The Mechanism Of Cistanche Deserticola Promoting Intestinal Function

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Apstraktno

Fenilethanoidglycosides(PhGs), klasa polifenolinih spoja, smatraju se jednim od glavnih bioaktivnih sastojakaCistanchedeserticolaY.C. Ma (CD), čiji se ekstrakt oralno koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini. Iako su prethodna farmakološka ispitivanja izvijestila da PhG-i izražuju mnoge aktivnosti, njihovi profili intestinalnog transporta nisu pojašnjeni. U ovoj studiji istražili smo promenljivost intestinalne emajlije ekstrakta bogatog phG-om (PRE) izCistancheDeserticolakao integrisani sistem u Caco-2 ćelijskom monolayer modelu koristeći bioassay sistem. Rezultati su pokazali da se PRE prvenstveno prevozi putem slabo apsorbovane pasivne difuzije niz koncentracijski gradijent bez effluksa, što pruža farmakokinetička osnova za kliničku primjenu PhG-ova uCistanche Deserticola. Također smo utvrdili emajliju za 3 velikePhGs[akteoside (AC), izoakteoside (IS), i ehinakoside (EC)]od strane HLPC-a. Nadalje, razvili smo roman HPLC-fluorescencija metoda otkrivanja kako bi se precizno odredila količina fluksa AC i IS. Kao što se očekivalo, transportne karakteristike trijuPhGssu u skladu sa onima pre, što ukazuje da je sadašnji bioasay sistem primjeren i pouzdan za procjenu transportnih karakteristika grupa aktivnih sastojaka (AIG) u PRE. Štaviše, ovaj sistem može biti pogodan i za druge biljne ekstrakte s obzirom na odgovarajuću bioaktivnost.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovdje da biste znali više

Uvođenje

Ćelijska linija Caco-2, koja je izvedena iz adenokarcinoma ljudskog debelog crijeva, pokazuje enterocite. U normalnim uslovima, Caco-2 ćelije se spontano razlikuju od zrelih ćelija i formiraju netaknute monoleje [1]. Susjedne ćelije se pridržavaju preko uskih raskrižja formiranih na apikalnoj strani monolajta, što može diskriminirati pasivno i aktivno prenošene lijekove preko epitelnog sloja [2]. Zbog morfološke i biohemičke sličnosti sa normalnim enterocitima, Caco-2 ćelijski monoleji služe kao dobro prihvaćen in vitro model za proučavanje potencijala apsorpcije intestinala i transportnih karakteristika lijekova [3, 4].

Za suprotno od hemikalija, biljni ekstrakti (PE) su smjese čija biološka aktivnost i aktivni sastavi često nisu dobro identificirani [5]. Štaviše, svojstva intestinalne transportne osobine PE, za razliku od svojstava njegovih konstituenta, usko su povezana sa kliničkom upotrebu. Mjerenja fluksa za probni uzorak preko caco-2 ćelije monolajta obično uključuju hemijske metode, kao što su HPLC, LC/MS itd. Iako su ove metode moćni alati, oni su složeni, dugodušni, skupi, a povremeno zahtijevaju sofisticiranu opremu. Što je još važnije, ni jedna ni manjinska komponenta ne mogu odražavati PE u celini. Tako je potrebno uspostaviti romanski pristup nezavisan od određivanja konstituenta kako bi se identificirale i procijenile transportne karakteristike PE.

CistanchedeserticolaY.C. Ma (CD), holoparazitska biljka, je uobičajena tradicionalna kineska medicina koja se uglavnom koristi za liječenje nedostatka bubrega, slabost tijela i zatvor, a ove upotrebe su službeno zabilježene u kineskoj farmakopeiji [6]. Fenilethanoidni glikozidi (PhG), uključujući ehinakozid (EC), akteoside (AC), izoakteoside (IS), itd., su klasa polifenolinih spoja [7]. Smatraju se jednim od glavnih bioaktivnih sastojakaCistanchevrste [8]. Farmakološka ispitivanja pokazala su da je bioaktivnostPhGsje raznolika i uključuje antioksidativne [9], anti-zamor [10], hepatoprotektivne [11], imunomodulatorne [12], anti-upalne [7, 13] i neuroprotektivne efekte [14]. Međutim, intestinalne transportne karakteristikePhGsnisu istražene. U ovoj studiji, istraživali smo emeability intestinal phG-rich extract (PRE) iz CD-a kao integrisanog sistema i promjenjivost tri glavna PhG (AC, IS, i EC) u diferenciranim Caco-2 ćelijama. Naši rezultati ukazuju da se PRE prvenstveno prevozi putem slabo apsorbovane pasivne difuzije niz gradijent koncentracije bez effluksa, što pruža farmakokinetička osnova za kliničku primjenu PhG-ova u CD-u.

Materijali i metode

Materijale

Ljudski intestinalni Caco-2 ćelijska linija dobivena je iz Američke kolekcije kulture tipa (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS i EC (>98%) su kupljeni od Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). Modificirani Orlov medij (DMEM), fetusni serum goveda (FBS) i neesentinske aminokiseline (NEAA) proizveo je Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-well TranswellTM ploče (umetnuti područje rasta membrane 4,67 cm2 ) dobivene su od Corninga (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, SAD). Kolagen sa rat-repom je dobiven od Sigma-Aldricha (St. Louis, MO, USA). Svi reagenti i hemikalije za HPLC analizu su bili analitičke ocjene.

Priprema PRE iz Cistanche deserticola

Cd materijal sušen zrakom bio je u prahu i ekstrahiran perkolacijom sa 70% etanola. Frakcija bogata phG-om pripremljena je kako je prethodno opisano [10] i ekstrahirana vodom zasićenim n-butil alkoholom. Ekstraktno piće je bilo koncentrirano i sušeno pod smanjenim pritiskom. Makroforna smola-UV spektrofotometrija [15] mjerila je phG sadržaj od 78,4%. Konačni uzorak predstavljao je 1,75% prinos sirovine po suhoj težini. Dobiveni uzorak se do daljnje upotrebe čuvao na −20°C.

Određivanje AC, IS, i EC od strane HPLC-a

Shimadzu HPLC sistem opremljen softverom LC rješenja je korišten za assay sadržaj AC, IS, i EC u PRE. Korišten je i održavan kolona Intersil C18 u obrnutoj fazi (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Pokretne faze su bile acetonitril i voda koja je sadržavala 0,1% fosforne kiseline (v/v) s elucijom gradijenta (Tabela 1) pri brzini protoka od 1,0 ml/min. Detektor UV spektrofotometra je postavljen na 334 nm. Da bismo precizno odredili fluks AC i IS, razvili smo novelu HPLC-fluorescenciju detekcije (HPLC-FLD) metodu. Nakon strukturne analize i skeniranja valne dužine fluorescencije (podaci nisu prikazani), dobili smo optimalne uslove detekcije fluorescencije za AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) i IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

HPLC analitička metoda je validirana koristeći sljedeće karakteristike performansi: stabilnost, linearnost, osjetljivost, preciznost (intra- i među-dana varijabilnost), i preciznost. Analiti u transportnom tamponu su uskladišteni na 25°C u mraku 24 h, a njihova stabilnost je izmjerena. Analiti su bili vrlo stabilni u prisustvu vitamina C (0,4%) jer su relativne standardne vrijednosti devijacije (RSD) u vršnim područjima bile< 3.5%.="" the="" linear="" regression="" equation,="" correlation="" coefficient,="" range="" of="" linearity,="" lod,="" and="" loq="" for="" ac,="" is,="" and="" ec="" are="" shown="" in="" table="" 2.="" the="" lods="" (18–30="" nm)="" and="" loqs="" (60–100="" nm)="" values="" illustrate="" that="" the="" hplc-fld="" and="" hplc-uv="" methods="" are="" highly="" sensitive.="" the="" rsd="" values="" that="" express="" the="" precision="" of="" the="" method="" were="" all="">< 2%="" for="" intra-="" and="" inter-day="" variability,="" indicating="" good="" precision.="" for="" recovery="" evaluation,="" ac,="" is,="" and="" ec="" was="" added="" to="" the="" transport="" buffer="" to="" yield="" three="" (high,="" medium,="" and="" low)="" concentration="" levels.="" the="" recovery="" values="" of="" the="" method="" for="" the="" analytes="" are="" summarized="" in="" table="" 3.="" the="" average="" recoveries="" ranged="" from="" 90.0%="" to="" 96.4%,="" indicating="" good="" accuracy.="" in="" conclusion,="" the="" established="" hplc="" methods="" are="" satisfactory="" with="" respect="" to="" linearity,="" sensitivity,="" precision,="" and="" accuracy="" for="" the="" quantification="" of="" ac,="" is,="" and="" ec="" in="" transport="">

Određivanje PRE-a bioasay sustavom

Bioasaja (totalni antioksidativni kapacitet) bila je zasnovana na FRAP (ferric reducing/antioksidativna snaga) ispitivanju koje smo prethodno opisali [16] i validirali u smislu linearnosti i preciznosti (intra- i među-danske varijabilnosti). Linearnost metode bioasaje je određena na osnovu kalibracionih krivina. Raspon koncentracije linearnosti je bio 0,0625 − 40 μg/ml (y = 0,0258x+0,0968, R2 = 0,996). Preciznost utvrđene metode bioasaje je određena u smislu intra- i među-dana varijabilnosti za analizu PRE (10,0 μg/ml). Intra-day ponovljivost metode je određena na osnovu pet uzastopnih određenja istog dana. Međudavna ponovljivost je izmjerena na osnovu pet uzastopnih određenja u tri različita dana. Vrijednosti RSD za preciznost metode bile su 1,014% i 4,72% za intra- odnosno među-dnevno varijabilnost, što ukazuje na dobru preciznost. Tako je uspostavljena metoda bioasaje zadovoljavajuća u pogledu linearnosti, preciznosti i preciznosti za kvantifikaciju PRE u transportnom baferu.

Kultura ćelija

Caco-2 ćelije su kulturane na 37°C i 95% relativne vlažnosti u atmosferi koja sadrži 5% CO2 i medij koji se sastoji od DMEM-a, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamina, penicilina (100 U/ml), i streptomicina (100 μg/ml). Medij se mijenjao svaki drugi dan tokom rasta ćelija i differentiacije. Ćelije su uzgajane u plastičnim flašama od 75 cm2 i beru se svakih 3-5 dana sa 0,05% EDTA-trypsina. Za transportne eksperimente, ćelije su bile zasipane na 1×105 ćelija/cm2 na Transwell umecima obloženim kolagenom. Otprilike 21 dan nakon sijanja, monoleji su korišteni za transportne eksperimente. Njihov integritet je određen mjerenjem transepitelnog električnog otpora (TEER) preko monolejera s EVOM-om opremljenim ENDOHM-SNAP -om (World Precision Instruments, Inc., USA). TeER vrijednosti caco-2 ćelije monolayera potrebnog za prekoračenje 500 O-cm2.

Transportni eksperimenti

Monolojer je opran transportnim puferom (P-bafer koji sadrži 10 mM HEPES, 1 mM natrijev piruvat, 10 mM glukoze, 3 mM CaCl2 i 145 mM NaCl, pH 7,4) i zatim predinkubiran 20 min na 37°C. Nakon uklanjanja transportnog bafera, svjež transportni bafer koji sadrži probne uzorke dodan je apičnoj (AP) komori (1,5 ml) u AP u bazolateralne (BL) usmjerene studije ili BL komoru (2,5 ml) u BL u AP usmjerene studije. Za AC, IS i EC ispitivanja pomoću HPLC-a, alikvot (300 μl) je uklonjen iz svake prijemne komore u različitim vremenskim intervalima (30, 60, 90 i 120 min). Prijemna komora je dopunjavana sa istim volumenom svježeg pregjavljenog (37°C) transportnog bafera nakon svakog ispitivanja. Prikupljeni uzorci su uskladišteni na −20°C za daljnju upotrebu. Za određivanje pre koristeći bioassay, uzeti su samo uzorci na 120 min. Zbog nestabilnosti PRE, AC, IS i EC, dodano je 0,4% (w/v) vitamina C kako bi se stabilizirale uzorci kako bi se odredili AC, IS i SADRŽAJ EK od strane HPLC-a, a uzorci za PRE bioasažu su analizirani odmah nakon uzorka. Izračunata je prividna vrijednost koeficijenta propusnosti (Papp ili 'Papp) svakog uzorka.

Analiza podataka

Papp vrijednosti u AP BL ili BLAP smjerovima AC, IS i EC su izračunate na osnovu sljedeće jednadžbe: Papp = (4Q/4t)/(A C0), gdje je Papp prividni koeficijent propusnosti (cm/s) određen HPLC-om. (4Q/4t) je brzina izgleda testnog spoja (AC, IS, ili EC) na strani prijemnika (μmol/s); A je površina umetaka (cm2 ); C0 je početna koncentracija testnog spoja na strani donatora (μmol/ml). Konkretno, jedinica mase "μg" je korištena umjesto "μmol" kada su izračunate 'Pappove vrijednosti. Podaci su izraženi kao sredstva ± SD.

Rezultate

Sastav Acteoside, Isoacteoside, i Echinacoside u PRE iz Cistanche Deserticola

Pošto se AC, IS i EC smatraju glavnim bioaktivnim phG-ovima cistanche vrsta [8], analizirali smo njihov sadržaj u PRE preko HPLC-UV. Reprezentativni hromatogram prikazan je na fig. 1. Identifikacija ovih konstituenta se zasnivala na poređenju vremena održavanja i UV spektra sa onima autentičnih standarda na talasnoj dužini od 334 nm. Sadržaj AC, IS i EC u PRE-u je bio 26,60%, 1,84%, odnosno 32,83%. Tako ova tri spoja predstavljaju 61,27% PRE; nadalje, goreni rezultati ukazuju na to da je sadržaj PhG-a u PRE-u 78,4%. Prema tome, AC, IS i EC predstavljaju približno 80% PhG-ova u PRE-u.

Totalni antioksidativni kapaciteti PRE, AC, IS i EC

Studije antioksidativne aktivnosti PhG-ova sa CD-a su prijavljene [9], a AC, IS i EC predstavljaju približno 80% PhG-ova u PRE- u. Tako su totalni antioksidativni kapaciteti PRE, AC, IS i EC asayed i izraženi su pomoću FRAP vrijednosti (× 10–6 mmol). Kao što je prikazano na fig. 2, kada je vrijednost FRAP-a bila 8 × 10–6 mmol, Konačne koncentracije PRE, AC, IS i EC bile su 6,20 μg/ml, 3,14 μg/ml, 22,92 μg/ml, odnosno 4,89 μg/ml, što ukazuje na to da je ukupan antioksidativni kapacitet ova četiri uzorka rangiran kako slijedi: AC > EC > PRE > IS. Bioaktivnost PRE se pripisuje njegovim grupama aktivnih sastojaka (AIG). Za otprilike 60% PRE, AC i EC pokazali su jaču totalnu antioksidativnu aktivnost od PRE i IS. Jer IS (1,84%) predstavlja vrlo mali dio PRE, druge komponente, kao što je slabo antioksidativni IS, također su jasno aktivne u PRE. Iznenađujuće, totalna antioksidativna aktivnost se razlikovala za gotovo 7 puta između AC i njegovog izomera IS, što ukazuje ne samo na broj fenolne hidroksilne grupe [9] nego i položaj fenolne hidroksilne grupe u molekuli uticao je na antioksidativni efekat.

Validacija monolejera Caco-2

Da bi se potvrdio Caco-2 ćelijski monolayer sistem, Pappove vrednosti propranolola (dobro transportovanog markera) i Lucifer žute (slabo transportovanog markera) od AP do BL preko monoleja Caco-2 utvrđene su kao 1,51 × 10–5 cm/s odnosno 2,8 × 10–7 cm/s, odnosno, i te vrijednosti su se složile sa onima objavljenim u prethodnim izvještajima [17, 18]. Ispit aktivnosti alkalne fosfataze također je potvrdio da su monoleji Caco-2 ćelija bili kvalitetan usporedivi sa malim crvuljnim epitelom [19]

Emenost Acteoside, Isoacteoside, i Echinacoside

Generalno, Pappove vrijednosti dobro apsorbovanih lijekova bile su visoke (> 1,0 × 10–5 cm/s), dok su oni slabo apsorbovanih lijekova bili niski (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Prohtjenjivost PRE

Gore navedeno rezultati ukazuju da je ukupan antioksidativni kapacitet PRE-a najmanje zbog 61,27% AIG-a iz PRE- a. Tako smo procijenili TR od PRE na osnovu njegove koncentraciono-efektne krivine ukupnog antioksidativnog kapaciteta i izračunali 'Pappove vrijednosti kako bi se odrazile transportne karakteristike PRE-a. 'Papp vrijednosti PRE za AP! BL i BL! AP je bio (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s i (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/s, što ukazuje da je ovaj spoj bio slabo hlanjiv. Nadalje, efflux ili aktivni transport nije bio očigledan jer je omjer 'Papp BL i AP / 'Papp AP i BL za PRE bio 1,45 [20]. Štoviše, bidirekcioni TR PRE se povećao približno između 300 i 900 μg/ml (fig. 5). Nedostatak usmjerene preferencije rezultata sugerira da je pasivna difuzija glavni transportni mehanizam PRE-a.

Rasprava

U odnosu na visoko pročišćene proizvode od lijekova, PE je općenito mješavina koja se sastoji od stotina konstituenta sa široko različitim fiziohemijskim svojstvima. Stoga PE provodi sistematsko, multitargetsko i višekanelno sinergističko djelovanje zbog njihovog kompleksa AIG [21], što otežava analizu transportnih karakteristika PE. Za procjenu transportnih svojstava PE naučnije, neki istraživači su identificirali više komponenti, a ne jednu komponentu, u PE [22–24]. Ipak, ograničen broj birača ne može odražavati PE u celini. Međutim, određivanje svih komponenti u PE je nemoguće. Štoviše, ako različite komponente u PE prikazuju potpuno različite transportne karakteristike, holističke transportne karakteristike PE će biti teško identificirati.

1990-ih, bioasay sistemi su korišteni za procjenu TR antimikrobnih agenata [25]. Do 2005, Eguchi i njegove kolege [26] su procijenili antioksidativnu aktivnost ekstrakta šargarepe korištenjem BL medija iz di differentiated Caco-2 ćelija; ovaj pristup je prikladniji za odraz in vivo situacija .

Na osnovu prethodnog izvještaja o aktivnosti PhG-ova [9] i naših rezultata (fig. 2), TR AIG-a u PRE-u se može ocijeniti određivanjem ukupnog antioksidativnog kapaciteta medija u prijemnici komori. Nakon transportnih eksperimenata, otkrili smo da je TR PRE bio sličan u oba smjera, a ovaj transport je bio zasićen i slabo apsorbiran ('Papp'< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" and="" it="" did="" not="" indicate="" efflux,="" suggesting="" that="" passive="" diffusion="" down="" a="" concentration="" gradient="" is="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" pre="" (fig.="" 5).="" furthermore,="" the="" transport="" characteristics="" of="" pre="" are="" consistent="" with="" those="" of="" ac,="" is,="" and="" ec,="" the="" effective="" components="" that="" display="" anti-oxidative="" activity="" in="" pre="" (fig.="" 4="" and="" table="" 4).="" this="" result="" was="" expected="" and="" indicated="" that="" the="" present="" bioassay="" system="" is="" appropriate="" and="" reliable="" for="" the="" evaluation="" of="" the="" transport="" characteristics="" of="" aig="" in="" pre="" in="" differentiated="" caco-2="">

Za suprotno od canonical Papp vrijednosti, koja se obično koristi za odražavanje transporta jednog spoja, 'Papp vrijednost dobivena od TR na temelju koncentraciono-efektne krivine može ne samo odražavati komponente koje prodiru u monolajere s netaknutom strukturom već uključuju i druge faktore vezane za ciljnu aktivnost, kao što su metaboliti komponenti, hemijski degradiran proizvodi, pa čak i neki citokini koji se izlučuju iz Caco-2 ćelija kao odgovor na stimulaciju koja može utjecati na ciljnu bioaktivnost. Tako, višefaktor gore spomenuti, a ne samo transportirani netaknute komponente, određuju 'Papp vrijednost. Stoga, 'Papp može snažnije korelirati unutar Vivo situacija nego što je to canonical Papp value [26]. U ovoj studiji, razjasnili smo pasivno difuzanu i slabo apsorbiranu prirodu PRE-a na osnovu njegove 'Pappove vrijednosti, i ova priroda može biti povezana s visokim dozatorom i dugim kliničkim periodom liječenja CD-a [27]. Ipak, ovi nalazi će pružiti sistematnije smjernice za kliničare u primjeni CD-a kada su identificirane samo transportne karakteristike većine AIG-a u CD-u, ne samo phG-ova.

Međutim, odabrani predmet bioaktivnosti mora biti dovoljno osjetljiv da se otkrije u mediju prijemne komore, što predstavlja izazov uspostavljanju sistema bioasaje za procjenu transportnih karakteristika PE. Nadalje, bioaktivnost bi također trebala ovisiti o što više komponenti. U našoj studiji, ukupan antioksidativni assay kapaciteta je bio prikladniji od nekoliko drugih metoda (S1 smokve.). Ali čak i tako, naš test može otkriti tr pre samo na 120 min.

Zajedno, sadašnja studija uspostavila je novi bioasay sistem za procjenu promenljivosti precjenjivosti PRE-a u različitim Caco-2 ćelijama. Dobiveni rezultati pokazali su da je slabo apsorbovana pasivna difuzija niz gradijent koncentracije bez effluksa glavni transportni mehanizam PRE (fig. 5), koji pruža farmakokinetičnu osnovu za kliničku primjenu PhG-ova u CD-u. Upotreba novog sistema bioasaje za procjenu TR i time izračunavanje 'Papp vrijednosti za procjenu intestinalne transportne imovine AIG-a u PEs je očito izvodljiva. Ovaj pristup može biti pogodan i za druge PE s obzirom na odgovarajuću bioaktivnost

Podrška informacija

S1 Smokvu. Efekti PRE na (A) superoksid anion, (B) hidroksil radikalan, (C) lipidni produkt peroksidacije, i (D) DPPH radikalan. Postupci atentata su izvršeni prema prethodnim izvještajima [1, 2] bez upotrebe transportne bafere. Vrijednosti IC50 (50% inhibicione koncentracije) i SC50 (50% scavenging koncentracija) su izračunate na osnovu standardnih koncentraciono-odgovornih krivina. (DOCX)

Doprinosi autora

Začeo i dizajnirao eksperimente: YG XC YQ. Izvedeni su eksperimenti: YG CZ FL LF RC YS. Analizirao podatke: CZ YG YQ. Doprinijeli reagenti/materijali/alati za analizu: RC. Napisao rad: YG YQ

Department of Research Center for Pharmacology and Toxicology, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing, P.R. China,

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang, P.R. China