežu postaje, na ovaj način, zvuk koji pruža okvir za prepoznavanje osobina fenotipa starenja, dok je u skladu s biološkim obrazloženjem za procjenu intervencija protiv starenja.

UVOD

Istraživanja redoks homeostaze značajno su se proširila u posljednje dvije decenije, kontinuirano preoblikujući klasične pojmove oksidativnog oštećenja ćelija (Halliwell i Gutteridge, 2015). Među najparadigmatičnijim molekularnim agensima koji su u osnovi ove homeostaze pojavljuju se omjeri redoks parova, poput onih konjugiranih oblika glutationa, NADPH i NADH. I glutation i NADPH djeluju kao esencijalni mehanizmi čišćenja reaktivnih vrsta kisika (ROS) u mitohondrijima, dok NADPH i NADH spajaju anaboličke i kataboličke puteve sa redoks stanjem ćelije.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Čak i tako, i dalje se prepoznaju novi mehanizmi koji povezuju NADPH/NADP* i NADH/NAD* parove sa redoks homeostazom. Na primjer, ravnoteža NADPH/NADP plus djelomično objašnjava posljedice za preživljavanje protein kinaze aktivirane AMP (She et al., 2014). Također, povezuje cirkadijalno mjerenje vremena sa redoks stanjima (Rey et al., 2016). Trenutno se smatra da je NADH/NAD plus omjer uključen u koordinaciju mitohondrijalne i nuklearne funkcije, epigenetsku regulaciju popravke DNK i ćelijskog identiteta, te podešavanje energetskog metabolizma na varijable okoline (Canto et al., 2015; Gomes et al. al 2013). U nepatološkim stanjima, odnos NADH/NAD* fluktuira sa tenzijom kiseonika, sa hipoksičnim stanjima i većom dostupnošću kiseonika, što se javlja zajedno sa reduktivnim i oksidativnim devijacijama (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Ali sve veći interes za omjere redoks parova uglavnom dolazi od njihovih implikacija u patologiji.cistanche genghis khanPojava ROS-a u reduktivnom (hipoksičan, NADH sklon) i oksidativnom (hiperoksičan, NAD plus sklon) čulima povezana je s odstupanjima od optimalnog redoks potencijala koji osigurava najbolje performanse mitohondrija (Aon et al., 2010. ; Clanton, 2007). Što se tiče raka, smanjeni NADH/NAD plus može biti u osnovi smrtonosnosti glioblastoma (Gujar et al., 2016) i promovirati progresiju raka debelog crijeva (Hong et al., 2019), ali također može spasiti neke zdrave fenotipove u različitim stupnjevima u ćelijama iz drugi tipovi tumora (Garrido i Djouder, 2017).

Cistanche može protiv starenja

NADH je također postao zanimljivo mjesto u biologiji Toronta. U tom kontekstu, povećanje NAD plus pula rezultiralo je djelomičnim preokretom starenja i drugih povezanih patoloških fenotipova među organizmima (Das et al., 2018; Mendelsohn i Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), a otkriveno je da stare i neoplastične ćelije predstavljaju neravnotežu NADH/NAD plus omjera (Braidy et al., 2011; Schwartz i Passonneau, 1974; Wiley et al, 2016). Nadalje, novootkrivene uloge NADPH i nastali koncept NADH/NADH kao glavnog regulatora redoks homeostaze i starenja su svi u skladu s teorijom metaboličke stabilnosti starenja (Demetrius, 2004). Ova teorija predlaže da je uzrok starenja ranjivost nivoa stabilnog stanja redoks parova na slučajne perturbacije okoline na stope reakcije enzima, te daje nekoliko zanimljivih predviđanja koja se primjenjuju na ljude.

S obzirom na sve ove implikacije, mnoge studije su ispitivale fenomenologiju redoks omjera parova bilo pasivnim prijavljivanjem njihovih nivoa ili aktivnim modificiranjem. Eksperimentalne manipulacije su međutim izazovne. Najtradicionalniji optužuju duboka eksperimentalna upozorenja (Sun et al., 2012.), a noviji još uvijek propuštaju određene biološke okolnosti zbog ograničenja na temperaturu i pH intervale (Hung et al., 2011.; Zhao et al., 2015.). Štaviše, eksperimentalno je skupo pratiti široku lepezu fenotipova nakon promjene skupova koenzima suplementacijom metabolita (Hou et al., 2010) i mutacija ili prekomjerne ekspresije enzima koji troše NAD(H) (Bait al., 2011; Felipe et al., 1998). Dakle, postoji potreba za alternativnim strategijama za rješavanje kontrole redoks homeostaze kroz manipulaciju redoks parovima, kao i za naše razumijevanje bioloških posljedica ove kontrole.

In silico modeli postaju praktična istraživačka strategija kad god su eksperimentalni pristupi ograničeni, uz prednost omogućavanja potpunog mehaničkog prikaza promatranih fenomena. Metabolički modeli na nivou genoma, koji se mogu proučavati kroz analizu ravnoteže fluksa (FBA) (Orth et al, 2010) postali su standard u sistemskoj biologiji za proučavanje posljedica metaboličkih poremećaja na ćelijsku funkciju (metode S1). Između ostalih doprinosa, pomogli su u otkrivanju novih antibiotika i kemoterapeutika, dizajnu bakterijskih sojeva optimiziranih za industrijsku proizvodnju supstanci od interesa i boljem razumijevanju ljudskih metaboličkih bolesti (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Raman et al., 2009). Upotreba FBA ima dodatnu prednost što omogućava uvid u metaboličke fenomene bez utjecaja nemetaboličkih zbunjujućih faktora (genetskih, epigenetskih, mehaničkih, itd.). Stoga su metabolički modeli na nivou genoma posebno pogodni za ispitivanje metaboličkih posljedica odstupanja od redoks homeostaze.

Ovdje koristimo FBA da ispitamo ravnotežu redoks parova na rekonstrukciji na razini genoma jednoćelijskog eukariota Saccharomyces cerevisiae, pri čemu karakteriziramo metaboličke i dugovječne posljedice kontrolirane perturbacije dostupnog NADH/NAD plus fluksa kroz različite genetske pozadine. Konkretnije, naši rezultati otkrivaju da tolerancija na ovu neravnotežu dovodi do specifičnog metaboličkog preusmjeravanja koje podsjeća na patologiju i također objašnjava više od četvrtine intraspecifične varijabilnosti u postmitotskom životnom vijeku. Osim toga, ovaj okvir nam pomaže da ocrtamo računski protokol (koji također primjenjujemo na metaboličke modele životinja i ljudi) za identifikaciju metabolita i enzima s potencijalom kao terapijskih ciljeva u kontekstu patologija povezanih sa starenjem.

REZULTATI

Profil tolerancije zasnovan na fitnesu karakteriše perturbacije redoks para

Da bismo predstavili neravnotežu između konjugiranih oblika redoks para, ugradili smo umjetnu reverzibilnu reakciju - "reakciju neravnoteže" - u rekonstrukciju odgovarajuće metaboličke mreže na nivou genoma (STAR ​​metode). Reakcija oksidira ili reducira par uzimajući u obzir specifične ćelijske odjeljke (npr. citosol, mitohondrije, itd.), a njena aktivnost se može fiksirati na bilo koju željenu vrijednost brzine. Za bilo koju od ovih vrijednosti, može se izračunati stopa rasta ("fitness"). koja djeluje kao proxy za toleranciju ćelije kvasca na to određeno stanje. Konačno, profil tolerancije je definiran izračunavanjem stope rasta za raspon vrijednosti neravnoteže (Slika 1A; imajte na umu da su reduktivni/oksidativni uslovi predstavljeni plavom/crvenom bojom, respektivno, u cijelom rukopisu).

Profili tolerancije obično pokazuju maksimalan rast oko nulte tačke neravnoteže, sa otprilike bilo kojim odstupanjem (tj. nenultom vrijednošću reakcije) što dovodi do smanjene sposobnosti. Ovo naglašava činjenicu da, da bi metabolizam funkcionirao, aktivnost reakcija koje podešavaju omjer redoks parova u jednom smislu mora biti proporcionalna aktivnosti onih koji ga podešavaju u drugom smislu. Tačnije, citosolna neravnoteža NADH/NADt u S.produžetak životnog vijeka cistanchecerevisiae koje rastu na glukozi i aerobnim uslovima daju profil sa maksimalnim rastom značajno pomerenim prema oksidativnoj strani na tački profila neravnoteže gde se ~50 mmol/DW/sat NADH pretvara u NADH (slika 1B). Kada smo umjesto toga razmatrali neravnotežu u mitohondrijima, uočili smo maksimum na tački nulte neravnoteže (slika 1C), obrazac koji smo slično primijetili i na drugim profilima (slika S1). Generalno, reduktivni uslovi postaju

Slika 1. Profil tolerancije karakterizira odgovor na redoks neravnoteže

(A) Vrh. Uveli smo umjetnu reakciju u model metaboličke rekonstrukcije organizma (u ovom slučaju kvasca) da se međusobno konvertuju dva konjugirana oblika redoks koenzima (ovdje NADH/NADH par). U svakom od niza uslova neravnoteže, tj. vrednosti brzine veštačke reakcije, primenjujemo analizu ravnoteže fluksa da bismo izračunali brzinu rasta. Dno. Predviđene vrijednosti rasta su ucrtane u odnosu na vrijednosti stope neravnoteže koje ocrtavaju profil tolerancije; proxy za toleranciju metabolizma kada se suoči sa odabranom perturbacijom.cistanche nz(B) Profil tolerancije u kvascu povezan sa neravnotežama koje se nalaze u citosolu.

(C) Profil tolerancije u kvascu povezan s neravnotežama lociranim u mitohondrijima. Plavo/crveno sjenčanje predstavlja režim smanjene i oksidirane neravnoteže, a sive tačke označavaju vrijednosti koje odgovaraju bez neravnoteže ili ekstremne reduktivne/oksidativne neravnoteže koje ne proizvode rast. štetno i smrtonosno brže od oksidativnih režima. U dva slučaja (konjugirani parovi citosolnog NADH ili mitohondrijalnog tioredoksina), blaga umjetna oksidacija para poboljšava rast (slika S1).

NADH/NAD* perturbacije uzrokuju metaboličke sindrome koji podsjećaju na patologiju

Energetski metabolizam kvasca bez neravnoteže odgovara karakterističnom aerobnom metabolizmu u prisustvu glukoze (proučavani uslovi rasta) u kojem je glikoliza povezana s ciklusom trikarboksilne kiseline (TCA) i oksidativnom fosforilacijom. Pentozofosfatni put oksidira glukozu i obezbjeđuje ribozu-5P za sintezu nukleotida i NADPH-rodukcionu moć za anabolizam, dok anaplerotski putevi napuštaju TCA ciklus, slični onima metabolizma glutamina, umjereno se koriste za prvenstveno hranjenje pirimidina i sinteza aminokiselina. FBA nam omogućava da kvantifikujemo promjene u ovim putevima i kako oni na kraju detaljno opisuju metaboličke osobine koje su u osnovi bilo kojeg određenog režima neravnoteže.

Konkretno, Slika 2A pokazuje kako je reduktivna neravnoteža citosolnog NADH/NADH dovela do povećanja glikolitičkog fluksa, smanjenja aktivnosti TCA ciklusa i lanca transporta elektrona, te porasta metabolizma glutamina. Ovaj pseudohipoksični metabolički potpis – u prisustvu kiseonika – podseća na anaerobni metabolizam, gde je glikoliza povezana sa alkoholnom ili mlečnom fermentacijom na štetu mitohondrijalnih puteva; oksigenski dio pentozofosfatnog puta je zatvoren i metabolizam glutamina, koji je aktivniji, mogao bi se preusmjeriti na proizvodnju piruvata koji bi doprinio anabolizmu. Značajno je da ovaj fenotip obuhvata neke karakteristike paradoksalnog metabolizma prinosa uočenog u različitim tipovima kancerogenih ćelija (Warburgov efekat) (Potter et al., 2016).

Slika 2. Tokovi glavnih puteva upravljanja energijom koji su u osnovi profila tolerancije u kvascu (A) Citosolna NADH/NAD neravnoteža (gore) i vrijednosti fluksa pet reprezentativnih puteva (dolje); i/glikoliza (Glikoliza, jezgro), ii/Krebsov ciklus (TCA, roze), ili/pentoza fosfat (Penphos, zeleni), iv/oksidativna fosforilacija (Oxphos, siva) i metabolizam glutamina (Glutamin, ljubičasta). Prikazani vektori fluksa su rezultat usrednjavanja fluksa svih reakcija određenog puta.

(B) Isto kao (A) u pogledu mitohondrijalne neravnoteže. Obratite pažnju na prisustvo negativnih tokova u glikolizi (panel A, dno) predstavlja povećanu glukoneogenezu. Za detalje pogledajte glavni tekst.

Nasuprot tome, energetski metabolizam koji leži u osnovi oksidativne tolerancije (u odnosu na citosol, slika 2A) pokazao je više aerobnu konfiguraciju, ali sa specifičnostima, kao što je posebno aktivan metabolizam poliamina; i ekstremna svojstva, uključujući povećanu glukoneogenezu, oksidativnu fosforilaciju i aktivnost TCA ciklusa, kao i veoma visok (do 12- puta više od normalnog nivoa) protok kroz pentozofosfatni put. Ovo posljednje može ipak biti artefakt razlika u pseudo reakciji biomase, pod vrlo visokom (preko 55 mmol/gDW/h) oksidativnom neravnotežom (vidi metode S1).

Kada je reakcija neravnoteže locirana u mitohondrijama, redukcija NADH je opet izazvala određeno pseudohipoksično ponašanje, s jednom razlikom (slika 2B). Protok kroz glikolizu i metabolizam glutamina se povećao, uz istovremeni gubitak dijelova TCA ciklusa i pentozofosfatnog puta. Međutim, za razliku od citosolnog slučaja, oksidativna fosforilacija se značajno povećala. S druge strane, oksidativna strana mitohondrijalnog profila bila je više idiosinkratična: glikolitička aktivnost se povećavala paralelno s onom TCA ciklusa, ali je oksidativna fosforilacija djelovala najvećim dijelom na nižim razinama od normalnog, a metabolizam glutamina je bio od male važnosti,

Metabolički sindromi su rezultat kompromisa između redoks ravnoteže, proizvodnje biomase i kompromisa ATP/NADH

Identificirali smo nekoliko ključnih elemenata koji su oblikovali prethodne sindrome.veličina penisa cistancheOksidativna perturbacija naišla je na pojačan aerobni odgovor kao kompromis između održavanja rasta i puferiranja poremećaja neravnoteže. Ovo je uključivalo preusmjeravanje toka kroz maksimalni mogući broj reakcija koje su smanjile NAD plus uz očuvanje globalne distribucije toka koja je bila sposobna za generiranje sastojaka biomase. Ova dva mehanistička elementa (puferiranje perturbacija i maksimizacija biomase) su najrelevantniji zahtjevi optimizacijskog problema i dovoljni za opisivanje oksidativnog režima profila tolerancije.

Slika 3. Konkurentni mehanizmi uzrokuju pseudohipoksično ponašanje kvasca

(A) Ravnoteža između NADH, ATP i proizvodnje prekursora biomase favorizira reakcione module koji proizvode što je više ATP-a i što je manje NADH moguće kako bi se kompenzirale posljedice reduktivnih režima, npr. korištenje glikolize u odnosu na TCA. Imajte na umu da ljubičaste strelice predstavljaju proizvodnju ATP-a, žute strelice predstavljaju proizvodnju NAD(H), a bijeli krugovi označavaju generiranje prekursora biomase, (B) NADH sklon perturbaciji NADH/NADt (x-osa) se preklapa s umjetnim ADP-om reakcija fosforilacije (y-osa) koja snažno uvodi reduktivnu snagu u obliku ATP-a u neuravnoteženi metabolizam. Gradijent zelene boje predstavlja omjer između glikolitičkog i Krebsovog ciklusa fluksa normaliziran njegovom normalnom vrijednošću (do 100- puta). Može se shvatiti da fosforilacija ADP-a smanjuje pseudohipoksični fenotip i odlaže mirovanje.

Međutim, reduktivna strana zahtijevala je jedan dodatni uvid. Kako se sve više NADH vezuje za NADH reakcije koje koriste NADt i koje su direktno ili indirektno potrebne za proizvodnju sastojaka biomase postaju sve više i više ograničene, tako se energetski metabolizam mora preusmjeriti kako bi se omogućila povećana konverzija NADH u NAD' i ograničio redukcija NAD' u NADH. Ovo je još uvijek nedovoljno za suočavanje s perturbacijom, budući da je većina redukcijske snage u obliku NADH u suštini beskorisna za mnoge metaboličke ciljeve, reakcije i rast: energija pohranjena u NADH mora se preusmjeriti u ADP. Dakle, metabolizam mora dati prioritet reakcionim modulima koji proizvode što više ATP-a i što manje NADH; mora se oslanjati na šantove i puteve koji imaju visok prinos ATP/NADH, npr. glikoliza i oksidativna fosforilacija.

Ovi rezultiraju, između ostalog, smanjenim TCA ciklusom i povećanim glikolitičkim fluksom (Slika 3A). Da bismo dalje istražili utjecaj ovog kompromisa ATP/NADH, preklopili smo reduktivnu perturbaciju NADH/NAD s umjetnom reakcijom koja omogućava fosforilaciju ADP-a. . Simulacije su pokazale da povišeni omjer fluksa ciklusa glikolize i TCA koji karakterizira reduktivni metabolizam ovisi o prinosu ATP/NADH

Slika 4. Rezultat tolerancije kao prediktor hronološkog životnog vijeka kvasca

(A) Profili tolerancije dobiveni za mutante kvasca; plavi/crveni sektori krive predstavljaju reduktivni/oksidativni režim neravnoteže NADH/NADH.

(B) Povezanost između normaliziranog rezultata tolerancije (proporcionalno širini vrijednosti neravnoteže i kod oksidativnog i kod reduktivnog režima, STAR metode) i hronološkog životnog vijeka. Korelacija objašnjava ~30 posto ukupne varijanse (R'= 0. 29, p-vrijednost=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Kao alternativni način sagledavanja ove asocijacije, dobili smo histogram vrijednosti nagiba regresije dobivenih iz deset hiljada nasumično generiranih asocijacija između rezultata tolerancije i životnog vijeka. Iz ovog uzorka nalazimo samo 3 slučaja u kojima je povezanost između rezultata tolerancije i podataka o životnom vijeku jača od pronađene (označeno crvenom okomitom linijom).

(Slika 3B). Snažno fosforiliranje ADP-a smanjuje ovaj pseudohipoksični potpis čak iu slučaju vrlo jakih stopa disbalansa sklonih NADH.

Tolerancija objašnjava eksperimentalne kronološke razlike u životnom vijeku između različitih mutanata kvasca

Pitali smo u kojoj mjeri profil tolerancije može djelovati kao prediktor životnog vijeka, s obzirom da se o redoks parovima raspravljalo kao o potencijalnim determinantama životnog vijeka. Jedan od načina da se ovo prouči je da se izračuna profil u različitim mutantima (slika 4A) i zatim kvantifikuje kako on odgovara tačnim mjerama životnog vijeka, normaliziranim hronološkim životnim vijekom (CLS), dostupnim iz eksperimentalno izmjerenih krivulja preživljavanja mutanata (Garay et al., 2014). CLS se izračunavaju iz ovih krivulja preživljavanja mutanta kao povećanje preživljavanja u stacionarnoj fazi u odnosu na divlji tip.

U FBA, mutacije u specifičnim genima se simuliraju ograničavanjem protoka reakcija povezanih s njima kroz Booleova pravila koja povezuju svaku hemijsku reakciju sa ORF-ovima koji se prevode za enzim reakcije (STAR ​​metode). Za svaki od ovih mutanata izračunali smo profil tolerancije mutanata (Slika 4A) i koristili zbir apsolutnih vrijednosti neravnoteže pri kojoj je stopa rasta prepolovljena (i u reduktivnom i u oksidativnom režimu) kao skalarni rezultat tolerancije (STAR metode).

Naš skup mutanata je međutim bio ograničen nekim ograničenjima (STAR ​​metode). Primjetno, nismo bili u stanju razlikovati razlike u toleranciji ispod 10 ppm vrijednosti divljeg tipa bez dostizanja previsokih vremena izračunavanja, a mnogi mutanti su pokazali i zanemarljive razlike u životnom vijeku i zanemarljive razlike u toleranciji. Osim toga, općenito se smatra da FBA nije u stanju okarakterizirati delecije pojačanja funkcije i, sasvim predvidljivo, nijedna tolerancija mutanata nije premašila toleranciju divljeg tipa.

Iznad ovih ograničenja, profili tolerancije in silico su mogli objasniti -30 posto eksperimentalno izmjerene varijabilnosti životnog vijeka (Slika 4B, R2= 0.29, N=41,p vrijednost{{5 }}.2x 10-) sa velikim značajem:10,000 randomizacije parova podataka dovele su do samo 3 instance sa većim nagibom regresije (slika 4C).

Konvencionalni nutrijenti omogućavaju toleranciju na neravnotežu NADH/NADH

Na kraju, istražili smo da li su specifični metaboliti u ishrani bili posebno determinantni u odgovoru na redoks neravnotežu. U tu svrhu koristili smo dodatnu značajku FBA modela, a to je mogućnost pristupa korištenju određenog metabolita (definiranom kao stopa potrošnje u stabilnom stanju, STAR metode). Ispitivali smo način na koji se ova stopa mijenjala s povećanjem vrijednosti reduktivnog i oksidativnog NADH/NAD plus neravnoteže.

Upotreba je bila prilično linearna na obje strane profila i za većinu metabolita. Stoga smo ovaj promjenjivi obrazac uklopili u linearni model i (apsolutni) nagib smatrali skalarnim predstavnikom relevantnosti odgovarajućeg metabolita za toleriranje redoks neravnoteže (Slika 5A). Među nutrijentima iAZ900 koji najbolje reagiraju, primijetili smo metabolite u ishrani za koje se zna da igraju ključnu ulogu u regulaciji životnog vijeka kvasca, kao što je acetat (Burtner et al., 2009), kao i mnoge koji eksperimentalno produžavaju životni vijek kvasca, crva, ili čak ljudske ćelije (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016) uključujući malat, hidroksibutirat, spermidin ili oksaloacetat (Slike 5B-5D, Tabela S1).

Određeni nutrijenti su bili relevantniji za toleranciju na NADredukciju, drugi na NADHoksidaciju, a nekoliko na oba ova režima. Najvažniji metaboliti u ishrani za reduktivnu toleranciju bili su acetat, beta-hidroksibutirat (BHB), glutamat i glutamin (slika 5B), dok su najvažniji za tolerisanje NADH oksidacije bili acetat, NADP plus, putrescin i spermidin. (Slika 5D). Među onima koji su učestvovali iz tolerancije na obje strane profila, najrelevantniji je bio red acetat, glutamat, oksaloacetat i oksoglutarat (slika 5C).

Razmotrili smo metaboličke modele u drugim organizmima kako bismo dodatno potvrdili koji nutrijenti su determinante u odgovoru na neravnotežu (metode S1, vidi i sliku S2 za to kako se mijenjaju tokovi glavnih puteva). Svi ovi glavni doprinositelji su se promijenili, iako ne u velikoj mjeri, s alfa-keto kiselinama, redoks parovima, određenim vitaminima i određenim aminokiselinama koje su bile značajno neophodne za kontrolu NADH/NADt perturbacija u C.elegansu i rekonstrukciju ljudi. Najčešća reakcija na redoks neravnotežu kod ovih organizama odnosi se na metabolite koji posreduju u pH homeostazi, kao što su acetat, bikarbonat, bifosfat, natrij, voda i dr. Slično, značaj glutamata, glutamina, aspartata, treonina, serina i glicina razlikuje ih od drugih aminokiselina i većine metabolita. Oksidirane kiseline srednje veličine kao što su oksoglutarat, malat i oksaloacetat također igraju ulogu u toleranciji dosljedno, kao što imaju tendenciju da imaju biotin i neki folati (pogledajte Tabelu S1 za potpunu listu).

DISKUSIJA

Ovdje predlažemo alternativni pristup razumijevanju širokih bioloških posljedica promjena u redoks parovima. Ovaj pristup se zasniva na in silico metaboličkim modelima i uvodi pojam profila tolerancije kao mjere koja kvantificira ćelijsku otpornost na ove promjene.

Slika 5. Homeostatske hranjive tvari u kvascu

(A) Primjer profila upotrebe hranjive tvari s odgovarajućim reduktivnim (plava) i oksidativna (crvena) linearnim regresijama koje karakteriziraju nagibi m, odnosno m. (u apsolutnim vrijednostima). Uključili smo profil citosolne tolerancije u pozadini kao referencu.

(B) Nagibi linearne regresije (m,) prva 4 homeostatska nutrijenta u reduktivnom smislu NADH/NAD plus perturbacija.

(C) Nagibi linearne regresije top4 nutrijenata koji su homeostatski u oba smisla perturbacije; Plava: Redukcioni nagib linearne regresije; Crvena: Oksidativni nagib linearne regresije.

(D) Nagibi linearne regresije (m.) prva 4 homeostatska nutrijenta u oksidativnom smislu NADH/NAD plus perturbacija.

Metaboličke prilagodbe koje su u osnovi profila otkrivaju prisustvo pseudohipoksičnog fenotipa povezanog sa reduktivnim NADH režimima. Ovaj fenotip podsjeća na neke naizgled paradoksalne energetske metabolizme niskog prinosa uočene kod karcinoma (efekat Warburga), a prepoznat je i u ćelijama kvasca (Crabtree efekt) i bakterijama (metabolizam prelijevanja) (Basan et al., 2015; Mori et al., 2016; Potter et al., 2016). Mogućnost da bi ovo ponašanje moglo biti uzrokovano ograničenjima raspodjele resursa koja nastaju pri relativno visokim stopama rasta ili uzimanja glukoze iznesena je posljednjih godina (Basan et al, 2015; Mori et al, 2016). Međutim, pseudohipoksični fenotip koji opažamo je nezavisan od brzine rasta i unosa glukoze, i zapravo se javlja zajedno s niskim stopama rasta (STAR ​​metode). Pokazali smo da njegov uzrok leži u fundamentalnom kompromisu ATP/NADH, razlog koji je podržan nedavnim eksperimentalnim istraživanjem (Maldo-nado i Lemasters, 2014).

Nadalje, naša analiza fluksa sugerira da na održavanje ATP-a može negativno utjecati reduktivni NADH/NAD plus neravnoteža. Smatra se da je povećani NADH korelacija smanjene dostupnosti ATP-a, jer oštećenje oksidativne fosforilacije može rezultirati i povećanjem NADH/NAD plus i smanjenjem ATP/ADP. Pokazali smo da ekstrinzično generirana neravnoteža NADH može biti uzrok smanjene dostupnosti energije kroz ortogonalne metaboličke mehanizme, čak i dok oksidativna fosforilacija djeluje na normalnim razinama. Ovo je vrlo značajno u kontekstu istraživanja starenja, budući da su smanjena dostupnost energije i omjeri ATP/ADP očuvani obilježje ćelijskog starenja i patologija povezanih sa starenjem (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013. ) i može promovirati akumulaciju toksičnog otpada i gubitak proteostaze (još jedan znak starenja) smanjenjem prometa proteina i stoga povećanjem poluživota proteina (Anisimova i sur., 2018).

Sljedeći cilj nam je utvrditi valjanost našeg okvira kao prediktora životnog vijeka i metabolita u ishrani koji ublažavaju redoks neravnotežu. Tolerancija predviđa ćelijski životni vijek, uz neka ograničenja zbog dostupnog skupa podataka. Kontrolirajući ova ograničenja (Garay et al., 2014), nalazimo da su rezultirajuće korelacije još uvijek dovoljan dokaz o povezanosti između varijansi tolerancije i CLS-a.

Suprotno našim očekivanjima, najizrazitija lekcija izvučena iz naše analize prehrambenih metabolita je da se glavna supstanca koja pokreće odgovor na neravnotežu ne oslanja posebno na NADt mrežu za spašavanje. Zaista, glavni "homeostatski nutrijenti" su međuprodukti TCA ciklusa i drugih dijelova centralnog metabolizma čije djelovanje je daleko prodornije od djelovanja NAD prekursora. Osim toga, relevantnost reakcija koje reduciraju ili oksidiraju NAD(H) dok djeluju kao mostovi između redoks para i glavnih metaboličkih puteva daleko je superiornija od one enzima koji ograničavaju spašavanje NADt (kao što je nikotinamid mononukleotid adeniltransferaza).

Na primjer, rezultat oksaloacetata i oksoglutarata u modelu kvasca među četiri najefikasnija metabolita koji su u osnovi tolerancije u reduktivnim i oksidativnim uvjetima, konzistentna karakteristika koja potvrđuje prethodne eksperimentalne rezultate (Chin et al., 2014; Williams et al., 2009) . Ostali značajni metaboliti uključuju hidroksibutirat za koji se dosljedno pokazalo da produžava životni vijek, reguliše NAD i posreduje u odgovoru na gladovanje (Edwards et al., 2014; Newman i Verdin, 2014) i spermidin, koji pripada porodici poliamina i poznat je kao igraju uloge u procesima vezanim za starenje, autofagiji i zaštiti DNK (Eisenberg et al, 2009; Minois et al. 2011: Pietrocola et al. 2015).

Koristili smo C.elegans i ljudske modele da ojačamo prethodnu evaluaciju, otkrivajući širu sliku koja je usredsređena na pH homeostazu, redoks parove i TCA ciklus. Ovo sugerira da su načini na koje pH (Burtner et al., 2009.) i NADH neravnoteža (Ayer et al., 2014.) određuju starenje u stanicama duboko isprepleteni. Osim pH vrijednosti, najprodorniji i najvažniji nutrijenti za regulaciju NADH/NAD plus neravnoteže su alfa-keto kiseline oksaloacetat i oksoglutarat, njihovi aminirani oblici i drugi metaboliti povezani s mitohondrijima kao što su malat, piruvat i fumarat, tj., glavno središte kontrola redoks ravnoteže je TCA ciklus.

Do danas, mehanizmi putem kojih aminokiseline i TCA intermedijari ciklusa utiču na produženje života kvasca i C. elegans ostaju nejasni. Metaboliti poput malata, oksaloacetata, fumarata, valina, serina ili treonina zaista mogu produžiti životni vijek organizama, ali procesi koji dovode do ovih efekata su sporni i složeni (Edwards et al., 2013, 2015). Naši rezultati pokazuju da zajedničko objašnjenje za sve ove fenomene produženja života leži u efektu nutrijenata na kapacitet ćelija da tolerišu poremećaje u NADH/NAD plus omjeru.

Međutim, moglo bi se tvrditi da neki od metabolita koji se razmatraju izgledaju sami po sebi očigledni jer su ipak uključeni u reakcije koje međusobno pretvaraju NADH i NAD plus. Postavlja se onda pitanje zašto se drugi metaboliti koji također a priori izgledaju očigledni ne pojavljuju u našim rezultatima. Odgovor leži u mehanizmima koji osiguravaju realna predviđanja u FBA. Da bi nutrijent bio "homeostatski" protiv redoks neravnoteže, on ne samo da mora povećati proizvodnju NADH ili NADt, već mora stajati u centralnom putu ili modulu sa visokim prinosom ATP/NADH i/ili kapacitetom da obezbijedi sastojke biomase.

Konačno, još dva uvida iz naših rezultata su vrijedna pažnje. S jedne strane, oni sugeriraju da su kao odgovor na redoks neravnotežu, metaboličke mreže spremne da sve više proizvode i/ili konzumiraju neke metabolite koje signalne mreže tumače kao onemogućavanje potrebe za autofagijom, antioksidativnim i hormetičkim odgovorima, kao i mnoge koje suvišne ili je utvrđeno da suplementacija produžava životni vijek i/ili na drugi način oponaša efekte kalorijske restrikcije (CR), na način koji ovisi o signalnim putevima koji su uključeni u produženje životnog vijeka posredovano CR. Ovo pojačava prethodne dokaze koji povezuju balans CR i NADH/NADH kao dio istog procesa koji produžava životni vijek i promovira zdravlje (Lin et al., 2004).

S druge strane, naša studija pokazuje da kao odgovor na izmijenjene omjere, metabolizam također sve više koristi određene tvari koje mogu kemijski oštetiti ćeliju, kao što su acetat, putrescin ili acetaldehid; kao i neki koji mogu promovirati tumorigenezu putem metaboličkih promjena, kao što su glutamin, sukcinat i fumarat (Sciacovell et al., 2016). To bi onda moglo djelomično objasniti patologije povezane s redoks neravnotežom i makroskopskim procesima u koje je uključen, kao što su degenerativne i onkološke bolesti: ako se redoks neravnoteža mora puferirati tvarima koje su toksične, onda su te tvari vjerojatno mehanizmi patologija koje -nastaju sa redoks neravnotežom.

Shvaćamo da se naš pristup redoks neravnoteži može shvatiti kao neobična varijacija studije robusnosti metaboličke mreže i da može optužiti određena upozorenja koja ostavljaju dosta prostora za poboljšanje. Što se tiče robusnosti, studije koje koriste FBA tradicionalno su je definirale kao promjenu objektivnog rješenja (obično rast) kao odgovor na promjenjivo smanjenje stopa reakcije, npr. (Edwards i Palsson, 2000.), a ne na određenu perturbaciju (redox neravnoteža). ) u metabolitima kao i mi. S obzirom na ograničenja naše analize, ona se mogu povezati sa intrinzičnim ograničenjima samog FBA, kao što je odsustvo regulatornih gena. U konačnici, pouzdanost naših rezultata ovisi o prediktivnoj moći metaboličkih rekonstrukcija: trenutni modeli kvasca su prediktivni i napredni, ali nisu savršeni (Heavner i Price, 2015.), a ipak su daleko bolji čak i od dostupne precizne višećelijske rekonstrukcije. Uprkos svim ovim zabrinutostima, postoji mnogo dokaza koji garantuju sve veću vjernost metaboličkih modela prirodnom ponašanju.

Trenutno, preovlađujuća istraživanja imaju tendenciju da ignorišu potencijalne negativne posljedice neselektivnog smanjenja NADH/NADH omjera. Ovo je dijelom zbog obećavajućih prednosti koje proizlaze iz blagih dekremenata postignutih eksperimentalno, što uključuje smanjenje neoplastičnih fenotipova, životnog vijeka i produženja zdravstvenog vijeka. Međutim, postoje dokazi koji preporučuju krajnji oprez u pogledu ovih pozitivnih rezultata (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), kao i čvrst, eksperimentalno održiv teorijski okvir koji predviđa negativne posljedice smanjenja NADH/NADH omjera iznad prag (Aon et al., 2010). Naši profili tolerancije NADH/NADt neravnoteže odgovaraju ovoj novoj slici, jer blage oksidativne devijacije mogu biti korisne, ali veće su jednako štetne kao i suprotni ekstrem.

Preciznije, naši profili tolerancije sugerišu da pored izazivanja hemijskih ili fizioloških problema, i niski i visoki omjeri NADH/NADH moraju se suočiti i sa čisto metaboličkim nedostacima, uključujući smanjenu dostupnost energije i/ili biosintetski izlaz. Nadalje, i kao što smo istakli, ograničena eksperimentalna zapažanja koja su dostupna o nekim od pitanja kojima se bavimo izgledaju podsjećaju na rezultate koje ovdje izvještavamo.

Ograničenja studije

Ovdje predstavljeni rezultati bi se poboljšali kada se korišteni modeli dodatno usavrše. Naš rad također pati od intrinzičnih ograničenja FBA kao tehnike. Na primjer, dinamičke informacije su nedostupne, s obzirom na to da su trenutno dostupne verzije dinamičke analize toka previše smanjenog opsega. Slično tome, nedostatak implicitnih energetskih ograničenja u ravnoteži protoka umanjuje njegovu prediktivnost za visoke stope rasta. Ova slabost je motivisala dodavanje tehnika kao što je CAFBA, kao što smo razmotrili u rukopisu. Konačno, bilo bi zanimljivo pristupiti regulatornim informacijama, koje se lako mogu kontrolisati i uključiti ili isključiti. Trenutno ne postoje standardizirani pristupi implementaciji regulacije gena u FBA. Primena rezultata reakcionih aktivnosti na granice ograničenja je obećavajuća u ovom pogledu.

Ovaj članak je preuzet iz iScience 24, 102697, 23. jula 2021.