Brzo i spontano uklanjanje Plasmodium Falciparum nakon porođaja povezano je sa izbacivanjem placente

Parasitemijom kod trudnica sa zaštitnim imunitetom na malariju Plasmodium falciparum često dominiraju VAR2CSA-pozitivni inficirani eritrociti (IE). VAR2CSA posreduje sekvestraciju IE u placenti. Pretpostavili smo da je prethodno uočeno spontano postporođajno uklanjanje parazitemije kod takvih žena povezano sa izbacivanjem placente, što uklanja fokus sekvestracije VAR2CSA-pozitivnih IE. Procijenili smo parazitemije i transkripciju gena prije i ubrzo nakon porođaja kod 17 žena iz Gane. Nagli pad parazitemije nakon porođaja bio je praćen selektivnim smanjenjem transkripcije gena koji kodira VAR2CSA. Naši nalazi pružaju mehaničko objašnjenje za ranije opažanje.

Ključne riječi.

stečeni imunitet; VAR2CSA; pfEMP1; placentalna malarija; Plasmodium falciparum; trudnoća; var geni; varijantno-specifičan imunitet.

Stanovnici područja sa stabilnom transmisijom parazita Plasmodium falciparum stiču značajan zaštitni imunitet na malariju u djetinjstvu, što je prikazano u referenci [1]. Protein 1 membrane eritrocita P. falciparum (PfEMP1) je familija parazitskih antigena, kodiranih sa približno 60 var gena po genomu, i posreduje sekvestraciju zrelih inficiranih eritrocita (IE) do vaskularnih receptora domaćina, pregledano u referenci [2]. Uprkos važnosti PfEMP1 u stečenom zaštitnom imunitetu, žene u takvim područjima ipak postaju vrlo osjetljive na malariju tokom trudnoće. Ovo je povezano sa infekcijama parazitima koji eksprimiraju PfEMP1 tipa VAR2CSA, što dovodi do akumulacije IE u interviloznom prostoru, uzrokujući placentnu malariju [2, 3].

VAR2CSA posreduje adheziju IE na nisko-sulfatni hondroitin sulfat (CSA), receptor domaćina koji je normalno ograničen na placentu [4]. Receptorno-specifična sekvestracija IE je važna strategija preživljavanja parazita, jer sprečava uništavanje slezene zrelih IE [2]. VAR2CSA-pozitivne IE su stoga u velikom nedostatku preživljavanja kod netrudnih domaćina, a VAR2CSA-specifični imunoglobulin G (IgG) se ne stječe prije prve trudnoće [2, 3]. Ovo objašnjava visoku podložnost trudnica (a posebno primigravidae) na malariju P. falciparum, čak i u područjima sa stabilnom transmisijom parazita, gdje se značajan zaštitni imunitet stječe mnogo prije navršenih godina rađanja [3]. Infekcijama P. falciparum kod trudnica zaista često dominiraju paraziti koji eksprimiraju VAR2CSA [5], iako se često nalaze i paraziti koji eksprimiraju druge tipove PfEMP1 (i koji se vjerovatno sekvestriraju izvan placente) [6]. Na osnovu toga predlažemo da se mogu definirati 2 fundamentalno različite vrste malarije kod trudnica. Jedna je placentna malarija, koju uzrokuju paraziti koji eksprimiraju VAR2CSA i koja se javlja uglavnom kod žena niskog pariteta bez značajnog VAR2CSA-specifičnog zaštitnog imuniteta. Drugi tip je malarija uzrokovana parazitima koji eksprimiraju druge tipove PfEMP1 i gdje se IE sekvestriraju u neplacentarnim tkivima. Ovaj drugi tip nije ograničen na trudnice i može se pojaviti kod žena bilo kojeg pariteta. To jednostavno odražava nedostatke u varijantnom (uglavnom PfEMP1) specifičnom imunitetu općenito [7].

Imajući ovo na umu, pretpostavili smo da raniji izvještaji o spontanom rješavanju parazitemije P. falciparum kod trudnica u Africi u roku od nekoliko dana nakon porođaja [8, 9] odražavaju iznenadni nestanak fokusa sekvestracije VAR2CSA-pozitivnih IE kao posteljica se izbaci tokom porođaja.

METODE

Mjesto istraživanja i učesnici

Studija je provedena u 5 zdravstvenih ustanova (Abura Dunkwa, Biriwa, Mankessim, Moree i Saltpond) u središnjoj regiji Gane. Prenos P. falciparum u istraživanom području je stabilan, ali sa značajnim sezonskim varijacijama.

Kratkoročne trudnice, koje su pismeno pristale da učestvuju u studiji nakon što su dobile usmene i pismene informacije o njenim ciljevima, regrutovane su između novembra 2020. i februara 2021. Žene sa bilo kojim oblikom komplikacija u trudnoći bile su isključene iz učešća. Iako je većina žena primala povremeni preventivni tretman kao dio trenutne politike prenatalne nege u Gani (dopunska tabela 1), nijedna od njih nije primila nikakav oblik antimalarijskog tretmana za vrijeme trajanja studije (tj. od neposredno prije porođaja do kraja njihovo učešće nekoliko dana kasnije). Studiju je odobrio institucionalni odbor za reviziju na Noguchi Memorijalnom institutu za medicinska istraživanja (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) i etički odbor za istraživanje zdravstvene službe Gane (GHS-ERC 005/08/20).

Detekcija i kvantifikacija infekcije P. falciparum

Infekcija parazitima P. falciparum određena je brzim dijagnostičkim testom, mikroskopijom razmaza krvi obojenih po Giemsi i kvantitativnom polimeraznom lančanom reakcijom (qPCR) u suštini kako je prethodno opisano [10, 11], koristeći sakupljene uzorke periferne krvi. DNK ekstrahirana iz šest 10- puta razrijeđenja in vitro kulture P. falciparum IT4 u stadijumu prstena na 1 posto parazitemije korištena je za uspostavljanje standardne krive koja omogućava qPCR kvantifikaciju parazitemije.

Analiza transkripcije var gena

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 stepena od očekivane vrijednosti. Obilje transkripta izračunato je korištenjem 2-ΔCt, gdje je srednja vrijednost ΔCt=srednja vrijednost para prajmera Ctvar − srednja vrijednost Ctendogene kontrole.

Statistička analiza

Povezanost između var2csa transkripcije i kliničkih varijabli testirana je korelacijom Spearmanovog ranga s korekcijom za višestruko testiranje. Korelacija između parazitemija otkrivenih mikroskopski i PCR-om procijenjena je Pearsonovim testom korelacije produkt-moment. Podaci dobijeni u različitim vremenskim tačkama upoređeni su analizom ponovljenih mjerenja varijanse (RM-ANOVA) ili RM-ANOVA na rangovima (RM-ANOVA-R), prema potrebi, nakon čega je uslijedilo post hoc testiranje za razlike u paru. Za analizu podataka i P vrijednosti korišten je softver SigmaPlot verzija 14 (Systat Inc).<.05 were considered significant.

REZULTATI

Učesnici studija

Ukupno 377 žena koje su pristale bile su testirane na infekciju P. falciparum tokom porođaja. Od toga, 15 (4.0 posto) je bilo parazitsko pozitivno mikroskopijom perifernog razmaza krvi iz prsta, 24 (6,4 posto) brzim dijagnostičkim testom, a 50 (13,3 posto) PCR-om. Na osnovu ovih rezultata, 17 žena pozitivnih na brzi dijagnostički test je uključeno i odabrano za praćenje 8-16 sati nakon porođaja, 24-48 sati nakon porođaja i 48-72 sata nakon porođaja. Kliničke informacije učesnika studije sažete su u Dodatnoj tabeli 1. Nije bilo statistički značajne povezanosti između udjela parazita koji transkribuju var2csa i bilo koje od navedenih kliničkih varijabli.

Postporođajno uklanjanje parazitemije

U vrijeme porođaja, svi sudionici studije su bili parazitski na osnovu razmaza krvi i/ili qPCR (dodatna tabela 1). Do 8 do 16 sati nakon porođaja, mikroskopski uočljiva parazitemija je spontano opala (tj. bez terapijske intervencije) kod 14/17 žena (Slika 1A). Do 24-48 sati nakon porođaja, parazitmije su dodatno opale i bile su vrlo niske ili se nisu mogle detektirati kod većine žena (P=.03 u poređenju sa predporođajem, Friedman RM-ANOVA-R). Još 24 sata kasnije, sve žene osim 1 bile su bez uočljive parazitemije (P=.005 u poređenju sa predporođajem, RM-ANOVA-R). S obzirom na parazitemije otkrivene PCR-om (Slika 1B), postporođajne parazitemije su bile značajno niže za 24–48 sati i 48–72 sata od preporođaja (P < .001, RM-ANOVA-R). Nivoi su također bili značajno niži 48-72 sata nakon porođaja nego 8-16 sati nakon porođaja (P < .001, RM-ANOVA-R). Parazitemije procijenjene mikroskopijom i qPCR značajno su korelirale (P < .001). Ovi podaci potvrđuju prethodne izvještaje o brzom i spontanom postporođajnom uklanjanju parazitemije P. falciparum kod žena koje žive u područjima sa stabilnom transmisijom ovog parazita [8, 9].

Parazitska transkripcija var gena

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90 posto ukupne var transkripcije) u 9/17 žena i var2csa transkripcija može se otkriti kod svih (slika 2 i dodatna slika 1). Transkripcija var gena koji nisu povezani sa placentnom malarijom je tako otkrivena (pored var2csa) kod svih učesnika pre porođaja i dominirala je kod nekih žena, u skladu sa prethodnim zapažanjima [6].

Udio var2csa transkripata se smanjio tokom praćenja nakon porođaja kod svih žena (slika 2 i dodatna slika 1), paralelno sa smanjenjem parazitemija (slika 1). Stoga je došlo do značajnog pomaka od transkripcije var2csa prije porođaja prema transkripciji drugih gena var nakon porođaja. Jedini izuzeci (među onim ženama kod kojih su bili dostupni podaci o postporođajnoj transkripciji) bile su učesnice B213, S003, S001 i B201 (dodatna slika 1). Međutim, na osnovu zapažanja da su postporođajne parazitemije također značajno opadale među tim ženama (Slika 1), smatramo vjerojatnim da bi se odgovarajući pomak od transkripcije var2csa vidio da su podaci iz kasnijih vremenskih tačaka bili dostupni. Sve u svemu, podaci su u potpunosti u skladu sa selektivnim nestankom VAR2CSA-pozitivnih IE kao što smo pretpostavili.

DISKUSIJA

PfEMP1 je porodica proteina koju intraeritrocitni paraziti P. falciparum izvoze na površinu IE, gdje funkcionišu kao adhezioni ligandi za različite vaskularne receptore domaćina [2]. Ovi ligandi su kodirani klonskom varijantnom familijom gena var sa oko 60 članova po genomu haploidnog parazita. Geni se transkribiraju i prevode na međusobno isključiv način, osiguravajući da se samo jedan PfEMP1 eksprimira na površini IE u bilo kojem trenutku. Međutim, svaki parazit ima potencijal da se prebaci između svojih različitih var gena, omogućavajući promjene u specifičnosti adhezije IE i antigenskim svojstvima [2].

PfEMP1 proteini se mogu grupisati i podgrupisati prema skupu strukturnih kriterijuma, koji utiču na njihove funkcionalne karakteristike [2]. Dakle, grupa A PfEMP1 (kodirana sa desetak var gena po genomu) posreduje adheziju IE na receptore domaćina kao što su EPCR i ICAM-1, te je uključen u patogenezu teške malarije u djetinjstvu općenito i cerebralne malarije posebno [2]. Nasuprot tome, čini se da je transkripcija gena koji pripadaju grupi B i C povezana s nekomplikovanom malarijom i asimptomatskim infekcijama. Konačno, PfEMP1 tipa VAR2CSA, kodiran sa samo jednim ili nekoliko gena var2csa po genomu parazita, funkcionalno je i antigenski potpuno različit od svih ostalih PfEMP1, i snažno je impliciran u patogenezi, kao i u stečenom imunitetu na placentni malarija [2, 3, 13].

Nadalje, većina dostupnih dokaza ukazuje na VAR2CSA kao na glavni i vjerovatno jedini bona fide CSA ligand. Konačno, ranije je pokazano da periferna parazitemija u trudnica s doživotnom izloženošću P. falciparum uključuje, i njome često dominiraju IE koji su VAR2CSA-pozitivni i imaju opći karakterističan fenotip placentalne infekcije P. falciparum [5, 13– 15]. Na osnovu toga, pretpostavili smo da je najuvjerljivije objašnjenje za spontano uklanjanje parazitemije kod trudnica u roku od nekoliko dana nakon porođaja [8, 9] selektivno uništavanje slezene VAR2CSA-pozitivnih IE nakon izbacivanja placente tokom porođaja, što efikasno uklanja njihov srodni adhezioni receptor.

Ovdje predstavljeni rezultati potvrđuju ranije objavljeno [8, 9] brzo postporođajno uklanjanje periferne parazitemije P. falciparum (Slika 1). Oni nadalje podržavaju zapažanja da periferna parazitemija u afričkih trudnica uključuje, i često dominira, parazite koji transkribuju var2- csa [6, 15] (Slika 2 i Dodatna slika 1). Najvažnije, međutim, naši podaci proširuju ova ranija zapažanja pružajući prvi put uvjerljive dokaze za mehaničko objašnjenje brzog postporođajnog uklanjanja perifernih parazita kod žena s prirodno stečenim imunitetom na malariju P. falciparum. Osim brojčano vrlo male, i samo granično značajne, razlike u transkripciji var grupe A1 (dodatna slika 2), jedina veća i statistički značajna promjena u transkripciji var gena nakon porođaja bila je smanjena relativna transkripcija var2csa (slika 2B i dopunski Slika 2).

Naša studija ima ograničenja. Veličina uzorka je mala. To je uglavnom zato što je uspješna primjena intermitentnog preventivnog liječenja malarije kod trudnica, što je učinilo placentnu malariju mnogo manje rasprostranjenom i zahtijevalo skrining mnogih žena kako bi se pronašle kvalifikovane učesnice. Nadalje, ograničeni kapaciteti na našem mjestu istraživanja spriječili su direktnu procjenu specifičnosti adhezijskih receptora sakupljenih IE ili njihovog imunološkog fenotipa. Ipak, trenutni dokazi i raniji nalazi se neprimjetno kombinuju.

U zaključku, predstavili smo dokaze da nagli nestanak fokusa sekvestracije VAR2CSA-pozitivnih IE nakon izbacivanja placente značajno doprinosi brzom i spontanom postporođajnom uklanjanju parazitemije P. falciparum kod žena koje su prirodno bile izložene ovim parazitima. Paraziti koji transkribuju druge var gene i pokazuju PfEMP1 ne-VAR2CSA tipa na površini IE često nisu u stanju da napreduju i izazivaju bolesti kod odraslih u endemskim područjima, zbog zaštitnog PfEMP1-specifičnog imuniteta na malariju stečenog u djetinjstvu [2] . Kontinuirano preživljavanje ne-VAR2CSA IE nakon porođaja može biti dodatno ugroženo fiziološkim procesima povezanim s porođajem, kao što su proinflamatorni imuni odgovori. Konačno, neotkriveni unos antimalarijskih lijekova neposredno prije porođaja mogao bi doprinijeti. Bez obzira na razlog, parazitemija je značajno opala nakon porođaja kod nekih žena, gdje su var2csa transkribirajući paraziti činili samo manjinu od parazitemije u preporođaju, i ovaj nalaz zaslužuje dalje istraživanje. Naša studija podupire ključnu ulogu PfEMP1 u stečenom imunitetu na malariju općenito, a posebno VAR2CSA u patogenezi i imunitetu placentne malarije.

Dodatni podaci

Dodatni materijali dostupni su u The Journal of Infectious Diseases online. Sastojeći se od podataka koje su autori dali u korist čitaoca, objavljeni materijali nisu kopirani i isključivo su odgovornost autora, tako da pitanja ili komentare treba uputiti autoru koji odgovara.

Bilješke

Doprinosi autora.

NGA, MPQ, MFO i LH doprinijeli su koncepciji i dizajnu studije. NGA je izvršio prikupljanje uzoraka. NGA, MPQ i LH su izvršili analizu podataka. NGA, MPQ i LH su pripremili rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačnu verziju rukopisa.

Priznanja.

Zahvaljujemo se svim ženama koje su pristale da učestvuju u našem istraživanju. Zahvaljujemo se i svim babicama, doktorima, pomoćnicima ljekara i medicinskim sestrama u raznim zdravstvenim ustanovama na pomoći u prikupljanju uzoraka.

Odricanje od odgovornosti.

Finanseri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju i analizi podataka, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa. Finansiranje za plaćanje troškova publikacije otvorenog pristupa za ovaj članak obezbijedila je Danida.

Finansijska podrška.

Ovaj rad je podržala Danida (broj granta 17-02-KU za MAVARECA-II projekat), uključujući doktorat na NGA Izvršna istraživačka agencija Evropske komisije podržala je MPQ (broj granta 101028915, Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship 2020. , PAMSEQ projekat).

Potencijalni sukobi interesa.

Svi autori: Nema prijavljenih sukoba interesa. Svi autori su predali ICMJE obrazac za otkrivanje potencijalnog sukoba interesa. Razotkriveni su sukobi koje uredništvo smatra relevantnim za sadržaj rukopisa.

Reference