Abstract:Osnovni cilj ovog rada je da se diferencijalnom analizom procijene različite biološke aktivnosti sadržaja ukupnih fenola u alkoholnim ekstraktima tri vrste urmenih palmi osjetljivih ili otpornih na Fusarium oxysporum. sp Albidinis. Ovdje su dokazani stilbenski proizvodi sa antioksidativnim i bioaktivnim kapacitetima u otpornoj sorti Taabdount (TAAR). Nadalje, metanolna frakcija sorte urme otporne na TAAR sadrži značajan proizvod, određen LCMS/MS i 1H, 13C NMR, koji pripada porodici hidroksi stilbena, koji pokazuje antioksidativne kapacitete, inhibira aktivnost tirozinaze gljiva i aktivira i ima zaštitni učinak na oštećenja izazvana hipohloritom u 20S proteazomu ostarjelih stanica ljudskih dermalnih fibroblasta. Sve u svemu, sadašnji rezultati pokazuju da hidroksitoluen prisutan u otpornom Phoenix dactylifera L. treba proučiti kako bi se razumjelo način na koji stilben može ispoljiti sposobnost protiv starenja.

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju jaku sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju spermatozoida. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i sposobnost uklanjanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na rou cong rong pogodnosti

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne riječi:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); antioksidativne aktivnosti; aktivnost anti-tirozinaze; aktivacija proteasoma; LC-MS/MS analiza; derivati ​​stilbena

1. Uvod

Hurma (Phoenix dactylifera L.) je višegodišnja jednosupnica iz porodice Arecaceae. Ovo drvo je od najveće važnosti u životima saharskih populacija južnog i jugoistočnog Maroka, kako ekonomski tako i socijalno. Bayoudova bolest, koju uzrokuje zemljišna gljiva Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], značajno je smanjio prinos marokanskih urminih palmi posljednjih godina [2]. Procjenjuje se da je FoA nestala iz dvije trećine marokanskog naslijeđa fenicikola, ali nastavlja uništavati između 4,5 posto i 12 posto najkvalitetnijih komercijalnih sorti urminih palmi [2]. Mnogo je napora uloženo u borbu protiv ove bolesti i objašnjenje nekih odbrambenih mehanizama hurme [3]. Prve studije o mogućim odbrambenim mehanizmima urmene palme istakle su ulogu fenolnih spojeva i antioksidativnog kapaciteta u toleranciji na FoA [4,5]. Biohemijska analiza otpornih i osjetljivih sorti fenolnih spojeva korijena bila je prva biohemijska studija koja je razjasnila dobrobit odbrambenih mehanizama palme hurme. Zaista, literatura pokazuje da su sorte otpornog korijena bogatije 5-kafeoil šikiminskom kiselinom i njenim izomerima položaja od sorti osjetljivih korijena [5]. Ova jedinjenja su efektivno pokazala potencijalnu antifungalnu aktivnost in vitro protiv FoA [6].

Velika sposobnost prirodnih antioksidansa da uklone slobodne radikale je ono što pokreće njihovu rastuću popularnost u prehrambenim i medicinskim studijama [7–10].

Na primjer, reaktivne vrste kisika su otežavajući faktori u ćelijskim ozljedama i procesima starenja [11] i stoga su povezani s mnogim bolestima. Kao rezultat toga, molekuli antioksidansa mogu pomoći ljudskom zdravlju prevencijom degenerativnih bolesti i usporavanjem posljedica starenja [12]. U ovoj studiji zanima nas sposobnost antioksidansa da promovišu aktivaciju 20S-proteasoma i zaštite od njegovog oksidativnog oštećenja. Proteasom zaista doprinosi održavanju stanične homeostaze omogućavajući ćelijski proces čišćenja oštećenih proteina i kontrolirano uništavanje kratkoživih proteina [13]. Stoga bi se aktiviranje proteasoma antioksidansima moglo pokazati kao nova strategija protiv starenja [14]. Nadalje, ovaj rad ima za cilj istražiti potencijal sadržaja fenola rezistentnih korijena na FoA kao aktivnih bioloških spojeva.

2. Materijali i metode

2.1. Plant Sample

Studija je provedena za svaki uzorak sa materijalom od 10 odrasle sorte urme (Phoenix dactylifera L.) uzgojenih sa kontaminiranih ili nekontaminiranih parcela koje se nalaze u Palmaria Figuig, jugoistočni Maroko. Glavni korijen (uključujući korijenje koji diše zrak) ima prečnik od 0,5 do 2 cm osjetljivih sorti, kao što su charas Bouffegous inficed (BI) ili one koje nisu inficirane (BNI). Pored toga, sakupljena je sorta Taabdount (TAAR) otporna na FoA, a listovi dvije ljekovite biljke korišteni su lokalno kao filaktički tretman protiv FoA. Nadalje, ruzmarin (R, Rosmarinus officinalis) i šipak (G, Punica granatum L.) [15] također su sakupljeni u istoj nekontaminiranoj parceli pri čemu su analizirani i korišteni kao kontrola. Uzorci su uzimani u dva perioda u godini, u septembru i krajem januara (između 2013. i 2015. godine), i hermetički čuvani na sobnoj temperaturi. Kako su uzorci nabavljeni od palmera, oni su propisno ovjereni (identifikacija i klasifikacija) od strane ministra poljoprivrede Maroka [16].

2.2. Priprema ekstrakta

Nakon dugotrajnog pranja vodom, korijenje ili listovi su osušeni u hladu, a zatim usitnjeni u blenderu. Za svaki uzorak (BI, BNI, TAAR, R i G), 10 mL metanola je dodano u 1 g suvog materijala, a zatim ostavljeno da se meša 4 h na sobnoj temperaturi. Zatim su filtrirani i ispareni na 37 ◦C pomoću rotacionog isparivača. Suhi ekstrakt je stavljen u otopinu metanola u konačnoj koncentraciji od 10 mg/mL ili 50 mg/mL (kasnije korišten za ispitivanje bioloških aktivnosti in vitro). Za testove biološke aktivnosti izvršene su tri nezavisne ekstrakcije za svaki uzorak.

2.3. Biološke aktivnosti

2.3.1. Fenolni sadržaj i antioksidativna aktivnost

Postupak koji su opisali Nacoulma et al. je primijenjen za procjenu ukupnih fenola i ukupnog sadržaja flavonoida u svakom ekstraktu [17], sa konačnom adaptacijom volumena od 200 µL za korištenje na čitaču mikroploče. Apsorbancija na 760 nm i 510 nm, respektivno, određena je na slijepu metanola. Standardne kalibracione krive galne kiseline (0–300 mg/L) (y=0.0083x plus 0,9106, r2=0.978) i kvercetina (0–100 mg/L) (y {{14 }}.0008x plus 0.0597, r2=0.994), respektivno.

Koristeći 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil slobodni radikal, ispitana je aktivnost uklanjanja antioksidansa (DPPH). Koristeći konačnu adaptaciju volumena od 300 µL i 275 µL, za korištenje čitača mikroploča, procijenjen je kapacitet ekstrakata da smanje željezo (III), kako su opisali Nacoulma et al. [17]. U poređenju sa metanolom, apsorbancija je izmjerena na 517 nm i 700 nm, respektivno. Zatim je, koristeći sljedeću jednadžbu, aktivnost uklanjanja slobodnih radikala svake otopine procijenjena kao postotak inhibicije:

Standardna kalibraciona kriva je dobijena upotrebom askorbinske kiseline ({{0}}–100 mg/L) kao antioksidantnog standarda (y=0.0014x plus 0.0875, r2=0.998).

2.3.2. FoAMyc helijum test inhibicije rasta

Uz malu modifikaciju, metoda koju su opisali Neri et al. [18] je korišten za određivanje stepena do kojeg čiste hemikalije inhibiraju rast FoA micelija. 7-dana stara kultura FoA imala je pet milimetara micelijskih diskova postavljenih na Petrijeve posude sa PDA medijumom dopunjenim čistim hemikalijama navedenim iznad u 50, 75 i 100 µg/mL. Ploče su inkubirane 5 dana na 28 ◦C. Prosječni promjer kolonije mjeren pod dva prava ugla korišten je za procjenu inhibicije rasta FoA micelija. Svaki tretman se sastojao od tri testa koristeći tri različita soja FoA: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgija) i FoA Local (Palemeraie of Figuig, Maroko), kao i negativnu kontrolu koristeći podlogu koja nije dodana.

2.3.3. Viabilnost ćelija i aktivnost 20S proteasoma

Korišteni su normalni ljudski dermalni fibroblasti od {{0}}godišnjeg muškarca (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Njemačka) pri čemu su ćelije postavljene na gustinu od 100,{{3 }} ćelija/mL u RPMI 10 posto sa dodatkom 10 posto (w/v) FBS, 1 posto (w/v) L-glutamina, 100 jedinica/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina. Čuvani su u bijelim ili prozirnim 96-pločama sa mikro jažicama 24 h na 37 ◦C u inkubatoru sa vlažnom okolinom od 5 posto CO2. Za test aktivnosti proteasoma, kao i za procjenu zaštitnih efekata na oštećenje izazvano hipohloritom, ćelije su zatim tretirane testnim materijalima (čisto jedinjenje od 5 do 50 µg/mL, pozitivna kontrola na 0,5 i/ili 1 µM, i metanolnih biljnih ekstrakata od 15 do 50 µg/mL) tokom 24 h sa maksimalno 0,3 posto DMSO u konačnoj koncentraciji, istovremeno, bez promjena, u odnosu na negativnu kontrolu. Istraživanje zaštitnih efekata TAAR ekstrakta ili čistih jedinjenja na aktivnost proteasoma značilo je da su ćelije fibroblasta kasnije podvrgnute 50 µM OCl− tokom 35 minuta (odabrano kao optimalno, bez ćelijske toksičnosti, oksidant-inhibitor stanja 20S proteasoma) [19]. Sljedeće eksperimentalne faze su završene metodologijom dobavljača (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, USA): Prvo, istovremeni eksperiment vitalnosti ćelija koji koristi kristalno ljubičastu kolorimetriju ili MTT testove koji su izvedeni pod apsolutno sličnim uslovima je korišten za normalizaciju ovog testa bioluminiscencije ćelija. Prikazane su standardne devijacije i prosječna fluorescencija u tri primjerka iz dva odvojena testa (n=6). Sva mjerenja i nezavisni eksperimenti (n=2) izvedeni su dva puta.

2.3.4. Inhibicijski učinak na tirozinazu gljiva bez ćelija

Da bi se ispitao učinak na aktivnost enzima, ispitivani materijali (čisti antioksidansi ili metanolni biljni ekstrakti) su prethodno inkubirani sa enzimima u fosfatnom puferu na sobnoj temperaturi. Ukratko, u 96-mikroploča sa 100 mL vodenog rastvora tirozinaze pečuraka (20 jedinica). Tokom 40 minuta, smeša za ispitivanje je inkubirana na 25 ◦C. Nakon inkubacije, nivo proizvodnje dopahroma reakcione smeše je meren spektrofotometrijski na 492 nm [20]. Standardna kalibraciona kriva je nacrtana upotrebom galne kiseline (0-1000 µg/mL) (y=-0,087 × plus 0,45; r2=0,97). Svako nezavisno mjerenje i eksperiment (n=2) izvedeni su dva puta.

2.4. Procedure analize, izolacije i objašnjenja strukture

Mljeveni korijen (20 g) ekstrahiran je sa 200 mL metanola, miješan 24 h na sobnoj temperaturi, filtriran, centrifugiran na 10,000× g 15 minuta, a zatim uparen na 35 ◦C pomoću rotacionog uređaja. aparat za vakuumsko isparavanje. Sirovi ekstrakt je razblažen sa 20 mL destilovane vode, ponovo ekstrahovan sa 2 × 20 mL etil acetata, a zatim koncentrisan korišćenjem rotacionog sistema za vakuumsko isparavanje na 35 ◦C. Glavni proizvod je prečišćen preparativnom HPLC koristeći Waters C18 kolonu (SymmetryPrep 150 × 19 mm, veličina čestica 7 µm) sa istim uslovima LC gradijenta koji su korišteni gore i brzinom protoka od 5 mL/min. Pik na sobnoj temperaturi bio je između 38,8 i 40,8 min, prikupljen između 39,2 i 40,2 min; ukupna sakupljena zapremina je liofilizovana da bi se dobilo 27 mg jedinjenja. MS i NMR 1H i 13C su ga zatim identifikovali.

Analize su izvršene sa sistemom brze rezolucije LC 1200 serije pomoću detektora diodnog niza (DAD) koji se koristi za praćenje UV spektra na 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Odvajanje jedinjenja izvedeno je na Beckman C18 koloni (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, veličina čestica 5 µm) koristeći 47 min gradijent od 10 mM amonijum acetata/0,2 posto mravlje kiseline u vodi (v/v), pH 2,9 ({{ 13}}rastvarač A) i mješavina acetonitrila/metanola 30/70 (=rastvarač B). Brzina protoka je bila 0,8 mL/min, a rastvarač B je povećan sa 5 na 35 procenata za 45 minuta i ponovo ekvilibrisan tokom 2 min. U seriji sa DAD, serija ESI-QTOF 6520 (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD) korištena je za MS visoke rezolucije i ciljane tandem MS (MS/MS) analize. Spektri su dobijeni u načinu akvizicije negativne i visoke rezolucije (4 GHz).

1H NMR i 13C NMR spektri su snimljeni na spektrometru Bruker Avance 300 koji radi na 300 MHz. Slobodni indukcijski raspadi su obrađeni sa MestreNova 5.3.2 NMR paketom iz MestreLab Research SL.

2.5. Statistička analiza

Svi nezavisni eksperimenti izvedeni su u tri primjerka. Svi podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD. Koristeći verziju 6 programa GraphPad Prism, rezultati su analizirani korištenjem neparametarskog Kruskal-Wallis testa zajedno sa Dunnovim testom višestrukog poređenja. P-vrijednosti 0.05 i niže se smatraju značajnim.

3. Rezultati i diskusija

3.1. Ukupni sadržaj fenola i flavonoida u metanolnim ekstraktima

Zbog svojih redoks svojstava, otkriveno je da biljni fenolni spojevi imaju različite biološke učinke, uključujući antioksidativno djelovanje [21]. Tabela 1 prikazuje ukupan sadržaj fenola u ekstraktima metanolnog korijena (500 µg/mL) osjetljivih sorti ghagras Bouffegous inficiranih (BI) i neinficiranih (BNI) FoA ili otpornih kao Taabdount (TAAR). Njihova koncentracija je varirala od 171 ± 14 do 253 ± 47 mg ekv. galne kiseline/g. Najveća količina ovih spojeva pronađena je u sorti BNI, dok je najmanja koncentracija bila u metanolnom ekstraktu korijena BI. Broj flavonoida u tim istim ekstraktima (Tabela 1)) varirao je od 240 ± 25 do 406 ± 66 mg kvercetina ekv./g, a opet najveća količina pripisana je sorti BNI. Postoji gubitak približno 1/3 količine ukupnog broja polifenola i flavonoida između neinficiranih (BNI) sorti i inficiranih (BI) ili rezistentnih (TAAR) sorti na FoA. Stoga je važno provjeriti kako gubitak spojeva, opisanih kao kritičan za antioksidativni kapacitet biljke, može utjecati na biološke aktivnosti koje nas zanimaju.

3.2. Antioksidativni potencijal metanolnih ekstrakata

Aktivnost uklanjanja radikala DPPH je metoda koja se široko koristi za ispitivanje antioksidativne aktivnosti biljnih ekstrakata [22]. Ovaj test utvrđuje da li su antioksidativne hemikalije koje se nalaze u ekstraktima sposobne da uklone stabilne radikalne vrste DPPH. Eksperimentalni podaci (Slika 1) otkrivaju da će svi metanolni ekstrakti (na 100 ili 500 µg/mL) vjerovatno imati učinak uklanjanja slobodnih radikala s najvećim aktivnostima čišćenja DPPH uočenim u korijenima TAAR (87,0 postotak inhibicije DPPH). Čini se da antioksidativna aktivnost ne zavisi od prisustva ukupne količine polifenolnih ili flavonoidnih jedinjenja. Međutim, bolja aktivnost metanolnih ekstrakata korijena TAAR-a može biti posljedica više komponenti koje doniraju vodonik sadržanih u ekstraktu.

Snaga redukcije se procjenjuje sposobnošću metanolnog ekstrakta da transformiše Fe (III) u Fe (II). Ova sposobnost redukcije Fe (III) može se pripisati broju i položaju hidroksilnih grupa prisutnih u fenolnim spojevima i njihovom kapacitetu da doniraju vodonik [23]. U tabeli 2 prikazana je redukciona aktivnost metanolnih ekstrakata naših biljnih uzoraka u poređenju sa askorbinskom kiselinom kao standardom. Metanolni ekstrakti TAAR korena sadrže visoke redukcije (95 ± 1 mg ekv. askorbinske kiseline/g), dok je najmanji sadržaj dobijen iz ekstrakta korena BNI (27 ± 2 mg ekv. askorbinske kiseline/g).

Za korelaciju dobijenih rezultata (koeficijent korelacije (R)) izvršena je regresiona analiza. Pronađene su značajne linearne korelacije između ukupnog sadržaja fenola i flavonoida (R {{0}}}.849, p < 0.05) i između DPPH i testa smanjenja snage (R=0. 816, p < 0,05), ali ih nije bilo između sadržaja fenola ili flavonoida u metanolnim ekstraktima i njihovih antioksidativnih aktivnosti. Konačno, svi metanolni ekstrakti su pokazali značajne antioksidativne aktivnosti protiv aktivnosti uklanjanja radikala DPPH i analize smanjenja snage, ali ove antioksidativne aktivnosti izgleda nisu povezane sa ukupnim sadržajem fenola ili flavonoida. Stoga, ovi nalazi impliciraju da je određena vrsta hemikalije, a ne količina fenolnih ili flavonoidnih jedinjenja koja se nalaze u našim raznovrsnim ekstraktima, najvjerovatnije odgovorna za antioksidativnu aktivnost biljnih ekstrakata koji se razmatraju. Nekoliko fenolnih komponenti koje su prethodno opisane i koje su vrlo aktivne osobe također mogu imati utjecaj na antioksidativno djelovanje biljnih ekstrakata: neovisno o njihovoj koncentraciji, fenolna jedinjenja koja se nalaze u odležanom crnom vinu mogu pokazati različita antiradikalna svojstva povezana s njihovim strukturnim aspektima [ 24].

Sorta otporna na TAAR FoA pokazuje najveću antioksidativnu aktivnost među različitim vrstama hurminih palmi. Pozivajući se na literaturu, razvoj rezistencije kod ovih hurminih palmi može se pripisati povećanju količine različitih pozicionih izomera kafeoil šikiminske kiseline [5].

3.3. Aktivnost tirozinaze gljiva

Aktivnost tirozinaze difenolaze iz gljiva katalizira oksidaciju dva derivata dopakinona što dovodi do sinteze melanina. Rezultati predstavljeni u tabeli 3 pokazuju sposobnost jedinjenja prisutnih u metanolnim ekstraktima TAAR, BI i BNI da ometaju hidroksilaciju l-DOPA kroz inhibiciju aktivnosti tirozinaze pečuraka. Nadalje, ovi rezultati pokazuju da je metanolni ekstrakt TAAR-a statistički aktivniji od ekstrakata BI (p < 0.05) i BNI (p < 0,05) na aktivnost tirozinaze gljiva. Dakle, čini se da kapacitet ekstrakta korijena palme da inhibira aktivnost tirozinaze slijedi isti trend kao i kod antioksidativnih sposobnosti.

Tirozinaze su prvenstveno povezane s pigmentacijom kože, očiju i kose. Zaista, tirozinaze su enzimi melanogeneze uključeni u prve korake biosinteze melanina, a melanin je povezan sa zaštitom od ultraljubičastog (UV), sunčevog ili gama zračenja, smanjenom ćelijskom osjetljivošću i otpornošću ćelijskog zida na hidrolitičke enzime [20]. Suprotno tome, prekomjerna proizvodnja melanina može igrati ulogu u anomalijama kože ili ozbiljnijim bolestima kao što je rak (npr. melanom), a višak dopakinona može dovesti do neurodegenerativnih bolesti (npr. Parkinsonove bolesti) [20,25]. Štaviše, prijavljeno je da melanogeneza proizvodi vodikov peroksid i druge ROS, izlažući ljudske melanocite visokim razinama oksidativnog stresa [26]. Nekoliko prirodnih antioksidativnih spojeva (fenoli, flavonoidi i drugi) dobiveni iz biljaka inhibirali su aktivnost tirozinaze fenolaze [27,28]. Ovdje se čini da TAAR ekstrakt sadrži spoj(e) osjetljiv na inhibiciju starenja kože i melanogenezu.

3.4. Proteazomska aktivnost metanolnih ekstrakta palminog korijena

Prijavljeno je da povišeni nivoi 20S proteasoma dovode do povećane tolerancije na oksidativni stres [13]. Stoga je ispitivana regulacija aktivnosti proteasoma ekstraktima korijena sorti BI, BNI i TAAR. Izmjerena aktivnost proteasoma 20S povezana je sa aktivnošću nalik na kimotripsin (CT-L) u ćelijama starijim od NHDF (pogledajte Materijali i metode). Kao što je ilustrovano na slici 2A, ćelije tretirane sa 50 µg/mL metanolnih ekstrakata tokom 24 sata pokazale su značajnu aktivaciju CT-L za BI i TAAR ekstrakte i inhibiciju za BNI bez stvaranja više od 30 procenata toksičnosti ćelija. Ekstrakt korijena TAAR-a pokazao je zanimljivu aktivaciju proteasoma u poređenju sa aktivacijom od 1 µM lipoične kiseline (Ct plus) (212 posto i 248 posto, respektivno). Proteasom je cilindrični proteinazni kompleks koji sadrži jezgro od četiri naslagana prstena odgovorna za uklanjanje abnormalno degradiranih (26S) proteazoma i oksidativno (20S proteolitičko jezgro kompleksa) oštećenih proteina (Ciechanover, 1998). Kao što je predstavljeno u Hwangovom radu [29], disfunkcija proteasoma može doprinijeti starenju ljudske kože. Zaista, pokazalo se da starenje i replikativne starenje ćelija imaju smanjenu aktivnost proteasoma, kao i nivoe proteina u podjedinicama proteasoma. Činjenica da se i oksidirani i/ili oštećeni ćelijski proteini češće akumuliraju u ovim stanicama sugerira da je ubikvitin-proteasomski put degradacije proteina umiješan u intrinzične procese starenja. Slike 2B i C pokazuju sposobnost TAAR metanolnog ekstrakta da zaštiti ćelije stare NHDF od inhibicije aktivnosti 20S proteazoma OCl− oksidansom. Zaista, OCl− oksidans inhibira 50 posto proteazomsku aktivnost kontrolnih stanica (Ct), dok najviši 20S-proteazomski aktivator (lipoična kiselina na 1 µM, Ct plus) s više od 50 posto aktivnosti inhibicije ne uspijeva preokrenuti inhibiciju aktivnosti proteasoma 20S od strane OCl−, dok se čini da sve druge testirane koncentracije (15, 50 i 75 µg/mL) TAAR metanolnog ekstrakta poništavaju ovu inhibiciju (0 do 19 posto inhibicije). Ovi rezultati sugeriraju da ekstrakti korijena TAAR-a mogu sadržavati molekule koje bi mogle odgoditi starenje kože ne samo povećanjem aktivnosti proteasoma već i suprotstavljanjem inhibirajućim efektima oksidirajućih agenasa. Među ovim molekulima najvjerovatnije je prisutna kofeoil šikiminska kiselina, kao i druga jedinjenja. Dalje, LC-DAD-MS (MS) i NMR analize su sprovedene da bi se identifikovala glavna jedinjenja ekstrakata i o njima se raspravlja u sledećem odeljku.

3.5. Spektrometrijske analize

3.5.1. LC-DAD-MS analiza metanolnih ekstrakata

Komparativna studija korijena urmene palme nije otkrila kvalitativne razlike, ali su, umjesto toga, u određenoj mjeri uočene polukvantitativne razlike (u DAD i MS hromatogramima) između sorti (Slika 3A, D). Zaista, sadašnji rezultati ne dopuštaju vezu između otpornosti hurminih palmi na povećanje količine različitih pozicionih izomera kafeoil šikiminske kiseline jer rezistentna sorta (TAAR) pokazuje najmanju relativnu zastupljenost ovih spojeva (slika 3C). Sva tri poziciona izomera kafeoil šikiminske kiseline (m/z=335.0768 sa greškom od 1,2 ppm) identifikovana su njihovim MS/MS spektrima (slika S6) sa fragmentom na m/z 179,0340, što odgovara fragmentu kofeinske kiseline A (C9H7O4) i fragmentu na m/z 135,0443, što odgovara dekarboksilaciji kafeinske kiseline (C8H7O2). Ipak, još jedno jedinjenje koje ne odgovara kofeoil šikiminskim kiselinama (slika 3C) i čije je vrijeme zadržavanja 29 minuta sa m/z=259.0607 (ili 373.0543 za TFA adukt), čini se da se jasno razlikuje između različitih sorti (Slika 3D). Razlika u akumulaciji ovog jedinjenja u korijenu osjetljivih i rezistentnih sorti (0,135 posto), s omjerom oko 1:35 (iz m/z=259.06, MS podaci), mogla bi objasniti istaknuti biološki aktivnosti uočene za metanolni ekstrakt ovog korijena.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】