Terapijski učinak i mehanizam Cistanche feniletanol glikozida na ciklofosfamidom induciranu spermatogenezu kod miševa
Mar 11, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
ZHAODong-hai1, ZHANGLEi2, ZHANGYan3, QILing1, ZOU Xiang-ming4
[Sažetak]
svrha:Kako bi istražili terapijski učinakCistanche feniletanoidni glikozidina miševima sa ciklofosfamidom izazvanom spermatogenezom i preliminarno razjasniti mehanizam njegovog djelovanja.Metoda:Metoda ekstrakcije etanolom za ekstrakcijuCistanche feniletanoidni glikozidi. Četrdeset BALB/C miševa nasumično je podijeljeno u kontrolnu grupu, modelsku grupu, nisku dozuCistanche feniletanoidni glikozidgrupa (50 mg·kg-1), i grupa sa visokim dozama (100 mg·kg-1), sa 10 miševa u svakoj grupi. Osim kontrolne grupe, miševima u drugim grupama je injektiran ciklofosfamid (80 mg·kg-1) svakog dana tokom 5 uzastopnih dana da bi se pripremili mišji modeli poremećaja spermatogeneze. Nakon posljednje primjene, miševi u grupama s niskim i visokim dozamaCistanche feniletanoidni glikozididavane su odgovarajuće doze putem sonde, a miševima u kontrolnoj grupi i modelnoj grupi davana je ista količina normalnog fiziološkog rastvora putem sonde, jednom dnevno tokom 30 dana. Dvadeset četiri sata nakon posljednje sonde uzeto je tkivo testisa miša. Za određivanje nivoa testosterona u homogenatu tkiva testisa miša korišten je enzimski imunosorbentni test. Gustoća sperme, pokretljivost spermatozoida i stopa abnormalnosti spermatozoida u svakoj grupi su upoređivani. Morfološke promjene tkiva testisa uočene su HE bojenjem. Rezultati: U poređenju sa kontrolnom grupom, smanjena je gustina spermatozoida i brzina pokretljivosti spermatozoida modelne grupe (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" increased=""><0.01), and="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" decreased=""><0.01). 0.01);="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="">Cistanche feniletanoidni glikozidiznačajno su povećane (P<0.01), the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.01), and="" the="" testicular="" tissue="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" homogenate="" increased=""><0.05 or=""><0.01). histological="" observations="" showed="" that="" the="" seminiferous="" tubules="" in="" the="" testis="" of="" the="" model="" group="" were="" atrophied="" and="" degenerated,="" the="" seminiferous="" epithelium="" was="" significantly="" thinner,="" the="" arrangement="" of="" spermatogenic="" cells="" was="" disordered,="" and="" the="" number="" of="" sperm="" in="" the="" cavity="" decreased;="" the="" number="" of="" the="" seminiferous="" epithelium="" in="" the="" testes="" of="" the="">Cistanche feniletanoidni glikozidgrupa značajno povećana, Slojevi su različiti, spermatogene ćelije su raspoređene uredno, čvrsto i pravilno, a spermatozoidi se vide u lumenu.zaključak: Cistanche feniletanoidni glikozidiimaju značajan terapeutski učinak na poremećaj spermatogeneze uzrokovan ciklofosfamidom kod miševa, a njegov mehanizam može biti povezan sa poboljšanjem nivoa testosterona u tkivima testisa.
[Ključne riječi]Cistanche feniletanoidni glikozidi; ciklofosfamid; poremećaj spermatogeneze; miševi, BALB/C
Zbog ubrzanja društvenog ritma, loših životnih navika i zagađenja okoline i drugih faktora, abnormalni kvalitet sperme kao što su oligospermija i astenospermija postali su glavni uzrok muške neplodnosti [1]. Trenutno postoji manje lijekova za liječenje oligospermije i astenospermije, a terapijski učinak nije očit. Recepti tradicionalne kineske medicine ili aktivni sastojci imaju dobre efekte u poboljšanju muške reproduktivne funkcije [2-6]. Međutim, zbog širokog spektra lijekova koji se izdaju na recept, odnos između farmakoloških učinaka i djelotvornih sastojaka lijeka nije jasan, što ograničava promociju i primjenu spermatogenih lijekova. Istraživanje i razvoj efikasnih sastojaka kineske medicine i proučavanje njenih terapeutskih efekata kod reproduktivnih povreda imaju dobru primenu.Cistanche feniletanoidni glikozidisu jedan od najvažnijih aktivnih sastojaka uCistanche deserticola. Obično su prirodni glikozidi koji sadrže esterske veze i okso-glikozidne veze sa -glukozom kao jezgrom. Široko se nalaze u dvosupnim biljkama [7]. Studije [8] su to pokazaleCistanchefeniletanoidglikozidimože zaštititi spermu štakora od oksidativnog oštećenja in vitro, ali nema izvještaja o njenoj spermatogenezi. Ovaj eksperiment proučava terapijski učinak Cistanche feniletanoidnih glikozida na spermatogenu funkciju miševa sa ciklofosfamidom induciranom spermatogenezom i pruža eksperimentalnu i teorijsku osnovu za primjenuCistanche feniletanoidni glikozidiu liječenju poremećaja spermatogeneze.
1. Materijali i metode
1.1. Laboratorijske životinje, glavni reagensi i instrumenti
40 odraslih BALB/C miševa SPF klase, starih 6-8 sedmica, tjelesne mase od 20-22g, kupljeno je od Eksperimentalnog centra za životinje Škole osnovne medicine Univerziteta Jilin i broj certifikata za životinje : SCXK (Kirgistan) 2008-005. Miševi su uzgajani adaptivno 5 dana prije eksperimenta. Uslovi hranjenja: 22-25 stepeni, cirkadijalni ritam (12h/12h), besplatna voda za piće i hrana. Cistanche je proizvod Xinjiang Dakang Trading Company. Ciklofosfamid za injekcije je kupljen od Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (br. serije 11061921). Homogenat tkiva testisa testosteron enzimski vezan za imunotest komplet je kupljen od Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (broj serije) 20120812), svi ostali reagensi su domaće proizvodnje analitičke klase. PLUS384 čitač mikroploča (MDC u Sjedinjenim Državama), TE2000U invertni mikroskop (Nikon, Japan) i J-26XP centrifuga (Nanodrop, Sjedinjene Države).
1.2 Priprema Cistanche Phenylethanol Glucoside
10 g cistanche praha ekstrahirano je refluksom sa 70 posto etanola, dva puta, svaki put po 2 sata, da bi se dobio koncentrat fenetil alkohola glikozida. Koncentrovana otopina je hromatografirana na koloni D101 makroporozne smole i eluirana sa 70 posto etanola da se dobije Cistanche fenekozidni alkohol. UV spektrofotometar je identifikovao ekstrakt na talasnoj dužini od 333 nm.
1.3 Priprema životinjskog modela i metoda primjene lijeka
Nakon što je 40 mužjaka BALB/C miševa adaptivno hranjeno 5 dana, miševi su nasumično podijeljeni u 4 grupe (10 miševa u svakoj grupi): kontrolna grupa, model grupa, CistancheCistanche feniletanoidni glikozidigrupa sa niskim dozama, iCistanche feniletanoidni glikozidigrupa sa visokim dozama. Osim kontrolne grupe, ostale tri grupe miševa dobile su intraperitonealnu injekciju ciklofosfamida 80 mg·kg-1 za svakog miša tokom 5 uzastopnih dana da bi se pripremili životinjski modeli poremećaja spermatogeneze. Nakon što je model pripremljen, miševi u grupama niskih i visokih dozaCistanchefeniletanoid dobili su 50 i 100 mg·kg-1·d-1 respektivno. Miševima u kontrolnoj grupi i modelnoj grupi date su jednake količine normalnog fiziološkog rastvora. Jednom dnevno tokom 30 dana. Svi miševi su žrtvovani 24 sata nakon posljednje primjene lijeka i obavljeni su bilateralni testovi. Desni testis je fiksiran formaldehidom. Epididimis i testis su uzeti sa lijeve strane. Testis je homogenizovan i centrifugiran na 3,000 min 10 min. Supernatant je uzet i pohranjen u ledenici na -20 stepeni radi testiranja. Lijevi epididimis je testiran na gustinu spermatozoida, pokretljivost spermatozoida i stopu deformiteta.
1.4 Određivanje gustine sperme, pokretljivosti sperme i stope deformiteta
Stavite epruvetu koja sadrži 10 mL hranljivog rastvora sperme [9] u vodeno kupatilo sa konstantnom temperaturom da se prethodno zagreje na 37 stepeni, uzmite jednostrani epididimis da uklonite vezivno tkivo i masnoću, prerežite tkivo i stavite je u epruvetu na 37 stepeni tokom 10 minuta Nakon što se sperma potpuno oslobodi, uzmite 1 kap na ploču za brojanje krvnih zrnaca i izračunajte gustinu sperme prema metodi brojanja ćelija. Rezultat se izražava kao broj spermatozoida po mililitru; uz to uzmite 5 μL suspenzije sperme i istu količinu eozina-Y iz epruvete. Dobro promiješajte, stavite na sobnu temperaturu 10 minuta, dodajte poklopno staklo i posmatrajte svjetlosnim mikroskopom. Mrtvi spermatozoidi su obojeni ružičasto, živi spermatozoidi nisu obojeni, a citoplazma je providna. Svaki uzorak broji 200 spermatozoida, izračunava održivost sperme, rezultat se izražava u postocima, vitalnost sperme=broj živih spermatozoida / ukupan broj spermatozoida × 100 posto . Još 5 μL suspenzije sperme je fiksirano u metanolu 5 minuta, osušeno i obojeno 2 posto vodenog rastvora eozina 1 sat, isprano i sušeno fenom. Potražite dijelove s manje preklapanja spermatozoida ispod sočiva male snage i koristite sočivo velike snage da provjerite morfologiju sperme po redu. Svaki miš je pregledao 1,000 kompletnu spermu. Glave sperme bez kukica, u obliku banane, amorfne, masne glave i duple glave ocijenjene su kao deformiteti. Izračunata je stopa deformiteta sperme i rezultati su izraženi u procentima. Stopa deformiteta sperme=broj deformisanih spermatozoida / ukupan broj spermatozoida × 100 posto.
1.5. Određivanje reproduktivnih hormona
Testis je oguljen sa membrane i stavljen u posudu za bočicu, a prethodno ohlađeni medijum za homogenizaciju (0.01mol·L-1 saharoza, 0.01mol ·L-1 Tris-HCl, 0,1mmol·L-1 rastvor EDTA-Na2, pH 7,4), iseći tkivo testisa oftalmološkim makazama, sipati u staklenu epruvetu za homogenizaciju i centrifugirati na 4, 000×g tokom 10 minuta na niskoj temperaturi i uzmite supernatant. Koristite komplet za analizu enzimskog imunosorbenta za mjerenje nivoa testosterona u homogenatu tkiva testisa i testirajte 3 paralelna uzorka za svaki uzorak. Eksperimentalni koraci i metode su završeni u skladu s uputama iz kompleta.
1.6 Morfološki pregled testisa
Uzmite parafinske rezove testisa miša, obojene HE, i posmatrajte distribuciju spermatogonije i spermatogenih ćelija u tkivu testisa pod svetlosnim mikroskopom.
1.7 Statistička analiza
Statistička analiza je izvršena korištenjem SPSS17.{1}} statističkog softvera. Gustina spermatozoida, brzina pokretljivosti spermatozoida, stopa deformiteta spermatozoida i nivo testosterona u testisima kod miševa u svakoj grupi izraženi su kao x±s, a poređenje između grupa je izvršeno jednofaktorskom analizom varijanse.
2. rezultati
2.1. Gustoća sperme, pokretljivost spermatozoida i stopa deformiteta sperme svake grupe miševa
U poređenju sa kontrolnom grupom, smanjena je gustina spermatozoida i vitalnost spermatozoida modelne grupe (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" of="">Cistanche phenoxyethanol glicosidepovećana (P<0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0). .01).="" compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" had="" higher="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility=""><0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05). see="" table="">
2.2 Nivoi testosterona u tkivima testisa miševa u svakoj grupi
Nivoi testosterona u homogenatima tkiva testisa kontrolne grupe i grupe modela bili su (10.26±0},57) i (5.33±0.84) nmol·L-1, respektivno. Nivo testosterona u grupi modela bio je značajno niži u odnosu na kontrolnu grupu (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" were="" (7.55±1.21)="" and="" (10.35±0.94)="" nmol·l-1.="" the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" low="" and="" high-dose="" groups="" of="" cistanche="" cistanche="" ethanol="" glycosides="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" model="" group=""><0.05 or=""><0.01). the="" testosterone="" level="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="">Cistanchecistanche fenetil glikozid u visokodoziranoj grupi bila je značajno veća od one u grupi sa niskim dozama (P<>
2.3 Morfologija testisa miša u svakoj grupi
Posmatrano svetlosnim mikroskopom, seminiferni tubuli u testisima normalne grupe bili su gusto raspoređeni, nivo i broj zametnih ćelija veliki, epitel seminifera uredno raspoređen, a svi seminiferni tubuli su viđeni sa formiranjem sperme. U modelnoj grupi, sjemeni tubuli u testisima miševa su atrofirani i degenerirani, sjemenski epitel je značajno stanjivan, broj epitelnih slojeva je smanjen, raspored poremećen, a broj spermatozoida u šupljini smanjen. U poređenju sa modelskom grupom, niska dozaCistanche fenetil alkohol glikozid.
U grupi je povećan broj epitelnih slojeva seminifernih tubula, raspored epitela je pravilniji, a oštećenje seminifernih tubula je očigledno poboljšano; struktura sjemenih tubula u visokim dozamaCistanche feniletanoidni glikozidgrupa se značajno poboljšala, a broj i broj slojeva sjemenog epitela značajno se povećao. Uredno raspoređeni, u sjemenim tubulima se nalaze zreli spermatozoidi, a struktura se u osnovi vratila u normalu. Vidi sliku 1 (umetak 6).
3 Diskusija
Ciklofosfamid je često korišteni antitumorski lijek i imunosupresiv, koji uglavnom ometa niz intracelularnih bioloških funkcija kroz alkilaciju DNK. Reproduktivna toksičnost je jedna od glavnih nuspojava ciklofosfamida [3], koja lako može dovesti do oštećenja DNK sperme i abnormalnog razvoja sperme. Kliničke studije [10-11] pokazuju da reproduktivna toksičnost ciklofosfamida može uzrokovati azoospermiju ili oligospermiju. , Dovode do neplodnosti ili pojave genetskih defekata ili malformacija kod potomaka.
Cistanche tubulosaje višegodišnja viša parazitska biljka iz porodice Leiden. To je poznata kineska medicina koja njeguje bubrege i jang, hrani krv i hrani crijeva. To je lijek koji se često koristi na recept za tradicionalno liječenje muške reproduktivne disfunkcije [12].Feniletanoidni glikozidisu jedna od najvažnijih aktivnih komponentiCistanche[13] i imaju širok spektar farmakoloških efekata, kao što su antioksidacija, anti-aging i antitumorski [14].
U ovoj studiji ciklofosfamid je korišten za pripremu mišjeg modela poremećaja spermatogeneze, a proučavan je terapijski učinak Cistanche feniletanoidnih glikozida na poremećaj spermatogeneze uzrokovan ciklofosfamidom. Rezultati su pokazali da je u poređenju sa normalnom grupom smanjena gustina spermatozoida u grupi modela, smanjena stopa preživljavanja, a povećana stopa deformiteta. U poređenju sa modelnom grupom, sve dozne grupe Cistanche fenoksietanol glikozida mogu efikasno povećati gustinu spermatozoida, poboljšati pokretljivost spermatozoida i smanjiti stopu deformiteta spermatozoida. Gore navedeni rezultati pokazuju da glikozidi cistanche phenoxyethanol mogu promovirati spermatogenezu i zaštititi oštećeni testis. Rezultati morfologije testisa su pokazali da nakon tretmana saCistanche feniletanoidni glikozid, broj sjemenog epitela u testisu modelnih miševa je značajno povećan, slojevi su različiti, spermatogene ćelije su raspoređene uredno, čvrsto i pravilno, a spermatozoidi se mogu vidjeti u lumenu, što sugerira daCistanche phenylethanoidmože promijeniti Shanhe obnavlja strukturu i morfologiju sjemenog epitela nakon reproduktivne ozljede.
Testosteron reguliše diferencijaciju muških zametnih ćelija i neophodan je uslov za normalan razvoj testisa i normalnu pojavu spermatozoida. Neke studije [15] su objavile da je selektivno nokautiranje androgenih receptora u Sertolijevim ćelijama testisa uzrokovalo poremećaje u razvoju spermatozoida i muški sterilitet. U ovoj studiji, ciklofosfamid je korišten za proizvodnju spermatogene.
Nakon modela povrede od prepreke, nivo testosterona u tkivu testisa kod miševa bio je značajno niži od onog u normalnoj grupi. Nakon djelovanja Cistanche feniletanoidnih glikozida, nivoi testosterona u svakoj doziranoj grupi su se povećali, a nivo testosterona u grupi sa visokim dozama bio je značajno viši nego u grupi sa niskim dozama. Pretpostavlja se da glikozidi cistanche phenoxyethanol mogu promovirati spermatogenezu povećanjem razine testosterona u tkivu testisa za liječenje spermatogene disfunkcije, ali mehanizam njegovog djelovanja na testosteron zahtijeva dalje istraživanje i diskusiju.
Testosteron reguliše diferencijaciju muških zametnih ćelija i neophodan je uslov za normalan razvoj testisa i normalnu pojavu spermatozoida. Neke studije [15] su objavile da je selektivno nokautiranje androgenih receptora u Sertolijevim ćelijama testisa uzrokovalo poremećaje u razvoju spermatozoida i muški sterilitet. U ovoj studiji, ciklofosfamid je korišten za proizvodnju spermatogene.
Nakon modela povrede od prepreke, nivo testosterona u tkivu testisa kod miševa bio je značajno niži od onog u normalnoj grupi. Nakon akcije odCistanche feniletanoidni glikozidi, nivoi testosterona u svakoj doziranoj grupi su se povećali, a nivo testosterona u grupi sa visokim dozama bio je značajno viši nego u grupi sa niskim dozama. Pretpostavlja se da glikozidi cistanche phenoxyethanol mogu promovirati spermatogenezu povećanjem razine testosterona u tkivu testisa za liječenje spermatogene disfunkcije, ali mehanizam njegovog djelovanja na testosteron zahtijeva dalje istraživanje i diskusiju.
[reference]
[1] Wang Yixin, Zheng Jufen. Novi napredak u istraživanju muške neplodnosti [J]. Kineski časopis za andrologiju, 2006, 12(9): 771-774.
[2] Xie Jianxing, Wang Jun, Chen Ming, et al. Učinak Guilingji kapsule na modelne pacove s oligospermijom. Uloga proizvodnje sperme i uticaj na polne hormone [J]. Časopis Univerziteta tradicionalne kineske medicine i farmacije Guangzhou, 2011, 28(6): 621-623.
[3] Zhang Changcheng, Jia Liangliang, Li Shouchao, et al. Ukupni flavonoidi epimedijuma uzrokuju minimiziranje ciklofosfamida. Istraživanja o zaštitnom efektu barijere spermatozoida kod pacova [J]. Kineska patentna medicina, 2010, 32 (12): 2052-2055.
[4] Xu Lei, Wang Rui, Zhang Weixing, et al. Shengjing granule na oštećenju sperme izazvane ciklofosfamidom ometaju terapeutski efekat miševa [J]. Časopis Univerziteta Zhengzhou: Izdanje medicinske nauke, 2008, 43(2): 267-270.
[5] Wang Rui, Xu Lei, Zhang Weixing, et al. Učinak Shengjing granula kineske medicine na miševe oštećene spermatogenezom Eksperimentalno istraživanje terapeutskih efekata [J]. Kineski časopis za andrologiju, 2008, 14 (11): 1046-1049.
[6] Guo Kaihua, Gao Fulu, Niu Siyun, et al. Utjecaj dekocije Heshouwu na tkivo testisa kod ostarjelih pacova Utjecaj ćelijskog Rb/p53 signalnog puta transdukcije [J]. Anatomy Journal, 2010, 41(3): 435-439.
[7] Wu Haihong, Xuan Guodong, Liu Chunquan. Efekat refluksne ekstrakcije Cistanche feniletanol glukozida sa istraživanjem faktora etanola [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2009 (1): 250-251.
[8] Li Gang, Zhu Wenbin, Niu Fei, et al. Efekti Cistanche feniletanol glukozida na spermu pacova Istraživanje zaštitnog efekta vanjskog oksidativnog oštećenja [J]. Lishizhen Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, 2010, 21(9): 2205-2207.
[9] Chen Deyu, Liu Limin, Xie Qingdong, itd. Anti-semenska antitijela na mitohondrijalnu funkciju sperme Utjecaj [J]. Journal of Shantou University Medical College, 2008, 21(1): 4-6.
[10] KenneyLB, Laufer MR, Grant FD, et al. Visok rizik od informacija Highdoseccyclophamiddeforsarcomaduringchildhood [J].Cancer, 2001, 91(3): 613-621.
[11] JahunkainenK, EhmckeJ, Houm, et al. Funkcija testisa i očuvanje plodnosti kod malignih pacijenata [J]. BestPrect ResClinEndocrinol Metab, 2011, 25: 287-302.
[12] Gao Zhanyou, Zhou Haitao, Lin Qiang. Sposobnost Cistanchea da se odupre umoru od vježbanja kod pacova i utjecaju slobodnih radikala u mozgu [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(16): 9592-9595.
[13] Ren Lu, Gu Xiaohong, Tang Jian, et al. Feniletanol glikozidi u kultivisanim Cistanche cistanche Istraživanje ekstrakcije i prečišćavanja [D]. Wuxi: Univerzitet Jiangnan, 2006, 25(3): 33-36. [14] Jinghui, Zuo Jianfeng, Li Jiaoshe. Napredak u farmakološkom istraživanju fenoksietanol glikozida Izložba [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3): 440-441.
[15] ChangC, ChenYT, YehSD, et al. Infomedija proljeće TheandrogenreceptorinSertolicells [J]. ProcNatlAcadSci USA, 2004, 101 (18): 6876-6881.
