Uloga genetskog testiranja u dijagnostičkom toku rada pedijatrijskih pacijenata sa bubrežnim bolestima: iskustvo jedne ustanove

AbstractSvrhaNasljedne bolesti bubrega su među vodećim uzrocima zatajenja bubrega kod djece, što rezultira povećanom smrtnošću, visokim troškovima zdravstvene zaštite i potrebom za transplantacijom organa. Tehnologije sekvenciranja sljedeće generacije mogu pomoći u dijagnostici rijetkih monogenih stanja, omogućavajući optimizirano medicinsko upravljanje i terapijske izbore.

Metode Kliničko sekvenciranje egzoma (CES) izvedeno je na kohorti od 191 pedijatrijskog pacijenta iz jedne ustanove, nakon čega je uslijedilo sekvenciranje po Sangeru kako bi se potvrdile identificirane varijante i za studije porodične segregacije. Rezultati Svi pacijenti su imali kliničku dijagnozu bolesti bubrega: glavne kategorije bolesti bile su glomerularne bolesti (32,5%), ciliopatije (20,4%), CAKUT (17,8%), nefrolitijaza (11,5%) i tubularna bolest (10,5%). 7,3% pacijenata imalo je druga stanja. Konačan genetski test, zasnovan na CES i Sanger validaciji, dobijen je kod 37,1% pacijenata. Najveća stopa otkrivanja zabilježena je za ciliopatije (74,4%), zatim nefrolitijazu (45,5%) i tubularne bolesti (45%), dok je većina glomerularnih bolesti i CAKUT-a ostala nedijagnostikovana. Zaključci Rezultati pokazuju da genetsko testiranje koje se dosljedno koristi u dijagnostičkom radu djece s kroničnom bubrežnom bolešću može (i) potvrditi kliničku dijagnozu, (ii) pružiti ranu dijagnozu u slučaju nasljednih stanja, (iii) i genetski uzrok prethodno neprepoznatih bolesti. bolesti i (iv) prilagođavanje programa transplantacije.

Ključne riječi Kliničko sekvenciranje egzoma, sekvenciranje sljedeće generacije,Bolesti bubrega, Genetsko testiranje, Pedijatrijska kohorta

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE CISTANCHE ZAKRAJNJI STADIJ BUBREŽNE BOLESTI

Uvod

Pedijatrijske nefropatije obuhvataju veoma različite entitete bolesti u smislu kliničke prezentacije, evolucije i terapijskih opcija [1–4]. Otprilike 30% djece s kroničnom bubrežnom bolešću (CKD) pati od monogenog stanja, postotak se povećava kada se uzme u obzir djeca sa završnom bolešću bubrega (ESRD) [5, 6]. Mnoga od ove djece ostaju nedijagnostikovana u vrijeme transplantacije [4, 6, 7]. Postizanje dijagnoze za ove pacijente ne samo da implicira kraj dijagnostičke odiseje, već predstavlja nekoliko prednosti za prognozu, upravljanje i liječenje

Pionirske studije su dosljedno pokazale da je primjena tehnika sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) značajno poboljšala dijagnostički učinak kod pacijenata sa nasljednim bubrežnim bolestima (IKD) [8]. U skorije vrijeme, široko rasprostranjena upotreba NGS-a omogućila je genetsku dijagnozu u razumnom vremenu i po pristupačnim cijenama, postavljajući pitanje da li i kada treba biti integrirana u rutinski dijagnostički radni tok [5].

Genetska dijagnoza kod djece je od najveće važnosti za različite aspekte. Prvi je da može biti relevantan u kliničkom pristupu bolesti, tipičan primjer je onaj nefrotskih sindroma gdje se identifikacija strukturnih varijanti gena povezanih s podocitima osporava protiv imunosupresivnih terapija koje bi se inače rutinski koristile u periodu od nekoliko mjeseci [9]. Drugi je da može biti veoma relevantan za djetetovu porodicu i za identifikaciju drugih članova koji nose varijantu koja se može prenijeti na buduće generacije. Kada se kod probanda identifikuje patogena varijanta, kaskadno testiranje članova porodice i genetsko savetovanje kod nosilaca varijanti predstavljaju standardnu ​​praksu u kliničkoj genetici [5]. Treće je da je poznavanje patogene varijante od suštinskog značaja u kontekstu transplantacije gdje donor može biti srodnik. Zaista, ključno je isključiti prisustvo iste varijante(e) kod davaoca organa, kao i da se identifikuju svi članovi porodice kojima je potencijalno potrebna transplantacija. Četvrto je da neke bolesti predstavljaju visok rizik od relapsa nakon transplantacije organa, kao što je fokalna segmentalna glomeruloskleroza [10] ili se njihov ishod može poboljšati prilagođenijim odabirom transplantacije koja će se izvršiti, kao što je u slučaju primarne hiperoksalurija gdje kombinovana transplantacija bubrega i jetre može rezultirati boljim ishodom [11]. Konačno, jasna dijagnoza bolesti može biti korisna za pacijenta da učestvuje u kliničkim ispitivanjima i da ima koristi od novih mogućnosti liječenja [12, 13].

Krajem 2018. godine, u suradnji pedijatrijskih nefrologa i genetičara, počeli smo s izvođenjem genetskih testova za monogena stanja koja potencijalno mogu dovesti do ESRD-a, a time i do transplantacije. Naša bolnica je najveća u severozapadnoj Italiji, odvodi sa područja od oko 5 miliona ljudi. Odabrali smo vrstu analize "jedna veličina za sve", sa sekvenciranjem kliničkog egzoma, tj. otprilike 6700 gena koji su povezani s monogenim stanjima, fokusirajući analizu na genske panele prilagođene kliničkoj sumnji i stoga ograničavajući slučajne nalaze i smanjenje vremena za analizu sekvence.

Sveukupno, primjenom ovog cevovoda, dobili smo dijagnostički prinos u skladu s objavljenim podacima, sa određenom heterogenošću među različitim kliničkim sumnjama, kao što se i očekivalo. Dobijeni rezultati potvrđuju važnost uključivanja rutinskog genetskog testiranja i savjetovanja u dijagnostički radni tok pedijatrijskih pacijenata zahvaćenih nefropatijama. Zaista, identifikacija uzročnih varijanti je kritična za njihovo kliničko liječenje, a potencijalno i za optimalnu selekciju živih donora.

materijali i metode

Regrutacija pacijenata

Studija se zasnivala na dijagnostičkoj kohorti od 191 uzastopnog pedijatrijskog pacijenta (dob pri zapošljavanju < 18 godina), regrutovanih od strane Jedinice za pedijatrijsku nefrologiju, dijalizu i transplantaciju u dječjoj bolnici Regina Margherita i upućenih Službi za imunogenetiku i biologiju transplantacije. genetska analiza. Svi pacijenti uključeni u studiju dali su pismeni informirani pristanak potpisan od strane oba roditelja, kad god je to moguće.

Priprema uzoraka, sekvenciranje i bioinformatičke analize

Ekstrakcija nukleinske kiseline iz periferne krvi, analiza kvaliteta DNK, priprema biblioteke i sekvenciranje izvedeni su kao što je prethodno objavljeno [14]. Sirovi podaci dobijeni sekvenciranjem su konvertovani u FASTQ fajlove i zatim usklađeni sa Enrichment 3.1.0 ili DRAGEN Enrichment alatima (Illumina) i mapirani na TruSight One Expanded v2.{5}} manifest koristeći Homo Sapiens UCSC GRCh37 genom kao referenca za dobijanje pojedinačnih nukleotidnih varijanti, varijanti broja kopija (CNV) i strukturnih varijanti datoteka. Za identifikaciju broja kopija korišćena je osnovna linija napravljena od podataka sekvenciranja od 5 različitih pacijenata, svi negativni na CNV (prema nizu komparativnih podataka o genomskoj hibridizaciji). Ovaj pristup omogućava detekciju CNV-a čak iu polnim hromozomima, budući da su referentnu grupu činile i ženske i muške osobe, a pol ispitanika koji se analizirao je uvek bio preciziran tokom faze poravnanja. Pozivanje varijanti i određivanje prioriteta izvršeno je prema definisanim kriterijumima. Poravnanje čitanja i pokrivenost eksonima gena od interesa su provjereni i prikazani pomoću Integrative Genomics Viewer IGV, koji je besplatno dostupan na UC San Diego – Univerzitet u Kaliforniji i Broad Institute MIT-a i Univerziteta Harvard – Boston (https://software.broadinstitute. org/softver/igv/). Varijante koje će biti uključene u konačni genetski izvještaj klasificirane su prema kriterijima Američkog koledža za medicinsku genetiku i genomiku (ACMG).

Generisanje in silico liste genskih bolesti

Geni koje treba uzeti u obzir za identifikaciju varijanti i određivanje prioriteta definisani su na osnovu kliničkih sumnji. In silico liste gena su generisane u skladu sa (i) podacima iz različitih baza podataka, povezujući genotip sa fenotipom (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) i (ii) podacima iz literature. Dostupne liste gena se ažuriraju jednom godišnje na osnovu novih dokaza povezanosti gena i bolesti.

Sanger sekvenciranje i amplifikacija sonde ovisno o multipleksnoj ligaciji (MLPA)

Sangerove sekvence i/ili MLPA analize su obavljene da bi se potvrdile varijante identifikovane od strane NGS-a i za studije porodične segregacije. Ukratko, DNK je ekstrahovan počevši od drugog nezavisnog alikvota probandove periferne krvi i od roditelja. DNK regioni od interesa su amplificirani PCR-om koristeći specifične eksperimentalne uslove. Čistoća i specifičnost amplificiranih regija provjerena je pomoću 0.8 ili 1,5% agaroznog gela. Amplificirani PCR proizvodi su zatim sekvencionirani po Sangeru korištenjem istih prajmera. Za varijante PKD1, validacija je izvršena korištenjem PCR dugog dometa praćenog ugniježđenim PCR-om kako bi se izbjegao bilo kakav zaključak iz pseudogena.

Rezultati

Definisanje kriterijuma za vraćanje rezultata genetske analize

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 gena uključenih u različite oblike bolesti bubrega [14]. Za ovu studiju, implementirali smo analizu sa podpanelima fokusiranim na specifičnu kliničku kategoriju sumnje (npr. CAKUT, glomerulopatija, tubulopatija, itd.) i dali prednost specifičnoj grupi gena za analizu. Ovaj pristup je ograničio broj analiziranih gena, pojednostavljujući analize i smanjivši broj slučajnih nalaza. Tek kada je na kraju analitičkog polja sa relevantnim panelom(ima) genetski rezultat bio negativan i (i) klinički fenotip nije jasno naznačen ili (ii) preklapajući različite kategorije bolesti, genetska analiza je proširena na tzv. "puna lista bubrega ili kidneyome", super-panel koji se sastoji od svih gena uključenih u podpanele.

Kao prvi korak, definisali smo skup kriterijuma za interpretaciju NGS rezultata. Nakon izvođenja kliničkog sekvenciranja egzoma (CES) i usklađivanja podataka, određen je niz analiza za filtriranje u relevantnim varijantama. Konkretno, na osnovu kliničke sumnje, identifikovane varijante su filtrirane na osnovu in silico lista gena, specifičnih za različite makro-kategorije bolesti. Sinonimne varijante koje ne utječu na mehanizam spajanja ili intronične varijante koje se ne mapiraju unutar regije spajanja su isključene, uzimajući u obzir samo nesinonimne, besmislene, pomak okvira i varijante koje utječu na spajanje. Uključeno je deset, samo rijetkih varijanti (učestalost manja od 1% u populaciji) i varijanti sa frekvencijom alela kod pacijenta od najmanje 0.2 i pokrivenošću od najmanje 20 čitanja. Preostale varijante su označene i dalje kurirane na osnovu (i) načina nasljeđivanja, (ii) konzervacije nukleotida, (iii) utjecaja proteina, korištenja različitih baza podataka za provjeru rezultata i (iv) literature, ako postoji. U ovom trenutku, filtrirane varijante su navedene u takozvanom "tehničkom izvještaju". Tehnički izvještaj je interpretirao medicinski genetičar kako bi se proizveo konačni genetski izvještaj za pacijenta i njegovu/njenu porodicu. Tokom genetskih konsultacija, predložene su studije porodične segregacije da (i) potvrde varijante u probandu i (ii) da uključe/isključe ne-uzročne varijante na osnovu njihove segregacije u porodici (slika 1).

Usvajanjem ovih kriterija uspjeli smo definirati tri različite kategorije genetskih izvještaja. Prvo, "konkluzivni izvještaj" koji je uključivao patogene (C5) i vjerovatno patogene (C4) varijante. Izvještaji o varijantama nepoznatog značaja (C3) smatrani su konačnim samo ako su u potpunosti kompatibilni s kliničkom slikom i ako su studije porodične segregacije potvrdile njihovu moguću ulogu. Drugo, "nesiguran izvještaj" koji je uključivao varijante C3 identificirane od strane CES-a koje još nisu ili nisu mogle biti potvrđene u kontekstu studija porodične segregacije ili C4/C5 varijante koje nisu bile u potpunosti u skladu s kliničkim fenotipom. Treće, "neuvjerljivi izvještaj" koji je uključivao (i) negativnu CES analizu, što znači da NGS nije identificirao nijednu varijantu; (ii) pojedinačne varijante recesivnih gena; i (iii) C3 varijante koje nisu u skladu s kliničkim fenotipom, identificirane kada je analiza proširena na svegene povezane s bubrežnom bolešću(Sl. 1).

Glavne karakteristike regrutovane kohorte

Ova studija opisuje kohortu od 191 pedijatrijskog pacijenta (0-18 godina) koje je Jedinica za pedijatrijsku nefrologiju uzastopno upućivala na genetsku analizu od novembra 2018. do maja 2022., s prosječno 50 novih pacijenata koji se upisuju svake godine . Kriterijumi za genetsko testiranje bili su (i) nefropatija povezana s pozitivnom porodičnom anamnezom bolesti bubrega ili (ii) klinička sumnja na monogeno stanje ili (iii) potreba da se isključi monogeno stanje (kao u slučaju nefrotskih sindroma, gdje se razlikuje monogene u odnosu na nemonogene bolesti je klinički značajno za prognozu i liječenje).

Kohorta je podijeljena na osnovu kliničke sumnje, s obzirom na 6 različitih makro-kategorija bolesti: kongenitalne abnormalnosti bubrega i urinarnog trakta (CAKUT; n=34), ciliopatije (n=39), glomerulopatije (n=62), nefrolitijaza (n=22), tauopatije (n=20) i druge bolesti koje su uključivale i sindromske fenotipove (n=14). Izuzev CAKUT-a i tubulopatija koje su pokazale podjednaku distribuciju između žena i muškaraca, u svim ostalim kategorijama postojala je prevalencija muških ispitanika (Sl. 2a). Kada se posmatra dob zapošljavanja, nije istaknuta značajna različita distribucija među različitim grupama, s prosječnom dobi u rasponu od 6,7 do 10 godina u "Drugim bolestima" i glomerulopatijama, respektivno. Međutim, gledajući srednju dob, CAKUT bolesti su pokazale najnižu vrijednost (4,6 godina), u skladu s kongenitalnim fenotipom. Sa stanovišta etničke pripadnosti, nezavisno od razmatrane makro-kategorije bolesti, većina pacijenata je bila Evropljanin, a zatim Afrikanci, sa samo nekoliko pacijenata iz Azije, Latinske Amerike ili ukrštenih (Slika 2b). Među kohortom, samo 8 pacijenata imalo je roditelje u srodstvu.

Slika 1. Cijev analize genetičkih podataka i kriteriji za uključivanje varijanti. Šematski prikaz analitičkog cevovoda usvojenog za identifikaciju varijanti i određivanje prioriteta, uključujući sve kriterijume filtriranja i filtriranja. Rezultirajuće varijante uključene su u konačni genetski izvještaj. Kad god je bilo moguće, rađene su studije validacije varijanti i porodične segregacije. Genetski izvještaji su klasifikovani kao konačni, nesigurni ili neuvjerljivi na osnovu navedenih kriterija. Na osnovu ove klasifikacije izračunata je dijagnostička stopa našeg procesa sekvenciranja sljedeće generacije (NGS). 1 KG: 1000 baza podataka genoma; Alt fr: promijenjena frekvencija; C3: varijanta nepoznatog značaja; C4: vjerovatna patogena varijanta; C5: patogena varijanta; AR: autosomno recesivan

Konačno, kada se uzme u obzir porodična anamneza za bolesti bubrega, uzimajući u obzir muške i ženske subjekte odvojeno, evidentna je heterogenost u distribuciji između pozitivnih i negativnih slučajeva s obzirom na različite kategorije bolesti. Sve u svemu, većina regrutovane kohorte i nezavisno od pola nije bila okarakterisana pozitivnom porodičnom anamnezom, kao što je pokazano za CAKUT, glomerulopatije, tauopatije i druge poremećaje bubrega. Međutim, kod ciliopatija i nefrolitijaze, značajan procenat slučajeva je imao pozitivnu porodičnu istoriju sa različitom distribucijom između žena i muškaraca (13 slučajeva od 22 za ciliopatije i 5 od 12 za nefrolitijazu; slika 2c).

Sa kliničkog stanovišta, kohorta je bila prilično heterogena sa uključenim različitim primarnim bolestima (slika 2d). Među njima, najčešće kliničke sumnje bile su policistična bolest bubrega (n=27), CAKUT (n=25), nefrotski sindrom (n=19), fokalna segmentalna glomeruloskleroza (FSGS; n =14) i Alportov sindrom (n=13; slika 2d).

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA INFEKCIJU BUBREGA