Upravljanje rastvorenim kiseonikom kontaktorom od polipropilenskih šupljih vlakana utiče na starenje vina

kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstract

Pozadina: Brojni enološki postupci mogu uzrokovati višak otopljenog kisika u vinu, kratkoročno ili dugoročno determinirajući senzorne i kromatske defekte. Stoga je potrebno upravljati viškom kisika prije flaširanja. Metode: U ovom istraživanju, upravljanje sadržajem otopljenog kisika pomoću kontaktora sa polipropilenskim šupljim vlaknima membrane je provedeno u dva vina iz različitih sorti grožđa (Aglianico i Falanghina). Vina su analizirana nakon 11-mjesečnog odležavanja. Sadržaj antocijanina i acetaldehida je procijenjen HPLC. Osim toga, drugofenolnijedinjenja i hromatske karakteristike analizirane su spektrofotometrijskim metodama. Sprovedene su NMR i HR ESIMS analize za procjenu broja proantocijanina i polimernih pigmenata. Rezultati: Nakon 11 mjeseci odležavanja u oba vina uočeno je smanjenje slobodnog i ukupnog SO2 u odnosu na početne vrijednosti. U vinima sa najvišim nivoom rastvorenog kiseonika primećen je značajniji gubitak. Nisu otkrivene značajne razlike u pogledu parametara boje. U crnom vinu sa najvećim sadržajem kiseonika, masivno formiranje polimerapigmentia uočeni su reaktivni tanini BSA, za razliku od vina sa nižim nivoom kiseonika. Zaključak: Studija je pokazala da se membranski kontaktor može pokazati kao uspješan alat za upravljanje otopljenim kisikom u vinima kako bi se spriječilo njihovo oksidativno kvarenje.

Ključne riječi: oksidacija; membranski kontaktor; vino; polimernih pigmenata

kliknite da biste dobili više informacija

1. Uvod

Vino je hemijski dinamičan sistem, a čak i nakon fermentacije, njegov sastav nastavlja da se razvija tokom skladištenja. Ove promene posle fermentacije nazivaju se starenjem, ali treba napraviti razliku između promena koje se dešavaju tokom faze sazrevanja (npr. skladištenje vina u rinfuzi u rezervoaru ili bačvi), kada je intervencija vinara još uvek dozvoljena, i onih koje uzimaju mjesto u fazi odležavanja nakon što je vino zatvoreno u boce i jedina moguća intervencija je ograničena na odabir najprikladnijih uslova skladištenja.

Među jedinjenjima vina, fenoli su oni koji su najviše pogođeni starenjem. Potiču od grožđa(flavonoidii neflavonoidi) i predstavljaju jedan od najvažnijih parametara kvaliteta vina. Tokom vinarstva i starenja, fenoli se uglavnom podvrgavajuoksidacijareakcije, koje ne utječu samo na sam fenolni sastav, već također određuju promjene u smislu senzornih karakteristika, kao što su boja i oporost.

Fenolni spojevi su primarni reaktanti koji se oksidiraju u prisustvu kisika i metala (Fe3 plus Cu2 plus), što dovodi do kaskade kemijskih transformacija koje mogu rezultirati pretjeranim propadanjem vina [1]. Vinooksidacijasastoji se od niza reakcija: prvo, kisik se reducira u vodikov peroksid interakcijom s prijelaznim metalima, uključujući ione željeza i bakra, u prisustvu kateholnih podjedinica koje su oksidirane u kinone [2]. Kinoni snažno reaguju sa nukleofilnim jedinjenjima, kao što su antioksidansi (sumpor-dioksid, glutation, askorbinska kiselina), poželjni isparljivi tioli

(tj. 3-sulfanilheksanol), nepoželjne aromatiole (tj. sumporovodik), aminokiseline (tj. fenilalanin, metionin) i brojne polifenole (uglavnom flavonole). Proizvodi ovih reakcija mogu dovesti do stvaranja kondenzatapolimernih pigmenata— posebno važno kod crnih vina — ili čak do gubitka boje i sortnih karakteristika [3]. U sljedećem koraku, željezne ili bakrene vrste reagiraju s vodikovim peroksidom Fentonom reakcijom dajući hidroksilni radikal, jak oksidans, sposoban reagirati sa svim organskim sastojcima proporcionalno koncentraciji [4]. Najzastupljeniji organski spoj u vinu je etanol, koji se nakon oksidacije hidroksilnim radikalom pretvara u acetaldehid.

Kao posljedicaoksidacija, u crnom vinu prirodni antocijanski pigmenti se brzo transformišu u stabilnije pigmente putem različitih tipova reakcija kao što su reakcije kondenzacije posredovane aldehidom s taninima i reakcije ciklo-adicije koje dovode do stvaranja proantocijana [5]. Reakcije oksidacije također doprinose modificiranju trpkosti vina promjenom strukture tanina kao posljedica intra i intermolekularnih reakcija posredovanih kisikom [6]. Ovi "stabilizirani proizvodi" antocijanin ili pigmentirani tanini opstaju mnogo duže u vinu nego u svojim početnim oblicima [7]. Stoga su male količine kisika u crnom vinu važne za stabilizaciju boje ili trpkosti. Sam Pasteur je, u svojim studijama o vinu, teoretizirao da samo kada je vino izloženo kisiku može razviti atribute koji ga čine fino odležanim visokokvalitetnim proizvodom. Tokom proizvodnje vina, kiseonik igra ključnu ulogu u procesu fermentacije. Pospješuje sintezu biomase kvasca i pogoduje dobroj fermentaciji. Nekoliko studija je pokazalo da se rizik od zastoja i usporene fermentacije smanjuje nakon dodavanja kisika od 10-20 mg/L [8].

U bijelim vinima, oksidacija je obično povezana s važnim promjenama boje. Smeđa boja je obično neželjena jer je znak oksidacije u stolnom bijelom vinu. Smeđa boja može biti izazvana enzimskom ili hemijskom oksidacijom posredovanom kiseonikom. Potonji je sporiji od oksidacije izazvane enzima. Bijelo vino je općenito osjetljivije na O od crvenog vina. Čak i mali dodaci O. belom vinu mogu dovesti do gubitka arome, posebno voćnosti sa pojavom neprijatnih aroma koji se opisuju kao karamela, užeglo, uzgajano povrće, nalik medu i kuvano povrće. Kinoni nastali oksidacijom mogu reagirati s tiolima Michaelovom reakcijom adicije ili generirati H2O2, kao što je gore navedeno. Oksidativna sredina kroz sve faze proizvodnje vina je u pozitivnoj korelaciji sa formiranjem ovih proizvoda. Tokom odležavanja crnog vina u hrastovim bačvama, oksidativni proces takođe izaziva stvaranje sotolona oksidacijom treonina ili reakcijom acetaldehida sa -ketobutirnom kiselinom. Oksidativna degradacija fenilalanina i -feniletanola u buretu također dovodi do viših koncentracija fenilacetaldehida [9].

Kao što je gore opisano, kiseonik može imati povoljan ili štetan uticaj na kvalitet vina. Nivo izloženosti vina kiseoniku tokom proizvodnje vina ili odležavanja je ključan jer može uticati na konačni proizvod. Singleton [10] je procijenio količinu kisika koju bijelo ili crveno vino može apsorbirati prije nego što se pojave oksidativni defekti. U bijelom vinu, tolerancija je oko 10 zasićenja zraka za razliku od crnog vina, koje može podnijeti više od 30 zasićenja zraka (180 mLO2/L). Također je preporučio oko 10 zasićenja za poboljšanje kvalitete crnog vina.

Upravljanje kiseonikom tokom faza vinifikacije i skladištenja je, stoga, važno i njime se mora rukovati u skladu sa stečenim znanjem kako bi se izbegao nastanak oksidativnih karaktera. Nakon proizvodnje vina, vino se obično podvrgava nizu postupaka stabilizacije kao što su dekantiranje, hlađenje i filtracija koji mogu odrediti nekontrolirani dotok kisika. Pored toga, nove metode vinifikacije koje koriste rezervoare od nerđajućeg čelika i sisteme koji omogućavaju kontrolisanu mikro-isporuku kiseonika (mikrooksigenacija) su sada uobičajene. Čak i kada su uloženi posebni napori da se proizvedu vina koja su što otpornija na daljnji unos kisika, sav nekontrolirani otopljeni kisik u vinu može odrediti daljnji razvoj oksidirajućih svojstava nakon flaširanja. U tom kontekstu, upotreba membranskog kontaktora za upravljanje kisikom u vinu prije flaširanja može biti uspješna strategija za dobivanje najboljih mogućih vina.

Membranski kontaktori su među najčešće korištenim industrijskim sistemima, a ova tehnologija se pokazala korisnom u nizu primjena tekućina/tečnost i plin/tečnost u fermentaciji, farmaceutskim proizvodima, tretmanu otpadnih voda, kiralnoj separaciji, proizvodnji poluprovodnika, karbonizaciji pića, ekstrakciji metalnih jona , ekstrakcija proteina, uklanjanje VOC iz otpadnog plina, osmotska destilacija i dekoholizacija vina [11,12]. To je uređaj koji postiže prijenos mase plin/tečnost ili tekućina/tečnost bez disperzije jedne faze unutar druge. Iako je tehnologija membranskog kontaktora uvedena kao alat za upravljanje plinovima u vinima [13,14], do sada se nekoliko studija bavilo djelotvornošću njegove primjene prije flaširanja kako bi se regulirala evolucija bijelog i crnog vina tokom odležavanja u boci.

U ovom istraživanju djelomična deoksigenacija je izvršena na dva monosortna vina: Aglianico i Falanghina. Učinak uklanjanja kisika na nekoliko parametara vina kao što su sadržaj slobodnog i vezanog SO2 i acetaldehida procijenjen je nakon 1l mjeseca odležavanja u boci. Za crno vino je također procijenjen uticaj na hromatske karakteristike i glavne fenolne spojeve.

2. Rezultati i diskusija

U ovoj studiji, dva komercijalna vina (Aglianico (R) i Falanghina(W)) su podvrgnuta procesu deoksigenacije korištenjem tehnologije membranskog kontaktora kako bi se dobila tri vina sa smanjenim nivoom otopljenog kisika (visoki (H), srednji (M), i nisko (L) za svako vino) prije faze flaširanja. Nakon 11 mjeseci starenja boce, efekti na sumpor dioksid, acetaldehid, hromatske karakteristike,polimernih pigmenata, VRF, BSA-tanini i ukupni fenolci su evaluirani.

2.1. Sumporov dioksid

Koncentracija slobodnog i ukupnog SO2 praćena je nakon 11 mjeseci odležavanja u vinu Aglianico (Tablica 1). Za sve uzorke uočen je gubitak SO2 u odnosu na vrijeme punjenja (slobodni SO, 18 mg/L, ukupni SO, 43 mg/L), a najveći pad vrijednosti ukupnog SO2 uočen je kod vina s većim sadržaj kiseonika pri flaširanju (RHO2 i RMO2), očekivano.

Tokom procesa odležavanja, najzastupljeniji oblici slobodnog SO2 na pH vrednosti vina, bisulfitni jon (HSO, u ravnoteži sa molekulskim SO,), troše se reakcijom sa vodikovim peroksidom i nekoliko elektrofilnih komponenti vina, kao što su one proizvedene kaskadom oksidacije, uključujući kinon i acetaldehid [15]. U okruženju vinarije uobičajena je praksa da se mjeri takozvani "slobodni SO", koji je zbir molekularnog SO i bisulfitnog jona. Ovo posljednje jedinjenje može formirati kovalentne adukte sa elektrofilima, zvane SO2 veziva, koji se mogu klasificirati kao slabi ili jaki na osnovu konstante disocijacije formiranih sulfitnih adukata. Ovi sulfitni adukti se nazivaju vezani SO, a zbroj

slobodnog i vezanog SO daje "ukupni SO". Slobodni i vezani SO su u ravnoteži jedan s drugim u vinu. Štaviše, tokom oksidacije, ravnotežom između ova dva oblika SO2 i potrošnjom slobodnog SO2, kombinovani oblik se oslobađa kako bi se uspostavila ravnoteža. Kod svih tretiranih crnih vina, vrijednosti slobodnog SO2 ispod 3,84 mg/L otkrivene su nakon 11 mjeseci odležavanja u boci. Ove vrijednosti su znatno ispod granice kvantifikacije zvaničnih metoda analize slobodnog SO2 [16]; stoga je ispravnije smatrati zanemarljivom vrijednost slobodnog SO, dok su vrijednosti ukupnog SO bile niže u uzorcima flaširanim s većim sadržajem otopljenog kisika (RHO2). Pomak između slobodnog i kombiniranog starenja vina mogao bi biti razlog zašto su u vinima otkrivene smanjene razine ukupnog SO2 kako se povećava otopljeni kisik pri flaširanju. Osim potrošnje SO2 uslijed oksidacijskih reakcija, dio se može izgubiti i tokom starenja zbog reakcija sumpor-dioksida sa flavanolima. Mehanizam stvaranja 4/ß-sulfoniranih proizvoda je još uvijek neizvjestan. Pretpostavlja se da monomerni 4ß-sulfonirani derivati ​​nastaju kiselinom kataliziranom depolimerizacijom proantocijanidina [17].

Koncentracije slobodnog i ukupnog SO2 (tabela 1) praćene su nakon 11 mjeseci odležavanja u bijelom vinu čije se ponašanje pokazalo istim kao u crnom vinu. Nadalje, u ovom slučaju je detektovan gubitak slobodnog i ukupnog SO2 u odnosu na početne vrijednosti (slobodni SO,26 mg/L i ukupni SO, 89 mg/L). flaširanje (WHO2) je pokazalo manji sadržaj slobodnog i ukupnog SO2.

Acetaldehid, nastao metalom kataliziranom oksidacijom etanola tokom oksidacije vina, bio je viši na 11 mjeseci starenja u uzorku WHO, u odnosu na uzorak WMO i WLO, kao što se i očekivalo s obzirom na niži sadržaj slobodnog i ukupnog SO, u WHO, uzorci (tabela 2). Budući da je težinski odnos između acetaldehida i sumpordioksida 1,4/1 (1,4 mg SO2 utrošenog na 1 mg CH3CHO), mogli bismo procijeniti da je količina acetaldehida u uzorku WHO u potpunosti kombinovana sa SO, (50 mg acetaldehida u kombinaciji sa 70 mg SO2) i imajući u vidu zanemarljive nivoe slobodnog sumpor-dioksida nakon 11 meseci starenja, očekuje se da dalja izloženost kiseoniku može dovesti do pojave slobodnog acetaldehida.

U crnim vinima koncentracija acetaldehida se ne razlikuje među analiziranim uzorcima. Ovo je vjerovatno zbog činjenice da, u prisustvu antocijana i veće koncentracije flavanola, acetaldehid je uključen u brojne reakcije sa ovim fenolima tokom starenja. Kao što je objašnjeno u nastavku, najvažnija reakcija koja uključuje acetaldehid, antocijanine i flavonole je stvaranje spojeva premošćenih etil [18,19] i etil-vezanih oligomera, koji mogu dalje reagirati s dodatnim acetaldehidom, antocijaninima i flavonolima kako bi se stvorio piran prstenaste ili druge strukture polimernog tipa. Konačno, ovi proizvodi mogu promijeniti senzorne atribute vina [20] utječući na neke ključne karakteristike vina kao što su boja, okus i trpkost.

2.2. Utjecaj na pigmente i kromatske znakove

Podaci o sadržaju monomernih antocijana u tretiranim crvenim vinima nakon 11 mjeseci odležavanja u boci pokazuju (Tabela 3 i Dodatni materijali Slika S1) gubitak Malvidin-3-glukozida u uzorku RHO2 s višom koncentracijom kisika nego u RMO2 i RLO2. Dosljedno, među vinima su otkrivene razlike u pogledu ukupnih antocijana (Slika 1). Vino s niskom koncentracijom kisika pri flaširanju pokazalo je veću koncentraciju ukupnih nativnih antocijana u odnosu na ona s većom koncentracijom otopljenog kisika. Učinak tretmana membranskog kontaktora na različite klase pigmenta, određen Harbertsonovom metodom, uključivao je očekivano značajno nisku koncentraciju SPP (kratkih polimernih pigmenata) u uzorcima RLO, u poređenju sa uzorcima RHO2 i RMO2 koji su pokazali najveći porast ovih važnih stabilna jedinjenja (tabela 4). LPP (dugi polimerni pigmenti) nisu se značajno razlikovali u svim uzorcima. Polimerni pigmenti (SPP i LPP) se definiraju kao pigmenti otporni na bisulfitno izbjeljivanje. Nastaju reakcijom između antocijana i tanina tokom odležavanja vina [21], što dovodi do stabilizacije boje tokom vremena. Glavna razlika između ove dvije klase pigmenata je u tome što, za razliku od SPP, LPP ima tendenciju taloženja s proteinom [22]. Kako crveno vino stari, obično se opaža veće stvaranje LPP u odnosu na SPP. Dakle, promjene otkrivene za SPP, a ne za LPP mogu odražavati rano oksidativno stanje Aglianico vina nakon 11 mjeseci starenja. Učešće nativnih antocijana u reakcijama koje daju nove polimerne pigmente je u skladu sa smanjenjem ukupnih nativnih antocijana prikazanim u (Tablica 4), i sa sličnim efektima uočenim u crnim vinima tokom mikrooksigenacije [23].

Kako vino stari i kroz različite izloženosti kisiku, ovi polimerni pigmenti postaju od presudne važnosti za boju vina, a male količine acetaldehida mogu reagirati s antocijanima kako bi se proizvele nove stabilne crvene pigmente [19,24]. Činjenica da značajne razlike u pogledu intenziteta boje i nijanse nisu uočene (tablica 5) vjerovatno je, kao što je već uočeno za LPP, posljedica relativno kratkog vremena starenja.

2.3. Utjecaj na pigmente crnog vina: NMR i HR ESIMS analize

U cilju razumijevanja molekularne osnove uočenih promjena u vinima tretiranim različitim nivoima kisika, uzorci RHO2, RMO2 i RLO su podvrgnuti NMR analizi, kako je opisano u Odjeljku 3. Pažljiva inspekcija Dobijeni H-NMR spektri tri uzorka nisu otkrili nikakvu uočljivu razliku između tri upoređena vina (dodatni materijali, slika S2). Stoga smo odlučili istražiti ista vina pomoću HR ESIMS-a s obzirom na intrinzičnu veću osjetljivost tehnike u odnosu na NMR spektroskopiju. Tri vina su frakcionisana pomoću HPLC/Vis pomoću C-18 kolone. Za svako vino su dobijene tri frakcije: prva frakcija je sakupljena od 15 do 25 min (frakcija 1), druga od 25 do 30 min (frakcija 2) i, na kraju, treća frakcija (frakcija 3) od 30 minuta do kraja hromatografskog ciklusa. U skladu s podacima objavljenim u literaturi [25], očekivalo se da će se u prvoj frakciji pojaviti neacetilirani antocijani, dok je u drugoj frakciji trebalo prikupiti potencijalne piranoantocijanine. Tri dobijene frakcije (1-3) za svako od tri analizirana vina (RHO,, RMO, i RLO,) su podvrgnute potpunoj skeniranoj HR ESIMS analizi u modu pozitivnih jona. Kršenje 1 svih vina, otkrili smo pik jona koji je pripisan malvidin-3-O-glukozidu (493.1332;△=-1.648; odgovara C23H2sO12 plus ), dok se pikovi jona odnose na druge uobičajene vinski antocijanini, kada su otkriveni, predstavljali su greške iznad 10 ppm i nisu se smatrali pouzdanim (Dopunski materijali Slika S3). U pogledu frakcija 2 i 3 RMO2 i RLO, pokazalo se da se u osnovi međusobno preklapaju, dok maseni spektri frakcija 2 i 3 RHO, vino je pokazalo neke zanimljive osobenosti. Tačnije, u RHO, u frakciji 2 uočen je jonski pik sa centrom na m/z517.1317(△=-4.569; što odgovara C25H25O12). Ovaj vrh je pripisan Vitisinu B (Supplementary Materials Slika S4)[26]. U masenom spektru frakcije 3 RHO, dva pika jona na m/z809.2294(△=0.827; što odgovara Ca0H4O18) (Dopunski materijali Slika S5) i 1029.2871(△=-0.065 ; što odgovara CsH53O25) (dopunski materijali slika S6), respektivno, bili su sadržani. Ovi ionski pikovi ukazivali su na pojavu polimernih pigmenata. Pik na m/z 809 pripisan je dimerima premoštenim etilidenom koji se sastoji od jedne malvidin-3-O-glukozidne jedinice i jednog (epi)katehinskog dijela[27I, a pik na m/z1029 pripisan je etiliden- premošteni dimer sastavljen od dvije malvidin-3-O-glukozidne jedinice, od kojih se jedna javlja u obliku flavilijuma, a druga u obliku pseudo baze [28,29].

Vitis u B i pigmenti premošteni etilidenom (m/z 809 i 1029) su rezultat hemijske reakcije između acetaldehida i antocijana ili flavan{3}ola. Acetaldehid može djelovati ili kao nukleofil na svom alfa položaju ili kao elektrofil na karbonilnoj funkciji. Reakcija između nukleofilnog acetaldehida i elektrofilnog C4 položaja antocijanina dovodi do stvaranja Vitisin B, prilično stabilnog spoja klasificiranog kao piranoantocijanin. Suprotno tome, kada acetaldehid djeluje kao elektrofil tako što je podvrgnut nukleofilnom napadu od strane C8, au manjoj mjeri čak i od strane C6 pozicija bilo flavan-3-ola ili antocijana, formiraju se dimeri premošteni etilidenom. Nije iznenađujuće da smo Vitisin B i crvene pigmente uočili samo u RHO2 vinu, jer takvi proizvodi, kao što je gore rečeno, nastaju reakcijom acetaldehida sa antocijaninima i flavan{10}olima, a acetaldehid je uglavnom molekul nastaje kao rezultat oksidativnog procesa kojem vina prolaze kroz vrijeme izlaganjem atmosferskom kisiku. Dakle, veće količine acetaldehida su svakako prisutne u RHO, nego u RMO i RLO, vinima za koje se čini da su zaštićena od kisika do

2.4. Utjecaj na VRF, BSA-tanine i ukupne fenole

Iako su ubrzo nakon tretmana membranskim kontaktorom razine ukupnih fenola bile slične među tretiranim vinima, nakon 11 mjeseci odležavanja u boci, broj ukupnih fenola bio je veći u uzorku s većim koncentracijama kisika pri flaširanju, kao što je prikazano u Tablici 6. To bi vjerojatno moglo biti zbog uloge koju kisik igra u stvaranju fenolnih spojeva koji su reaktivniji na željezo i u varijaciji molekularne strukture monomernih i polimernih fenolnih struktura kao što je već prikazano u vinima koja su podvrgnuta različitom unosu kisika tijekom starenja [6]. Ovo potvrđuje trend uočen u Tabeli 6 za BSA-reaktivne na tanine i flavane reaktivne na vanilin iu Tabeli 4 za SPP koji je pokazao statističku razliku nakon 11 mjeseci starenja.

u većoj meri od RHO2.

Koncentracije tanina reaktivnih na BSA-proteine ​​određene su Habertsonovom metodom u RHO, RMO i RLO. Tokom starenja uočeno je povećanje nivoa tanina reaktivnih na BSA u RHO2, što je u skladu sa mogućom polimerizacijom taninskih struktura [27 ]. Zaista, Harbertson [30] je pokazao da se precipitacija BSA povećala kao funkcija povećanja stepena polimerizacije (ili veličine) od trimera do oktamera. Kao posljedica toga, svaka promjena u sastavu i veličini tanina može utjecati na njihovu sposobnost reagiranja s BSA. Oksidacija tanina uzrokuje stvaranje intramolekularnih, kao i međumolekulskih veza između flavonoida. Ovo posljednje uzrokuje da se polimeri izdužuju i da postanu reaktivniji na proteine ​​pljuvačke [31]. Ove vrste reakcija zapravo mogu modificirati strukturu tanina, a time i vodonične veze i hidrofobne interakcije s proteinima [32].

Kako je oporost uzrokovana agregacijom izazvanom taninom i taloženjem pljuvačnih proteina [33], povećanje BSA-tanina u RHO2 sugerira da promjene

podvrgnuti taninima putem ovih reakcija tokom starenja, mogli bi doprinijeti modificiranju percepcije oporosti.

Vanilin-reaktivni flavani (VRF) umjesto toga mogu pružiti dodatne informacije vezane za veličinu kondenziranih tanina. Zapravo, vanilin reaguje sa A prstenom flavanola na poziciji 6 ili 8, ali i acetaldehid reaguje sa istim položajima A prstena flavanola. Stoga se smanjenje VRF-a može smatrati indirektnom mjerom oksidativne polimerizacije flavanola koja je povezana s reakcijama koje pokreće acetaldehid i koje uključuju tanine i antocijanine [34].

U našem istraživanju uočena je nešto niža koncentracija VRF-a u uzorku RMO2. Nedostatak jasnog trenda u funkciji količine kisika mogao bi biti posljedica činjenice da se ovi molekuli također mogu podvrgnuti hidrolitičkom cijepanju u prisutnosti kisika novim molekularnim preuređivanjem sa stvaranjem novih unutar- i međumolekularnih veza [6].

3. Materijali i metode

3.1. Vina

Korištena su dva komercijalna crvena vina Aglianico i bijela Falanghina proizvedena u južnoj Italiji u vinariji Cantina del Taburno. Detalji uzoraka zajedno sa nekim osnovnim parametrima prikazani su u Tabeli 7. Osnovni parametri određeni su prema OIV kompendiju međunarodnih metoda analize vina i mošta (2007).

3.2. Upravljanje kiseonikom u vinu

Industrijski sistem ISIOX (Tebaldi srl) opremljen membranskim kontaktorom gas-tečnost (Liqui-Cel9, Transverse-flow, South Lakes Dr. Charlotte, NC, SAD, odsečen 50 g/mol) i centrifugalnom pumpom od nerđajućeg čelika korišteno. Membrana pruža fiksni i dobro određen interfejs za prenos mase gas/tečnost bez prelaska jedne faze u drugu. Struktura membranskog kontaktora (hidrofobna šuplja vlakna) je napravljena od polipropilena (PP) i nudi vrlo veliku kontaktnu površinu (gas/tečnost) od 20 m²2.

Proces deoksigenacije sastoji se od kontinuiranih ciklusa u kojima se N, vakuum ili kombinacija prva dva procesa (mješavina) koja cirkulira na jednoj površini polipropilenske membrane postepeno obogaćuje kisikom koji potiče iz vina koje cirkulira na drugoj strani membrane. Pokretačka snaga procesa je razlika u parcijalnom pritisku kiseonika kroz membranu. Tokom procesa, vino neprekidno cirkuliše iz zatvorenog rezervoara do aparata za deoksigenaciju.

Kako bi se postigao potreban nivo kiseonika, sadržaj kiseonika u vinu je praćen kroz sve procese do postizanja ciljnog nivoa.

Kontrola procesa je vršena praćenjem O, nivoa u vinima pomoću računara ugrađenog sa vrlo jednostavnom programskom logikom i specifičnim senzorima, koji prate temperaturu i sadržaj kiseonika (luminiscencijski sistem, Hach Lange, opseg mjerenja {{{{2} }}} do 20 mg/LO, rezolucija: 0,01 mg/L O2, tačnost:0-5mg/LO2±0,1). Za kontrolu ulaznog i izlaznog pritiska korišćeni su elektronski prekidači pritiska, kao i pritisak gasa u procesu i nivo svakog vakuuma.

Različiti tretmani deoksigenacije primijenjeni su na vino kako bi se dobili različiti uzorci s različitim sadržajem kisika. Količina kiseonika u bijelom vinu je bila bijelo Visoki O2, WHO2=2.7 mg/L, bijeli srednji O2, WMO2=1 mg/L, bijeli Niski O2, WLO2= 0. 25 mg/L.

Količina kiseonika u crnom vinu bila je redom crveno visoko O, RHO,=1 mg/L, crveno Srednje O2, RMO2=0.5 mg/L, crveno Nisko O2, RLO2=0 .2 mg/L. Oba seta vina su filtrirana na 1 μm prije ubrizgavanja u mašinu, kako bi se izbjegao fenomen zarastanja i vlaženja membrane [35].

3.3. Uzorci flaširanje i starenje

Nakon tretmana, vina su flaširana i sve boce zapečaćene Nomacorc koekstrudiranim sintetičkim zatvaračima (Nomacorc SA, Thimister Clermont, Belgija) selektujte zeleni 100, koji omogućavaju kiseoniku da prođe kroz čep u na kontrolisan način (0,4 mg O2 nakon 3 mjeseca, 0,7 mg O, nakon 6 mjeseci, 1,2 mg O, nakon 12 mjeseci i 1,1 mg O, godinu dana nakon prve godine starenja). Boce su odležane 11 mjeseci na 15 stepeni.

3.4. Metode analize

3.4.1. Određivanje acetaldehida tečnom hromatografijom visokih performansi

Analiza acetaldehida izvedena je derivatizacijom eksperimentalnog uzorka vina i HPLC.

Analiza derivata bila je sljedeća: uzorak vina od 100 μL sipa se u bočicu, nakon čega je dodato 20 μL svježe pripremljenog 1,120 mg/L SO, otopine, 20 μL 25 postotnog sumpornog reagensa (Carlo Erba reagens 96 posto) i 140 μL /L2,4-dinitrofenilhidrazin reagens. Nakon mešanja, rastvor je ostavljen da reaguje 15 minuta na 65 stepeni, a zatim je odmah ohlađen na sobnu temperaturu [36].

Korišten je HPLC aparat Shimadzu LC1{12}} ADVP (Shimadzu Italija, Milano, Italija) opremljen SCL-10AVP sistemskim kontrolerom, dvije LC-10ADVP pumpe za stvaranje potrebnog gradijenta rastvarača , SPD-M 10 AVP detektor i sistem za ubrizgavanje puni Rheodyne model 7725 (Rheodyne, Cotati, Kalifornija, SAD). Odvajanje je izvedeno na Waters Spherisorb koloni (C 18, supstrat čestica silika, ODS2 250×4,6 mm, prečnik čestica 5 um, veličina pora 80 A) opremljenoj zaštitnom kolonom. Optimalna efikasnost separacije je postignuta korišćenjem brzine protoka od 0,75 mL/min, temperature kolone od 35 stepeni; otapala mobilne faze su: (A) 0,5 posto mravlje kiseline (Sigma Aldrich veće ili jednako 95 posto) u vodi milli-Q (Sigma Aldrich) i (B) acetonitril (Sigma Aldrich veće od ili jednako 99,9 posto) ; Protokol elucije gradijenta je bio: 35 posto B do 60 posto B(t=8min), 60 posto B do 90 posto B(t=13min), 90 posto B do 95 posto B(t{{29 }} min,2-min zadržavanje), 95 posto B do 35 posto B(t=17 min, 4-min zadržavanje）, ukupno vrijeme rada, 21 min, injekcije uzoraka 50μL i detekcija je izvršena praćenjem signala apsorbancije na 365 nm.

The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Izvedena su tri analitička ponavljanja za svaku eksperimentalnu repliku.

3.4.2. Analize antocijana tečnom hromatografijom visokih performansi

Analize nativnih antocijana izvršene su pomoću HPLC Shimadzu LC10 ADVP aparata (Shimadzu Italija, Milano, Italija) opremljenog SCL-10AVP sistemskim kontrolerom, dvije LC-10ADVP pumpe za stvaranje potrebnog gradijenta rastvarača, detektor SPD-M 10 AVP, i sistem za ubrizgavanje full Rheodyne model7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). Prema metodi opisanoj u OIV Compendium of International Methods of Analysis of Wine and Mosts [37].

HPLC rastvarači su bili sljedeći: rastvarač A: voda milli-O (Sigma-Aldrich, Milano, Italija)/mravlja kiselina (Sigma-Aldrich veći ili jednak 95 posto)/acetonitril (SigmaAldrich veći ili jednak 99,9 posto) (87:10:3)/v; rastvarač B: voda/mravlja kiselina/acetonitril (40:10:50)o/v. Gradijent je bio: uslovi nultog vremena 94 posto A i 6 posto B; nakon 15 minuta, pumpe su podešene na 70 posto A i 30 posto B, na 30 minuta na 50 posto A i 50 posto B, na 35 minuta na 40 posto A i 60 posto B, na 41 min, kraj analize, na 94 posto A i 6 posto B. Vrijeme ponovnog ekvilibracije od 5 minuta je primijenjeno prije uzastopne analize kako je izvijestio [38]. Kolona korišćena za analize je bila voda

Korišten je stub kugle sfere (C 18, supstrat čestica silicijevog dioksida, ODS2 250 ×4,6 mm, prečnik čestica 5 μm, veličina pora 80) ​​sa predkolonicom. Količina od 50 μL kalibracijskih standarda ili vina je ubrizgana na kolonu. Detektovani su signali apsorpcije na 520 nm. Osetljivost detektora bila je 0,01 jedinica apsorpcije pune skale (AUFS). Svi uzorci su filtrirani kroz 0,45 um Durapore membranske filtere (Millipore-Ireland) u staklene bočice i odmah ubrizgani u HPLC sistem.

Kalibraciona kriva je dobijena ubrizgavanjem 5 rastvora (u tri primerka) koji sadrže rastuće koncentracije malvidin{1}}monoglukozida (Extrasynthese, Lyon, Francuska). Kalibracija je okarakterisana koeficijentom korelacije (R')=0.996. Opseg linearnosti kalibracione krive bio je 2-200 mg/L. Preciznost korištene metode testirana je sa šest ponovljenih analiza uzorka crnog vina koji sadrži 118,4 mg/L ukupnih monomernih antocijana. Koeficijent varijacije je uključen između 1,1 posto (za malvidin 3-monoglukozid) i 9,1 posto (za malvidin 3-(6II-kumaroil)-glukozid) i pokazao je dobru ponovljivost HPLC analize. Koncentracije monomernih antocijanina izražene su kao mg/L malvidin{16}}monoglukozida.

Frakcionisanje vina RLO2, RMO2 i RHO2 izvedeno je prema OIV metodi analize korišćenjem istog HPLC Shimadzu LC10 ADVP kao što je gore navedeno. Izvedena su tri analitička ponavljanja za svaku eksperimentalnu repliku.

3.4.3. Masena spektrometrija ionizacije visoke rezolucije (HR ESIMS) analize crnih vina

HPLC-odvajanje crnih vina sprovedeno kao što je gore opisano dalo je tri frakcije za svako vino. Prva frakcija je sakupljena od 15 do 25 min (frakcija 1), druga od 25 do 30 min (frakcija 2), a treća frakcija (frakcija 3) od 30 min do kraja hromatografije trčanje (45 min). Svaka prikupljena frakcija je osušena, rastvorena u metanolu i analizirana pomoću HR-ESIMS u kontinuiranom protočnom ubrizgavanju u režimu pozitivnih jona. HR ESIMS eksperimenti su izvedeni na Agilent 1260 Infinity IⅡ HPLC kvaternarnom sistemu spojenom na linearnu zamku jona LTQOrbitrap XL hibridnu Fourier transformaciju MS (FTMS) instrument opremljen sa ESI ION MAX izvorom (Thermo-Fisher). Korišćene su sledeće postavke izvora (opseg mase m/z 100-2000): napon prskanja 4,5 kV, temperatura kapilare 300 stepeni, kapilarni napon 15 V, gas omotača 20 i pomoćni gas 21 (proizvoljne jedinice), napon sočiva cevi 140 V i 25 posto energije sudara. Proračun elementarnih formula je proveden korištenjem softvera Xcalibur v 2.0.7 sa ograničenjem tolerancije mase od 5 ppm.

3.4.4. NMR eksperimenti

Količina od 2 mL svakog uzorka vina (RHO2, RMO2 i RLO2) je liofilizirana i rastvorena u 700 μL CDOD(6H 3.31;5c49.0ppm). NMR eksperimenti su izvedeni na spektrometru Varian Unity Inova 700 opremljenom sa 13C Enhanced HCN hladnom sondom i upotrebom Shigemi 5 mm NMR cijevi. Korištena je H-NMR standardna Varian pulsna sekvenca.

3.4.5.Standardne hemijske analize i spektrofotometrijska mjerenja

Prema "OIV Compendium of International Wine and Most Analysis of Wine and Most Analysis 2007"[37], standardna hemijska analiza (jačina alkohola izračunata po zapremini, redukujući šećer, ukupna kiselost, pH, isparljiva kiselost, jabučna kiselost i ukupna suha tvar ) je izmjereno.

Spektrofotometrijske analize vršene su spektrofotometrom Jenway 7305. Kromatske karakteristike, intenzitet boje i nijansa određivani su prema OIV metodama [37]. Intenzitet boje je određen kao zbir abs 420 nm, abs 520 nm i abs 620 nm, a nijansa kao odnos abs 420 nm/abs 520 nm.

BSA-reaktivne tanine, kratke polimerne pigmente (SPP), velike polimerne pigmente (LPP) i ukupne fenole određivali su Harbertson et al. test [22]. Kratki polimerni pigmenti (SPP) i veliki polimerni pigmenti (LPP) dobijeni su kombinovanjem analize supernatanta dobijenog nakon precipitacije proteina korišćenjem goveđeg serumskog albumina BSA

(Sigma-Aldrich) sa bisulfitnim izbjeljivanjem pigmenata u vinu. Kompleks BSA-tanina u peletu je ponovo otopljen, dodan je željezni hlorid i očitan na 510 nm. Ukupni fenoli su kvantificirani očitavanjem uzorka na 510 nm na sljedeći način∶ 50 μL vina je dodano u 825 μL pufera C i očitano na spektrofotometru kao slijepa otopina. Nakon dodavanja 125 μL željeznog klorida, uzorak je ponovo očitan kako bi se kvantifikovala količina fenola koji reaguje na željezo.

Vanilin-reaktivni flavani (VRF) određeni su prema Gambuti et al. [39]. Ukratko, 750 μL otopine vanilina (4 posto u metanolu) dodano je u 125 μL razrijeđenog vina i nakon 5 minuta dodano je 375 μL koncentrovane hlorovodonične kiseline. Nakon 15-min inkubacije smjese na 20 stepeni, apsorbancija je određena na 500 nm i očitana u odnosu na slijepu otopinu u kojoj je korišten čisti metanol umjesto rastvora vanilina. Koncentracije su izračunate kao (plus )-katehin (mg/L).

3.4.6. Statistička analiza

Kvantitativni podaci su upoređeni koristeći Tukeyjev postupak najmanje značajnih razlika, sve varijanse su rezultirale homogeno. Kada varijanse nisu bile homogene, podaci su analizirani Kruskal-Wallisovim testom. Kada su rezultati Kruskal-Wallisovog testa bili značajni (str<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">

4. Zaključak

Rezultati dobiveni u ovoj studiji potvrdili su da različiti sadržaji kisika u flaširanom vinu utječu na starenje i oksidaciju vina.

Upravljanje kisikom u vinu Aglianico pomoću membrane od polipropilena od šupljih vlakana utvrdilo je, nakon 11 mjeseci odležavanja, niži sadržaj slobodnog i ukupnog SO2 u uzorku uz viši nivo otopljenog kisika. Isto ponašanje uočeno je i kod vina Falanghina sa povećanjem acetaldehida u uzorku sa višim nivoom kiseonika.

Što se tiče fenolnih spojeva, veći gubitak ukupnih nativnih antocijana uočen je u crnim vinima. Njihov sadržaj bio je veći u vinu sa nižom koncentracijom kiseonika. Međutim, gubitak ukupnih prirodnih antocijana nije utjecao na parametre boje vina, kao što su intenzitet i ton boje.

BSA-reaktivni tanini i vanilin-reaktivni flavani bili su niži u uzorcima sa srednjim i niskim sadržajem kisika u odnosu na uzorke s većim sadržajem kisika. To je zbog činjenice da kisik, učestvujući u reakcijama oksidacije, sudjeluje u stvaranju polimernih pigmenata. Očekivano, u crnim vinima s najvećim sadržajem otopljenog kisika nakon tretmana membranskim kontaktorom, Vitisin B, etiliden-premošteni dimeri i acetaldehid bili su zastupljeniji u odnosu na vina koja su tretirana s manjim sadržajem kisika u fazi prije flaširanja. .

Zaključno, deoksigenacija vina od strane izvođača membrana mogla bi biti prikladna tehnika za vinsku industriju kako bi se spriječile sve one oksidativne pojave koje bi mogle promijeniti konačnu kvalitetu crnih i bijelih vina koje utiču na sadržaj sumpor-dioksida i acetaldehida (posebno u bijelim vinima). . Ipak, enolozi moraju uzeti u obzir da smanjenje sadržaja kisika može utjecati na stabilnost boje crnih vina.

Dodatni materijali: Sljedeće je dostupno na internetu. Slika S1: Povećanja H-NMR spektra vina RHO, RMO2 i RLO, registrovana u CD: OD. Slika S2: Struktura malvidin 3-O-glukozida i relativni HR ESIMS u modu pozitivnih jona. Slika S3: Struktura Vitisina B i relativnog HR ESIMS u modu pozitivnih jona. Slika S4: Struktura dimera premošćenog etilidenom koji se sastoji od jedne jedinice malvidin 3-O-glukozida (dole) i jedne jedinice (epi)katehina (gore) sa relativnim HR ESIMS u modu pozitivnih jona. Slika S5: Struktura dimera premošćenog etilidenom koji se sastoji od dvije jedinice malvidin 3-O-glukozida, od kojih je jedna na dnu u obliku flavilijuma, a ona na vrhu u svom pseudo-baznom obliku, zajedno sa relativni HR ESIMS u modu pozitivnih jona.

Reference

1. Waterhouse, AL; Laurie, VF Oksidacija vinskih fenola: kritička procjena i hipoteze. Am. J. Enol. Vitić. 2006, 57, 306–313.

2. Danilewicz, JC Mehanizam autooksidacije polifenola i učešće sulfita u vinu: Ključna uloga željeza. Am. J. Enol. Vitić. 2011, 62, 319–328. [CrossRef]

3. Nikolantonaki, M.; Waterhouse, AL Metoda za kvantificiranje stopa reakcije kinona s nukleofilima relevantnim za vino: ključ za razumijevanje oksidativnog gubitka sortnih tiola. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8484–8491. [CrossRef] [PubMed]

4. Elias, RJ; Andersen, ML; Skibsted, LH; Waterhouse, AL Identifikacija slobodnih radikala međuprodukta u oksidiranom vinu korištenjem hvatanja spina elektron paramagnetnom rezonancom. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 4359–4365. [CrossRef] [PubMed]

5. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AM Oksidacijski mehanizmi koji se javljaju u vinima. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

6. Mouls, L.; Fulcrand, H. UPLC-ESI-MS studija oksidacionih markera koji se oslobađaju depolimerizacijom tanina: ka boljoj karakterizaciji evolucije tanina u odnosu na preradu hrane i pića. J. Mass Spectrom. 2012, 47, 1450–1457. [CrossRef] [PubMed]

7. Waterhouse, AL Wine fenolics. Ann. NY Acad. Sci. 2002, 957, 21–36. [CrossRef]

8. Rosenfeld, E.; Schaeffer, J.; Beauvoir, B.; Salmon, JM Izolacija i svojstva pro mitohondrija iz anaerobnih stanica kvasca stacionarne faze. Antonie Van Leeuwenhoek 2004, 85, 9–21. [CrossRef]

9. Jarauta, I.; Cacho, J.; Ferreira, V. Istovremeni fenomeni koji doprinose formiranju arome vina tokom odležavanja u hrastovom drvetu: analitičko istraživanje. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 4166–4177. [CrossRef]

10. Singlton, VL; Trousdale, E.; Zaya, J. Oksidacija vina. 1. Mlada bela vina povremeno izložena vazduhu. Am. J. Enol. Vitić. 1979, 30, 49–54.