Zaštitni efekat Herba Cistanches na miotoksičnost izazvanu statinima in Vitro
Mar 24, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
Institut za kinesku medicinu, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Shatin, Nove teritorije, Hong Kong
b Državna ključna laboratorija za fitohemiju i biljne resurse u Zapadnoj Kini, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Shatin, Nove teritorije, Hong Kong
c Odsjek za kliničku farmakologiju, Odsjek za medicinu i terapiju, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Shatin, Nove teritorije, Hong Kong
sažetak:
Etnofarmakološka relevantnost: HerbaCistanches(HC,Cistanchedeserticola, iliCistanchetubulosa) je kineska biljka koja se tradicionalno koristi za probleme s mišićima. Prethodne studije su pokazale da ekstrakt HC može smanjiti oštećenje mišića i poboljšati skladištenje ATP-a kod štakora nakon vježbanja. Međutim, njegov učinak na mišićnu toksičnost izazvanu statinima nikada nije istražen.
Cilj:Cilj ove studije bio je utvrditi može li vodeni ekstrakt HC (HCE) spriječiti toksičnost izazvanu simvastatinom u ćelijama skeletnih mišića štakora L6 i da li je verbaskozid glavni bioaktivni sastojak koji doprinosi efektima.
Materijali i metode:MTT je izveden da bi se odredili efekti HCE ({{0}}–2000 mg/ml) ili verbaskozida (0–160 mM) na L6 ćelije tretirane simvastatinom (10 mM). Aneksin V-FITC/PI test apoptoze i analiza kaspaze 3 su obavljeni kako bi se odredila zaštitna uloga HCE na ćelijsku smrt izazvanu simvastatinom i da bi se procijenilo da li je HCE pokazao svoj zaštitni efekat kroz put kaspaze. Proizvodnja ATP-a je izmjerena kako bi se ispitalo može li HCE spriječiti smanjenje proizvodnje ATP-a in vitro izazvano simvastatinom.
Rezultati:Simvastatin značajno povećava apoptotičku smrt ćelija u L6 ćelijama. HCE je značajno izvršio dozno-zavisno smanjenje apoptotičkih ćelija izazvanih simvastatinom, moguće putem kaspaze-3 puta. Simvastatin je smanjio proizvodnju ATP-a u L6 stanicama, što je HCE spriječio ovisno o dozi. Postojao je samo trend, ali ne i značajan učinak (osim pri visokim dozama) verbaskozida na zaštitu od mišićne toksičnosti izazvane simvastatinom.
Zaključci:Zaključno, po prvi put smo pokazali da HCE može ispoljiti zaštitni efekat ovisan o dozi na toksičnost izazvanu simvastatinom in vitro, što je malo verovatno zbog prisustva verbaskozida. Naša studija je sugerirala potencijalnu upotrebu HC u situaciji mišićne toksičnosti izazvane simvastatinom.
Ključne riječi:HerbaCistanches, statinski holesterol, hiperlipidemija, mišićna toksičnost, verbaskozid, kaspaza-3
1. Uvod
Inhibitori HMG-CoA reduktaze (statini), kao najprodavanija klasa lijekova na recept u svijetu u istoriji, dobro je dokumentirano da su korisni za pacijente oba spola u različitim životnim dobima s umjerenim i visokim rizikom od kardiovaskularnih bolesti (KVB) (Golomb i Evans, 2008). Zatim su razvijeni i klinički odobreni različiti statini, uključujući pravastatin, atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pitavastatin, rosuvastatin i simvastatin. Općenito, svi statini djeluju tako što inhibiraju redukciju HMG-CoA u mevalonsku kiselinu tokom rane faze mevalonatnog puta kako bi se smanjila proizvodnja kolesterola (Kromer i Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003). Iako se statini obično dobro podnose, jedan od najvažnijih i dobro poznatih kliničkih nuspojava je toksičnost skeletnih mišića (rabdomioliza) (Kobayashi et al., 2008). Abnormalnosti skeletnih mišića mogu varirati od benigne mijalgije do teške miopatije. Dok se predlaže niz mehanizama koji bi mogli biti odgovorni za štetne efekte statina na mišiće, vjeruje se da mitohondrijski mehanizmi igraju važnu ulogu (Golomb i Evans, 2008). Mevalonat nije samo prekursor holesterola, već i drugih jedinjenja uključujući selenoproteine, dolihol i ubikinon (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009). Sposobnost statina da inhibiraju mevalonat bi stoga također inhibirala proizvodnju selenoproteina kao što je glutation peroksidaza (GPx), koji su važni enzimi u održavanju antioksidativnog odbrambenog mehanizma (Kromer i Moosmann, 2009). Statini također mogu dovesti do iscrpljivanja ubikinona, uzrokujući smanjenje potrošnje kisika i sinteze ATP-a (Beltowski i sar., 2009.). Nadalje, sve veće in vitro i in vivo studije su pokazale da statin također može djelovati direktno na mitohondrije tkiva kako bi inducirao prelaz propusnosti membrane zavisan od Ca2 (MPT) na način ovisan o dozi (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006. ). Također je povezan s povećanim reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) i mitohondrijalnim oksidativnim stresom, što dovodi do smrti stanica i stoga doprinosi ozljedama jetre i mišića (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006).
HerbaCistanches, cijela osušena biljka Cistanche deserticola YC Ma, ili Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (porodica Orobanchaceae), su parazitske biljke koje pretežno rastu u pustinjskim područjima sjeverne i sjeveroistočne Kine (Siu i Ko, 2010).HerbaCistanchesje kineska tonik biljka koja osnažuje Yang koja se prvenstveno koristi za liječenje nedostatka bubrega sa simptomima kao što su impotencija, neplodnost, prerana ejakulacija. Teška i zamorna priroda biljke također vlaži crijeva i pomaže u ublažavanju zatvora. To je također kineska biljka koja se tradicionalno propisuje pacijentima za bolove u slabinama i kolenima i biljka je koja se obično koristi u kineskim formulacijama za liječenje mišićnih problema (Siu i Ko, 2010; Xiong i dr., 1998). Zanimljivo je da je to također u skladu sa modernim naučnim studijama koje su pokazale djelovanje protiv umora ekstrakta bogatog polisaharidima i feniletanoidima.HerbaCistancheskod pacova nakon vježbanja smanjenjem oštećenja mišića i poboljšanjem skladištenja ATP-a (Cai et al., 2010). Nedavni rad je pokazao da metanolni ekstrakt Herba Cistanches može poboljšati stvaranje mitohondrijalnog ATP-a (Leung i Ko, 2008). Siu i Ko (2010) su to pokazaliHerbaCistanchestakođe može poboljšati status mitohondrijalnog glutationa posredovanjem nivoa sinteze glutationa i GPx-a, štiteći tako tkiva od oksidativnog stresa u srcima pacova. To su pokazali i Siu i Ko (2010).HerbaCistanchesmože smanjiti sadržaj mitohondrijalnog Ca2, čime se smanjuje MPT zavisan od Ca2. Nadalje,HerbaCistanchesje također dokazano da je snažan antioksidans i hvatač slobodnih radikala u različitim organima, smanjujući oksidativni stres i aktivnosti ROS in vivo studija (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011). Još zanimljivije, u pokušaju da se odredi aktivna frakcija koja doprinosi djelovanju protiv umoraHerbaCistanches, utvrđeno je da je verbaskozid glavni sastojak u aktivnoj frakciji (Cai et al., 2010). Takođe je dokazano da verbaskozid smanjuje umor mišića kod krastača, vjerovatno zbog svojih antioksidativnih aktivnosti (Liao et al., 1999), što sugerira da bi verbaskozid mogao biti bioaktivna komponenta koja doprinosi blagotvornom djelovanju Herba Cistanches.
Cilj ove studije bio je utvrditi može li upotreba biljnog vodenog ekstrakta Cistanchesa (HCE) smanjiti mišićnu toksičnost izazvanu simvastatinom in vitro. Pretpostavlja se da bi upotreba HCE mogla ispraviti nuspojave mišićne toksičnosti uzrokovane simvastatinom. Također se pokušalo utvrditi da li su korisni efekti odHerbaCistanchesse pripisuju prisustvu verbaskozida.
2. Materijali i metode
2.1. Provjera autentičnosti i priprema biljnih materijala
Sirovi biljni materijal odHerbaCistanchesje kupljen od renomiranog dobavljača u Guangzhouu, Kina.HerbaCistanchesje hemijski potvrđena pomoću tankoslojne hromatografije (TLC) u skladu sa Kineskom farmakopejom (CP), 2010, sa verbaskozidom i ehinakozidom kao hemijskim markerima (podaci nisu prikazani). Nakon hemijske autentifikacije, uzorak herbarskog vaučeraHerbaCistanchesdeponovan je u Muzeju Instituta kineske medicine na Kineskom univerzitetu u Hong Kongu (CUHK), sa uzorkom vaučera broj 2014–3434.
Ukratko, 1 kg sirovog bilja je natopljen 1 h, nakon čega je uslijedila ekstrakcija dva puta zagrijavanjem po 1 h pod refluksom na 100 stupnjeva uz korištenje 10 destilovane vode za svaku ekstrakciju. Vodeni ekstrakti (HCE) su sjedinjeni i filtrirani. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom na 60 stepeni. Koncentrirani ekstrakt je liofiliziran do suhog. Postotak prinosa bio je 50,1 posto w/w. Mala količina je korištena za određivanje količine verbaskozida i ehinakozida pomoću tečne hromatografije ultra-performanse (UPLC). Sav ekstrahovani prah je vakuumiran i čuvan do upotrebe.
2.2. UPLC analiza vodenog ekstrakta
UPLC analize su obavljene korišćenjem Waters Acquity Ultra Performance LC sistema (Waters, SAD). Svi rastvarači potrebni za UPLC analize nabavljeni su od Odsjeka za hemiju na Kineskom univerzitetu u Hong Kongu. Verbaskozid i ehinakozid su kupljeni od Nacionalnog instituta za kontrolu farmaceutskih i bioloških proizvoda, Kina. Otopina uzorka je ubrizgana u Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonu (10{{20}} 2,1 mm2 id, veličina čestica 1,7 mm) sa Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard predkolona ( 5-2.1 mm2 id, veličina čestica 1,7 mm). Svi rastvarači su prethodno filtrirani sa 0.45 mm Millipore filter diskom (Millipore) i degasirani. Gradijentno eluiranje je sprovedeno korišćenjem sledećih sistema rastvarača: mobilna faza A – acetonitril; mobilna faza B – dvostruko destilovana voda/mravlja kiselina (99,9/ 0.1; v/v). Eluiranje je izvedeno postupkom gradijenta kako slijedi: 0-5 min, 88 posto B; 5–10 min, od 88 posto B do 83 posto B. Korištena brzina protoka bila je 0,4 ml/min, a detekcija je izvedena na 331 nm u skladu sa CP (2010). Svaki uzorak (5 ul) je ubrizgan u kolonu nakon filtracije kroz filter disk od 0,2 mm. Identifikacija hemijskih markera je izvršena poređenjem vremena zadržavanja i UV apsorbancije nepoznatih pikova sa onima standarda. Kalibraciona kriva je nacrtana nizom koncentracija verbaskozida i ehinakozida (40, 20, 10, 5, 2,5 i 1,25 mg/ml) za kvantifikaciju. Kvantifikacija verbaskozida i ehinakozida u biljnom ekstraktu izvršena je u tri primjerka. Sistem je nadgledan kompjuterom opremljenim softverom Waters MassLynx za prikupljanje, integraciju i analizu podataka.
2.3. Ćelijska kultura
L6 ćelijska linija skeletnih mišića štakora kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, SAD). Ćelije su održavane na subkonfluentnoj gustini u Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (DMEM, ATCC, Manassas, VA, SAD) dopunjenom sa 10 posto v/v fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1 posto penicilina-streptomicina (P/S), i inkubirano na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2 i 95 posto zraka.
Da bi se odredili efekti HCE na mišićnu toksičnost izazvanu statinima, L6 ćelije su tretirane simvastatinom u količini od 10 μM tokom 48 sati da bi se izazvala toksičnost. HCE (u koncentracijama 0, 250, 500, 1000 i 2000 ug/ml) ili verbaskozid (u koncentracijama 0, 20, 40, 80 i 160 μM) dodani su kao zajednički tretman sa statinom kako bi se utvrdilo da li biljni ekstrakt mogao bi spriječiti toksičnost statina izazvanu u stanicama skeletnih mišića i da bi verbaskozid mogao imati slične zaštitne efekte kao biljni vodeni ekstrakt.
Zaštitni učinak ekstrakta Herba Cistanche na toksičnost izazvanu simvastatinom in vitro
2.4. In vitro citotoksičnost
L6 ćelije (1x105/buna) su zasijane u {{0}}ploče za kulturu ravnog dna (Iwaki, Japan) preko noći, nakon čega je uslijedio tretman sa 10 μM simvastatina, zajedno sa ili bez različitih doza HCE ( 0–2000 ug/ml) ili verbaskozid (0–160 μM), tokom 48 h. U kontrolne jažice dodan je običan medij (DMEM). Biljni ekstrakt i jedinjenje rastvoreni su u DMEM.
Nakon tretmana od 48 sati, podloga iz svih ćelija je odbačena i 30 ul 5 mg/ml 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ 8}}difenil-tetrazolijum bromid (MTT; Sigma, SAD) u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) je dodat u svaku jažicu i ploče su dalje inkubirane 3 h na 37 stepeni. Supernatant je zatim uklonjen i 100 ul DMSO je dodato u svaku jažicu da se rastvore ljubičasti kristali formazana (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. SAD). Apsorbancija svakog uzorka očitana je na 540 nm pomoću čitača mikroploča (Biotek μ-Quant, SAD). Rezultati su izraženi kao procenat apsorpcije MTT u odnosu na kontrolne ćelije.
2.5. Aneksin-V FITC/PI test bojenja
L6 ćelije (3 x 105/ bunar) liječeni su simvastatinom, zajedno sa ili bez različitih doza HCE ili verbaskozida. Ćelije su zatim sakupljene, isprane i obojene aneksin-V FITC kompletom u skladu sa protokolom proizvođača (Trevigen, MD, USA). Ukratko, ćelije su isprane dva puta sa 1 x puferom za vezivanje i kubirane u 100 ul rastvora za obeležavanje koji sadrži 1 ul aneksin-V FITC konjugata i 10 ul PI u mraku 15 minuta na sobnoj temperaturi. Fluorescencija uzoraka je detektovana protočnom citometrijom (Becton Dickinson FACSCanto II, SAD).
2.6. Analiza aktivnosti kaspaze 3
Aktivnost kaspaze 3 određena je fluorometrijskim, imunosorbentnim enzimskim testom (Sigma) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, L6 ćelije (3 105/jažici) tretirane simvastatinom, zajedno sa ili bez različitih doza HCE verbaskozida, lizirane su korištenjem pufera za lizu. Slobodni 7-amino-4-metilkumarin (AMC) generiran proteolitičkim cijepanjem supstrata od strane Caspase 3 izmjeren je i kvantificiran fluorometrijski sa talasnom dužinom ekscitacije na 360 nm, i talasnom dužinom emisije na 460 nm sa BMG FLUept platnom BMG. čitač (BMG LABTECH GmbH, Njemačka).
2.7. Cellular ATP test
L6 ćelije (3x105/ bunar) liječeni su simvastatinom, zajedno sa ili bez različitih doza HCE ili verbaskozida. Nakon tretmana, ćelije su sakupljene i sadržaj ATP-a je mjeren korištenjem komercijalno dostupnog kolorimetrijskog kompleta (Abcam, UK) mjerenjem sadržaja glicerol fosfata u liziranim ćelijama i očitavanjem na 570 nm pomoću čitača mikroploče (Biotek μ-Quant, SAD ). Mjerenje proizvodnje ATP-a izraženo je u procentima u odnosu na kontrolnu grupu.
2.8. Statistička analiza
Podaci su predstavljeni kao mean7SD, Prism 5 for Window (verzija 5.0c, GraphPad Software, Inc., USA) je korišten za statističku analizu. Značajne razlike među svim grupama procijenjene su jednosmjernom ANOVA-om, praćenom Bonferronijevim testom višestruke poređenja. Vjerovatnoća od po0.05 se smatra statistički značajnom.
3. Rezultati
3.1. UPLC analiza vodenog ekstrakta Herba Cistanches
Slika S1A je pokazala UPLC profil standardne mješavine koja sadrži ehinakozid i verbaskozid. Vremenske tačke zadržavanja svakog od ovih markera su upoređene sa UPLC profilomHerbaCistanchesvodeni ekstrakt (slika S1B). Količina ehinakozida i verbaskozida unutarHerbaCistanchesnađeno je da vodeni ekstrakt iznosi {{0}}.45% w/w i 0,085% w/w, respektivno.
3.2. Učinak HCE i verbaskozida na in vitro citotoksičnost simvastatina u ćelijama skeletnih mišića L6
Kao što je prikazano na slici 1A, simvastatin je izazvao značajnu citotoksičnost na L6 ćelije što se ogleda u značajnom smanjenju vitalnosti L6 ćelija pri 10 mM simvastatina. Liječenje HCE je dozno ovisno i značajno spriječilo citotoksičnost izazvanu simvastatinom pri dozama od 500, 1000 i 2000 mg/ml. Verbaskozid je pokazao trend poboljšanja održivosti L6 ćelija koje su istovremeno tretirane simvastatinom. Međutim, nijedna koncentracija nije postigla statističku značajnost (slika 1B).
Slika 1. Zaštitni efekat (a) HCE; i (b) verbaskozid na citotoksičnost izazvanu simvastatinom u L6 ćelijama. Vrijednosti predstavljaju srednja vrijednost7SD (n=3). Značajna razlika između samog liječenja simvastatinom i kontrolne grupe koja koristi Studentov t-test: ### po0.{{10}}01. Značajna razlika među svim grupama liječenim simvastatinom sa ili bez HCE verbaskozida uz korištenje jednosmjerne ANOVA: ** po0,01,*** po0,001.
3.3. Učinak HCE i verbaskozida na ćelijsku smrt uzrokovanu simvastatinom u ćelijama skeletnih mišića L6
Da bi se ispitao način stanične smrti izazvane simvastatinom i odredila zaštitna uloga HCE ili verbaskozida na ćelijsku smrt izazvanu simvastatinom, udio apoptotičkih ćelija je detektovan bojenjem propidijum jodidom (PI). Rezultati su pokazali da je simvastatin inducirao značajno povećanje udjela ranih apoptotičkih stanica (Annexin V-FITC pozitivne i PI negativne, Q4–2), i kasnih apoptotičkih/mrtvih ćelija (Annexin V-FITC pozitivne i PI-pozitivne, Q2– 2) u poređenju sa kontrolnom grupom. Ko-tretman sa HCE smanjio je udio ranih apoptotičkih i kasnih apoptotičkih/mrtvih ćelija na način ovisan o dozi do 1000 mg/ml (slika 2A). Ovaj zaštitni efekat je takođe primećen u grupama koje su uzimale verbaskozid. Međutim, nijedna od testiranih koncentracija nije postigla statističku značajnost (slika 2B).
Slika 2. Učinak simvastatina sa ili bez HCE ili ko-tretmana verbaskozidom na eksternalizaciju fosfatidilserina u L6 ćelijama. Ćelije su obojene Aneksinom-V FITC i I i otkrivene protočnom citometrijom
3.4. Učinak HCE i verbaskozida na aktivnost kaspaze 3 u ćelijama skeletnih mišića L6 tretiranih simvastatinom
Kao što je prikazano na slici 3A, 10 mM simvastatina značajno inducira aktivnost kaspaze 3 u ćelijama L6, što sugeriše da je simvastatin inducirao apoptozu u L6 ćelijama kroz kaspaznu kaskadu. Međutim, u L6 stanicama koje su istovremeno tretirane simvastatinom i HCE, HCE je ovisno o dozi i značajno smanjio aktivnost kaspaze 3, što ukazuje na sposobnost HCE da spriječi apoptozu izazvanu simvastatinom kroz kaspaznu kaskadu. S druge strane, iako je verbaskozid također pokazao trend smanjenja povećanja aktivnosti enzima kaspaze 3 izazvanog simvastatinom, samo je koncentracija od 160 mM dostigla statistički značaj (slika 3B).
Slika 3. Zaštitni efekat (a) HCE; i (b) verbaskozid na enzimsku aktivnost kaspaze 3 izazvane simvastatinom u L6 ćelijama. Vrijednosti predstavljaju srednja vrijednost 7SD (n=3–5). Značajna razlika između liječenja samo simvastatinom i kontrolnih grupa koje koriste Studentov t-test: ###po0.001. Značajna razlika među svim grupama liječenim simvastatinom sa ili bez HCE ili verbaskozidnog zajedničkog liječenja korištenjem jednosmjerne ANOVA: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001.
3.5. Učinak HCE na smanjenje proizvodnje ATP-a u ćelijama skeletnih mišića L6 izazvano simvastatinom
Simvastatin (10 mM) značajno je smanjio proizvodnju ATP-a u L6 ćelijama za oko 60 procenata u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 4A). HCE ko-tretman ovisno o dozi smanjio je smanjenje proizvodnje ATP-a u stanicama tretiranim simvastatinom, od kojih su samo koncentracije od 500, 1000 i 2000 mg/ml dostigle statistički značaj. S druge strane, iako je verbaskozid pokazao trend obnavljanja proizvodnje ATP-a na 50 mg/ml, nije dostigao statistički značaj (slika 4B).
Slika 4. Zaštitni efekat (a) HCE i (b) verbaskozida na smanjenje proizvodnje ATP-a u ćelijama L6 izazvano simvastatinom. Vrijednosti predstavljaju srednja vrijednost 7SD (n=3–5). Značajna razlika između liječenja samo simvastatinom i kontrolnih grupa koje koriste Studentov t-test: ###po0.001. Značajna razlika među svim grupama liječenim simvastatinom sa ili bez HCE ili ko-liječenja verbaskozidom korištenjem jednosmjerne ANOVA: *po0,05, **po0,01.
4. Diskusija
Sa sve većom prevalencijom kardiovaskularnih bolesti (KVB) i pacijenata s dijagnozom hiperholesterolemije u svijetu, upotreba statina je postala sve češća. Iako se statini općenito vrlo dobro podnose, ozljeda mišića je često prijavljivana nuspojava povezana s upotrebom statina koja se može akutno pojaviti nekoliko sedmica ili mjeseci nakon početka primjene lijeka (Fine, 2003). Mišićni simptomi mogu varirati od blagih problema, na primjer, bol, osjetljivost ili slabost sa ili bez povišenja kreatin kinaze (CK), do najtežeg stanja rabdomiolize (Armitage, 2007; Hu et al., 2012). Zbog pojave ovih nuspojava i činjenice da ne postoji efikasan tretman za mišićnu toksičnost izazvanu statinima, statini se i dalje nedovoljno koriste. U širokoj anketi na 10.409 francuskih subjekata koja je provedena putem telefonskog intervjua, 10 posto pacijenata koji su primali terapiju statinima prijavilo je mišićne simptome, od kojih je 30 posto ovih simptomatskih pacijenata rezultiralo prekidom liječenja (Rosenbaum et al., 2013.).
Po prvi put smo pokazali da vodeni ekstrakt odHerbaCistanches, uobičajena tradicionalna kineska biljka, mogla bi imati zaštitni učinak protiv toksičnosti izazvane simvastatinom in vitro u ćelijama skeletnih mišića L6, što ukazuje na potencijalHerbaCistanchesvodeni ekstrakt (HCE) zbog njegove zaštitne uloge toksičnost mišića uzrokovana statinima, što je poznata uobičajena nuspojava kod pacijenata koji uzimaju statine. Moćna sposobnost HCE da zaštiti od mišićne toksičnosti izazvane statinima bi stoga bila od velikog potencijala.
Prema tradicionalnoj teoriji u TCM-u, Yang je povezan s mitohondrijalnim energetskim metabolizmom u tijelu, a utvrđeno je da prepisivanje biljaka koje osnažuju Yang pojačava stvaranje mitohondrijalnog ATP-a (Ko i Leung, 2007.). Zanimljivo je da smo uočili smanjenje proizvodnje ATP-a u ćelijama L6 skeletnih mišića tretiranih simvastatinom, a ovo smanjenje proizvodnje ATP-a je značajno poboljšano uz HCE ko-tretman. U našoj studiji, koristeći L6 ćelije skeletnih mišića štakora, pokazali smo smanjenje vitalnosti stanica uzrokovano simvastatinom. Ovo smanjenje vitalnosti ćelija značajno je poboljšano uz zajednički tretmanHerbaCistanchesna način ovisan o dozi. Iako tačan mehanizam mišićne toksičnosti izazvane statinima nije u potpunosti razjašnjen, sugerirano je da je apoptoza zdravih skeletnih miocita izazvana statinima faktor koji uzrokuje miopatiju, najčešću nuspojavu koju doživljavaju korisnici statina (Dirks i Jones, 2006.) . U našoj studiji, uočili smo značajno povećanje apoptotičkih ćelija izazvanih simvastatinom, što je bilo povezano sa značajno povišenom aktivnošću kaspaze 3. Ovi podaci su također u skladu s prethodnim studijama, koje su pokazale da različiti statini mogu izazvati apoptozu u skeletnim mioblastima, miotubama i u diferenciranim primarnim ljudskim skeletnim mišićnim ćelijama kroz aktivaciju aktivnosti kaspaze-9 i kaspaze-3 (Dirks i Jones, 2006). Naš HCE je bio u mogućnosti spriječiti ovo povećanje apoptoze aktivirane kaspazom-3 izazvano simvastatinom na način ovisan o dozi.
HerbaCistanches
Osim toga, prethodna literatura je sugerirala da je verbaskozid jedan od glavnih aktivnih sastojakaHerbaCistanches. Verbaskozid, takođe poznat kao akteozid, pripada članu feniletanoidnih glikozida, prirodno prisutne grupe polifenolnih jedinjenja koja su rastvorljiva u vodi (Liao et al., 1999). Ranije je pokazano da je verbaskozid moćan antioksidans koji može ispoljiti snažne antioksidativne aktivnosti čišćenja ROS-a (Liao et al., 1999). U našoj studiji, da bismo utvrdili da li je verbaskozid glavna komponenta u našem HCE koja doprinosi uočenim korisnim efektima, testirali smo efekte verbaskozida u koncentracijama od 0–160 mM. Pošto smo pokazali da je naš HCE aktivan u rasponu koncentracija od 250–2000 mg/ml, na osnovu naših HPLC rezultata koji sugeriraju da je naš HCE sadržavao verbaskozid u koncentraciji od 0,085 posto /wt, aktivna koncentracija verbaskozida treba da se kreće između 0,2125–1,7 mg/ml (tj. 0,34–2,72 mM), treba li verbaskozid biti aktivni sastojak? Ipak, nismo uspjeli uočiti značajan povoljan učinak verbaskozida s ispitanim rasponom koncentracija, iako smo primijetili trend ovisan o dozi za blagotvorno djelovanje verbaskozida na ćelije skeletnih mišića L6. Ovi podaci sugeriraju da je malo vjerovatno da će se blagotvorni učinak našeg HCE-a uočenog u L6 skeletnim ćelijama pripisati učinku samog verbaskozida, što sugerira da bi komponente koje nisu verbaskozid mogle biti odgovorne za uočene korisne efekte. Također je moguće da verbaskozid može stupiti u interakciju s drugim bioaktivnim spojevima u ekstraktu kako bi doprinijeo povoljnim efektima. Dodatni eksperimenti koji koriste frakcioniranje vođeno biotestom bit će korisni u pružanju daljeg uvida u otkrivanje bioaktivnih komponenti odgovornih za doprinos uočenim zaštitnim efektima HCE na toksičnost mišića izazvanu simvastatinom.
U zaključku, ova studija ukazuje da bi HCE mogao ispoljiti moćne zaštitne efekte na smanjenje vitalnosti mišićnih ćelija in vitro izazvano simvastatinom. Ovi rezultati pružaju preliminarne dokaze koji sugeriraju da bi naš vodeni ekstrakt HC mogao biti od terapeutske vrijednosti kao funkcionalna hrana ili nutraceutik za pacijente s hiperlipidemijom od kojih se zahtijeva da se povuku iz liječenja statinima zbog miotoksičnosti izazvane statinima.
Zahvala Ovu studiju je finansijski podržao Biro za hranu i zdravlje HKSAR, Fond za zdravstvo i medicinska istraživanja br. 11120831.
Reference
Armitage, J., 2007. Sigurnost statina u kliničkoj praksi. Lancet 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. Neželjeni efekti statina – mehanizmi i posljedice. Curr. Drug Saf. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. Aktivnost protiv umora ekstrakta Cistanche deserticola bogatog feniletanoidima. Phytother. Res. 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. Statin-inducirana apoptoza i skeletna miopatija. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. Toksičnost mišića povezana sa statinima. Clin. Pharmacol. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. Neželjeni efekti statina: pregled literature i dokazi za mitohondrijski mehanizam. Am. J. Cardiovasc. Drugs 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. Sigurnost statina: ažuriranje. Ther. Adv. Drug Saf. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, KM, Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. Toksičnost statina na mitohondrije skeletnih mišića štakora. Cell. Mol. Life Sci. 63, 2415–2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. Povećanje kapaciteta za generiranje ATP-a, antioksidantne aktivnosti i imunomodulatornih aktivnosti kineskih Yang i Yin tonizirajućih biljaka. Brada. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Suplementacija bikarbonatom kao preventivni način kod oštećenja mišića izazvanih statinima. J. Pharm. Pharm. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Povreda jetre izazvana statinima uključuje unakrsne razgovore između biosintetskih puteva holesterola i selenoproteina. Mol. Pharm. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. Ekstrakt Herba Cistanche pojačava stvaranje mitohondrijalnog ATP-a u srcima štakora i ćelijama H9C2. Pharm. Biol. 46, 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. Retardacija zamora skeletnih mišića pomoću dva fenilpropanoidna glikozida: verbaskozida i martenzita iz Pedicularis plicata Maxim. Phytother. Res. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. Studija o hemijskim sastojcima Cistanche deserticola Ma. i Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Brada. Tradit. Biljka. Droge 26, 143.
Pharmacopoeia Commission, 2010. Farmakopeja Narodne Republike Kine. Chemical Industry Press, Peking.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Prekid terapije statinima zbog mišićnih nuspojava: istraživanje u stvarnom životu. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. Ekstrakt Herba Cistanche poboljšava status mitohondrijalnog glutationa i disanje u srcima pacova, uz moguću indukciju odvajajućih proteina. Pharm. Biol. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. Jedinjenje ugljikohidrata rastvorljivo u vodi iz tijelaHerbaCistanches: izolacija i njegov učinak uklanjanja slobodnih radikala u koži. Ugljikohidrati. Polym. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. Statin-associated Myopatija. JAMA 289, 1681–1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, YS, Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, GD, 2009. Molekularne osnove miopatije povezane sa statinima. Atherosclerosis 202, 18–28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. Statini induciraju tranziciju propusnosti mitohondrija ovisnu o kalcijumu. Toxicology 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. Hepatoprotektivna aktivnost feniletanoida iz Cistanche deserticola. Planta Med. 64, 120–125.
