Sistem glioksalaze u bolestima vezanim za starenje: nutritivna intervencija kao strategija protiv starenja, 1. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Sistem glioksalaze je kritičan za detoksikaciju naprednih krajnjih produkata glikacije (AGE). AGE su toksična jedinjenja koja su rezultat neenzimske modifikacije biomolekula šećerima ili njihovim metabolitima kroz proces koji se naziva glikacija. AGE imaju štetne efekte na mnoga tkiva, igrajući patogenu ulogu u napredovanju molekularnog i ćelijskog starenja. Zbog opadanja različitih anti-AGE mehanizama, uključujući mehanizme detoksikacije i proteolitičke kapacitete, zbog starenja, glikirani biomolekuli se akumuliraju tokom normalnog starenja u našem tijelu na način koji ovisi o tkivu. Gledano na ovaj način, anti-AGE sistemi za detoksikaciju su predloženi kao terapijski ciljevi za borbu protiv patološke disfunkcije povezane sa akumulacijom AGE i citotoksičnošću. Ovdje sumiramo trenutno stanje znanja u vezi sa zaštitnim mehanizmima protiv stresa glikacije, s posebnim naglaskom na sistem glioksalaze kao primarnog mehanizma za detoksikaciju reaktivnih intermedijera glikacije. Ovaj pregled se fokusira na glioksalazu 1 (GLO1), prvi enzim glioksalaznog sistema i enzim koji ograničava brzinu ovog katalitičkog procesa. Iako je GLO1 sveprisutno izražen, nivoi i aktivnosti proteina su regulisani na način koji zavisi od tkiva. Pružamo komparativnu analizu GLO1 proteina u različitim tkivima. Naši nalazi ukazuju na ulogu sistema glioksalaze u homeostazi u retini oka, visoko oksigeniranom tkivu sa brzim prometom proteina. Takođe opisujemo modulaciju glioksalaznog sistema kao terapeutski cilj za odlaganje razvoja bolesti povezanih sa starenjem i sumiramo literaturu koja opisuje trenutna saznanja o nutritivnim jedinjenjima sa svojstvima za modulaciju sistema glioksalaze.

Ključne riječi:stres glikacije; sistem glioksalaze; starenje; proteotoksičnost

Molimo kliknite ovdje da saznate više

1. Uvod: Glikativni stres i nezdravo starenje

Sve veći broj literature ukazuje da je nakupljanje oštećenih proteina specifično obilježje starenja i mnogih bolesti povezanih sa starenjem, uključujući dijabetes tipa 2, rak, neurodegenerativne, kardiovaskularne i poremećaje povezane s očima [1-7]. Aberantni proteini narušavaju ćelijsku homeostazu formiranjem nefunkcionalnih i toksičnih agregata i to dovodi do inaktivacije ne samo aberantnog proteina, već može narušiti i funkciju drugih esencijalnih proteina zbog stresa na – ili nedovoljnosti – mašinerije za kontrolu kvaliteta proteina. u ćeliji. Jedan istaknuti mehanizam koji dovodi do aberantnih molekula je modifikacija krajnjih produkata napredne glikacije (AGE).

Nastaju dikarbonilna jedinjenja

iz različitih metaboličkih puteva (Slika 1) koji uključuju metabolizam šećera i ugljikohidrata u ishrani kako bi se formirale AGE. Ova dikarbonilna jedinjenja stupaju u interakciju s biomolekulama, kao što su proteini, lipidi i nukleinske kiseline u neenzimskoj posttranslacijskoj modifikaciji zvanoj glikacija. Glavni glikirajući dikarbonil agensi su metilglioksal (MG), glioksal ili 3-deoksiglukozon [8]. Ovi dikarbonili se održavaju na niskim nivoima u homeostatskim uslovima, ali proces starenja povećava ove glikirajuće reagense do patoloških nivoa, povećavajući stvaranje toksičnih AGE i, na kraju, ugrožavajući sposobnost tkiva. S obzirom na to da formiranje AGE ovisi o koncentraciji glukoze, konzumacija visokoglikemijskih dijeta ili dijabetičkih stanja dovodi do dramatične sistemske akumulacije AGE. Ovo je u direktnoj korelaciji s promijenjenim metabolizmom, povećanom upalom i napredovanjem teških zdravstvenih stanja. Suprotno tome, uzimanje dijeta sa niskim glikemijskim indeksom ograničava akumulaciju AGE i povezano je sa sporijim napredovanjem nekih od ovih bolesti [9-13]. U tom kontekstu, hiperglikemija nameće dodatni stres na proizvodnju glikovanih proteina povezanu sa godinama i pogoršava štetne posljedice depozita AGE na funkciju organa.

Slika 1. Šematski dijagram formiranja -dikarbonila i puteva detoksikacije protiv oštećenja uzrokovanih AGE starenjem. Formiranje visoko reaktivnih -dikarbonila kao što je metilglioksal (MG) odvija se kroz neenzimsku degradaciju glikolitičkih intermedijera, uključujući dihidroksiaceton fosfat i gliceraldehid 3-fosfat i druge izvore, uključujući metabolizam aminokiselina i lipida. Kako bi se izbjeglo oštećenje AGE, sistem glioksalaze je primarni mehanizam koji ograničava sintezu AGE, pretvarajući visoko reaktivne biomolekule, kao što je MG, u manje reaktivne biomolekule (D-laktat). Ovaj proces uključuje sekvencijalnu aktivnost dva enzima GLO1 i GLO2 i redukovanog oblika glutationa (GSH). Drugi mehanizmi detoksikacije podrazumijevaju aktivnost DJ-1, aldehid dehidrogenaza (ALDH), aldo-keto reduktaza (AKR) i enzima degradacije acetoacetata. Jednom formirane, AGE se mogu očistiti pomoću dva proteolitička puta: ubikvitin-proteasomskog (UPS) sistema i autofagije. Ovi zaštitni mehanizmi (označeni zelenom bojom) opadaju sa starenjem i doprinose nastanku bolesti povezanih sa starenjem kao što su neurodegeneracija, bolesti oka (AMD, katarakta, DR), nefropatije, metabolički sindrom i rak. GLO1: glioksalaza 1; GLO2: glioksalaza 2; GSH: glutation.

Cistanche može protiv starenja

Prekomjerni stres glikacije potiče netopivost proteina, deregulirajući signalizaciju i puteve kontrole kvalitete proteina. Promjene proizašle iz AGE u signalnim putevima proteoma remete signalne puteve u fiziologiji tkiva (MAP/ERK, JAK-STAT i PI3K-AKT putevi) koje dovode do nuklearne translokacije faktora transkripcije uključenih u višestruke ćelijske funkcije, uključujući upalu, apoptozu, ER stres , autofagija, oksidativni stres, mitohondrijalna funkcija, itd. (pregledano u [2,14]). Glikirani proteini također mogu preopteretiti ili ograničiti funkcionalnost proteolitičkih kapaciteta. Ove promjene u konačnici doprinose nastanku višestrukih poremećaja povezanih sa starenjem.

Višestruke studije su pokazale da je formiranje MG i MG izvedenih AGE važan faktor u patogenezi dijabetesa i njegovih komplikacija, kao što su retinopatija, nefropatija i neuropatija [15-19]. Dikarbonil stres je također doprinoseći medijator gojaznosti i kardiovaskularnih bolesti [20,21]. MG može doprinijeti aterosklerozi kroz nekoliko mehanizama, uključujući akumulaciju AGE-ova izvedenih iz MG u aterosklerotskim plakovima [22] i MG-indukovanu glikaciju lipoproteina niske gustine [23]. Povezanost između MG i hipertenzije je također uočena u nekoliko studija, pokazujući povećane razine MG u tkivima aorte i bubrega [24,25]. Nekoliko studija je također potvrdilo da je akumulacija AGE u korelaciji s mnogim neurodegenerativnim poremećajima, što utiče na funkciju mozga, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i šizofrenija [26-28]. Jedan od najboljih primjera veze između akumulacije AGE i posljedica starenja javlja se u tkivima oka koji rezultiraju poremećajima očnog tkiva uzrokovanim glikacijom, kao što su katarakta, starosna makularna degeneracija (AMD) i dijabetička retinopatija (DR)[{ {15}}]. Što se tiče katarakte, vodećeg uzroka sljepoće širom svijeta, kristalini sočiva postaju progresivno žuto-smeđi pigmentirani s godinama kao rezultat akumulacije nusprodukata AGE [31]. Kao i sočivo, AGE retine povećavaju se s godinama i dijabetesom, posebno u vanjskoj mrežnici. AMD je vodeći uzrok sljepoće kod starijih osoba u razvijenim zemljama. Viši nivoi AGE su pronađeni kod pacijenata sa AMD u poređenju sa kontrolnim subjektima, kao i kod AMD mišjih modela [32-36]. DR karakterizira nakupljanje AGE u retini, izazivajući mikrovaskularno oštećenje [37].mikronizirana pročišćena frakcija flavonoida 1000 mg koristiOve patološke promjene rezultiraju nepovratnim oštećenjem krvno-retinalne barijere i makularnim edemom, što u konačnici rezultira gubitkom vida. Ukratko, AGE se akumuliraju u cijelom tijelu tokom starenja, posebno kod pacijenata sa dijabetesom. Ovo ugrožava homeostazu organizma i doprinosi nastanku i napredovanju mnoštva bolesti povezanih sa starenjem.

Postoji više sistema za detoksikaciju AGE. To uključuje sistem glioksalaze, najbolje okarakteriziran mehanizam za inhibiciju stvaranja AGE-a, i jedan od puteva koji mogu detoksicirati međuprodukte glikacije. Međutim, anti-AGEs kapaciteti opadaju sa godinama, što dovodi do ubrzanog nakupljanja AGE u "normalnim starijim tkivima". Iako postoje različiti odbrambeni mehanizmi za ograničavanje akumulacije AGE u tkivima, njihovo razvijanje kako bi se spriječilo nakupljanje AGE i povezane patologije još uvijek se ne koriste [38]. U sljedećem odjeljku sumiramo trenutnu literaturu o mehanizmima detoksikacije koji se fokusiraju na sistem glioksalaze za smanjenje nagomilavanja ovih toksičnih nusproizvoda u ćelijama i tkivima. Na kraju, raspravljamo o korisnosti nutritivnih intervencija za jačanje sistema glioksalaze kao strategije protiv starenja.

2. Mehanizmi detoksikacije protiv glikativnog stresa: glavna uloga sistema glioksalaze

Prijavljeni su višestruki mehanizmi detoksikacije protiv akumulacije AGE. Slika 1 je šematski pregled formiranja -dikarbonila i različitih puteva detoksikacije protiv oštećenja uzrokovanih AGE-om u starenju. Glavni putevi sinteze AGE uključuju reakciju reaktivnih dikarbonila nastalih uglavnom iz metabolizma glukoze s primarnim aminima (N-terminalni ili lizinski bočni lanac) ili gvanidin grupom bočnog lanca arginina [39]. Formiranje visoko reaktivnih -dikarbonila, kao što je MG, odvija se kroz metabolizam glikolitičkih intermedijera, kao što su dihidroksiaceton fosfat i gliceraldehid 3-fosfat, i drugih izvora, uključujući metabolizam aminokiselina i lipida.

AGE su ireverzibilne i, kada se jednom formiraju, mogu se eliminisati samo proteolitičkim putevima [5,9,40,41]. Predlaže se da dva glavna proteolitička kapaciteta doprinose uklanjanju AGEs: ubikvitin-proteazomski sistem (UPS) i autofagni lizozomalni proteolitički sistem (ALPS)[5,9,40,41](Slika 1). UPS radi uglavnom na rastvorljivim pogrešno savijenim proteinima. U UPS-u, supstrati se prepoznaju i označavaju ubikvitinom i ciljaju na proteasom radi razgradnje. ALPS se sastoji od usmjeravanja tereta na lizozomski odjeljak radi razgradnje. Autofagični teret može biti raznolik, uključujući netopive proteine, proteinske agregate, pa čak i cijele organele. Oba proteolitička puta su funkcionalno kooperativna i sve veći broj literature podržava preslušavanje između dva puta sa recipročnim direktnim i indirektnim interakcijama[42-46]. Ovo preslušavanje garantuje rezervni mehanizam i, u slučaju nedostatka jednog od puteva, drugi proteolitički put teži da nadoknadi održavanje pravilnog i funkcionalnog proteoma [47].

Promjene u stopama razgradnje proteina povezane sa godinama su dokumentovane za mnoga tkiva prije više od 3 decenije, čak i prije nego što je definirana molekularna karakterizacija proteolitičkih puteva [48]. Danas se bolje razumije molekularni i ćelijski pad dva glavna proteolitička puta s godinama i postoje razlike u stupnjevima smanjenja između UPS i lizozomalnog sistema. Mnogi izvještaji su pokazali opadanje UPS ovisno o tkivu, dok se čini da je autofagni pad univerzalan (pregledano u [49-51). Što se tiče autofagije, i lizosomski i autofagosomalni kompartmenti prolaze kroz upečatljive modifikacije. Promjene koje doprinose kvaru autofagije uključuju smanjenje stabilnosti lizosoma, aktivnost hidrolaze, nakupljanje neprobavljivog materijala (lipofuscina) u lumenu lizosoma, disfunkcionalni pH lizosoma, smanjen nivo transkripcije proteina povezanih s autofagijom, smanjenu stabilnost šaperona koji je u mediju. autofagijski receptor LAMP2A u lizozomalnoj membrani i smanjena povezanost motornih proteina u autofagnim odjeljcima ([49,51,52]). Za razliku od autofagije, sada je prihvaćeno da su promjene u proteolitičkim sposobnostima proteazoma s godinama više kvalitativne nego kvantitativne.oteflavonoidPromene u sastavu katalitičkih aktivnosti proteazomskog jezgra i modulatornih podjedinica, smanjena ekspresija proteasoma, kao i promene u oksidacionom stanju proteazomskih podjedinica i proteazomskih supstrata, doprinose inhibiciji UPS kapaciteta u zavisnosti od starosti (pregledano u [53 ,54). U nekim slučajevima može postojati samo nedovoljan kapacitet proteolitičkih sistema da se nose sa opterećenjem. Nažalost, efikasnost ova dva mehanizma opada sa godinama, što rezultira nedovoljnim kapacitetom za prepoznavanje i uklanjanje oštećenih proteina i, prema tome, intracelularno nakupljanje proteinskih agregata i disfunkcionalnih organela [55,56]. Neto nivoi AGE su određeni balansom brzine sinteze ili formiranja i brzine uklanjanja. Neposredna posljedica pada proteolitičkog kapaciteta je nakupljanje dugovječnih proteina u ostarjelim organizmima, od kojih mnogi akumuliraju oštećenja uzrokovana glikacijom u svojim aminokiselinskim sekvencama. Akumulacija AGE-a se dešava na način koji zavisi od starosti i zavisi od starosti ([4,9]), a nedavna proteomska analiza u istraživanju starenja je otkrila da biologija AGE sadrži obogaćen metabolički put povezan sa proteomima povezanim sa starenjem [57].

Iako UPS i ALPS opadaju s godinama, postoje različiti zaštitni putevi koji mogu smanjiti sintezu AGE. U ovom pregledu fokusiramo se na ove zaštitne mehanizme koji ograničavaju biogenezu AGE, sa posebnim naglaskom na sistem glioksalaze, primarni put za detoksikaciju reaktivnih dikarbonila [58]. U ovom odeljku ćemo detaljno opisati sistem glioksalaze. Također ukratko opisujemo druge mehanizme u detoksikaciji AGE-a: protein DJ-1 povezan s Parkinsonom, aldehid dehidrogenaze (ALDH), Aldo-keto reduktaze (AKR) i degradacija acetoacetata.

2.1. Sistem glioksalaze: Glavni put detoksikacije za reakcijske dikarbonile

Ogromna literatura podržava sistem glioksalaze kao glavni put detoksikacije za reaktivne dikarbonile u citosolu svih ćelija sisara [58]. Sistem glioksalaze je najbolje okarakterisan put za metabolizam MG. Geni za glioksalaze su evolucijski očuvani i široko rasprostranjeni u različitim živim sistemima, kao što su ljudi, biljke, kvasac, bakterije, gljive i protisti. Prisustvo u mnogim raznolikim taksonima ukazuje na veliki značaj enzima glioksalaze u fiziološkoj funkciji biološkog života. Kombinovane aktivnosti glioksalaza 1 i 2 (GLO1, GLO2) kataliziraju konverziju reaktivnih, acikličkih -oksoaldehida u odgovarajuće -hidroksi kiseline [58]. Ove reakcije također zahtijevaju katalitički GSH. U početnom koraku, GLO1 pretvara svoj supstrat, hemitioacetal, nastao spontanom reakcijom aldehida dikarbonil MG i GSH, u SD-laktoilglu tron. Zatim, GLO2 hidrolizira SD-laktoilglu tation u D-laktat i reformiše GSH (Slika 1).puritanski vitamin cAktivnost GLO1 je direktno proporcionalna koncentraciji GSH. Aktivnost GLO1 se smanjuje kada se GSH ukloni, kao što je oksidativni stres kada se GSH pretvara u GSSG [59].

MG nastaje tokom glikolize i glukoneogeneze razgradnjom dihidroksiaceton fosfata i gliceraldehid 3-fosfata, kao i katabolizmom treonina, oksidacijom ketonskih tijela i razgradnjom glikovanih proteina. Ovim putem se metaboliziraju i drugi supstrati, uključujući glioksal, fenilglioksal i hidroksipiru aldehid [60]. GLO1, enzim koji ograničava brzinu u sistemu glioksalaze, katalizira primarni korak detoksikacije [61], tako da je promjena GLO1 proteina uključena u mnoge patološke procese starenja, kao što su dijabetes, neurodegenerativne bolesti, rak i očni problemi. bolesti [20.

Regulacija ekspresije i aktivnosti GLO1 je složena i još uvijek nije dobro shvaćena (slika 2). Slijed promotora GLO1 sadrži element odgovora na metal (MRE), element odgovora na inzulin (IRE), ranu izoformu faktora gena 2- (E2F) i protein 2 koji se vezuje za pojačivač (AP{{10) }} ), i element antioksidativnog odgovora (ARE). Funkcija IRE i MRE potvrđena je u reporterskim testovima gdje je tretman inzulinom i cink hloridom proizveo povećan transkripcijski odgovor 62]. Slične funkcionalne aktivnosti uočene su za E2F i AP-2 [63,64]. ARE koji se nalazi u eksonu 1 Glo1 služi za spajanje Glo1 sa transkripcionim sistemom koji reaguje na stres sa eritroidnim 2-faktorom 2(NRF2) koji reaguje na stres [65]. Nekoliko gena povezanih s metabolizmom MG i zaštitom od oksidativnog stresa je pod kontrolom NRF2-ARE puta [66]. NRF2 je kompleksiran sa KEAP1, supstratnim adapterskim proteinom za kulin{29}}zavisni E2 ubikvitin ligazni kompleks, usmjeravajući NRF2 na razgradnju od strane 26S proteazoma u fiziološkim uslovima. Oksidativni stres dovodi do destabilizacije ovog kompleksa, uzrokujući translokaciju NRF2 u jezgro i pokrećući regulaciju antioksidativnih gena [67,68]. Vezivanje NRF2 za Glo1-ARE povećava bazalnu i inducibilnu ekspresiju GLO1.[65]. NRF2 i antioksidativni odgovori se takođe pojačavaju kada MG izaziva dimerizaciju KEAP-a oslobađajući Nrf2 [69].

Nekoliko studija pokazuje da NRF2 povećava aktivnost GLO1 i ublažava intracelularni MG stres; stoga je modulacija GLO1 od strane NRF2 agonista rezultirala smanjenjem proteinskih adukata izvedenih iz MG i MG u ćelijama i tkivima [70-73]. Štaviše, Glol mRNA i proteini jetre, mozga, srca, bubrega i pluća smanjeni su kod NRF2 nokaut miševa [65]. Sve u svemu, ovi izvještaji sugeriraju da je GLO1 nizvodna meta pomoću koje put NRF2/KEAP1 obavlja svoje zaštitne funkcije smanjujući MG i dikarbonil stres. Međutim, inflamatorna aktivacija NF-kB (nuklearni faktor kB) sa NRF2 smanjuje ekspresiju Glola [74]. Ekspresiju sjaja takođe negativno reguliše HIFl (faktor l koji izaziva hipoksiju) u hipoksičnim uslovima, važan fiziološki pokretač dikarbonilnog stresa [75].

Pored transkripcione regulacije, postoji i posttranslaciona regulacija GLO1 proteina (slika 2). GLO1 je acetiliran citosolnim sirtuinom-2[76,77], a njegova ekspresija može biti smanjena aktivacijom RAGE (receptora za krajnje proizvode napredne glikacije); međutim, ovi mehanizmi nisu jasno shvaćeni [78].sistancheNedavna studija je pokazala da GLO1 protein može biti modifikovan fosforilacijom treonina 107 (T107) i nitrozilacijom cisteina 139 [79]. U ovoj studiji, fosforilacija T107 pomoću kalmodulin-zavisne kinaze II delta u GLO1 proteinu prijavljena je kao precizan mehanizam koji reguliše sistem glioksalaze. Konkretno, fosforilacija GLO1 na T107 utiče na kinetičku efikasnost detoksikacije MG i brzinu proteazomske degradacije. Stoga je njegov izmijenjen status povezan s razvojem bolesti povezanih sa starenjem [79].

Slika 2. Mehanizmi regulacije glioksalaze 1(GLO1). Aktivnost GLO1 može se regulisati kroz više mehanizama, uključujući regulaciju transkripcije i posttranslacijske modifikacije. Glo1 promotor sadrži različite regulatorne elemente, kao što su antioksidativni odgovor (ARE), elementi odgovora na metal (MRE) i insulinski odgovor (IRE), te mjesta vezivanja za AP-2 i E2F. U normalnim uvjetima, nuklearni faktor eritroidni 2-povezan faktor 2 (NRF2) je u kompleksu sa KEAP1, supstratnim adapterskim proteinom za kulin-3-zavisni E2 ubikvitin ligazni kompleks, usmjeravajući NRF2 na razgradnju od strane ubikvitin-proteasomskog sistema (UPS). Oksidativni stres dovodi do destabilizacije kompleksa NRF2-KEAP1, uzrokujući odvajanje NRF2 koji se translocira u jezgro što pokreće regulaciju različitih antioksidativnih gena. Vezivanje NRF2 za Glo{22}}ARE povećava ekspresiju GLO1. U uslovima hipoksije, ekspresija sjaja je obrnuto regulisana faktorom 1 koji izaziva hipoksiju (HIFlx). Različite post-translacijske modifikacije u citosolu mogu utjecati na stabilnost GLO1.

2.2. Alternativni mehanizmi detoksikacije kao pretpostavljeni rezervni sistemi za kompenzaciju nedostatka aktivnosti glioksalaze

Dok je primarni mehanizam za detoksikaciju reaktivnih dikarbonila u sistemu glioksalaze, postoje alternativni putevi sa kapacitetom za detoksikaciju dikarbonila nastalih tokom metabolizma šećera. To uključuje ALDH, AKR, protein DJ-1 povezan s Parkinsonom i čišćenje acetoacetatom da nastane 3-hidroksi heksan-2,5-dion (3-HHD )[80]. Fiziološki značaj ovih sistema ostaje nejasan i postavlja se pitanje da li su ovi enzimi ključni za detoksikaciju AGE u tkivima zbog visoke aktivnosti sistema glioksalaze. Čini se da su komponente rezervnih sistema koji rade u odsustvu aktivnosti glioksalaze iako se uloga ovih puteva zavisna od tkiva ne može odbaciti.

DJ-1, također poznat kao protein Parkinsonove bolesti 7 (PARK7), igra bitnu ulogu u Parkinsonovoj bolesti (PD). Pokazalo se da nedostatak funkcionalnog DJ-1 proteina uzrokuje autozomno recesivnu PD [81,82]. Prijavljeno je da DJ-1 ima dvije različite aktivnosti: (1) aktivnost glioksalaze in vitro, pretvaranje MG u laktat i sprječavanje oštećenja tkiva izazvanog MG kod Caenorhabditis elegans [83], i (2) aktivnost deglikaze in vitro, smanjenje nusprodukti MG u ranoj fazi [84]. Nedavno su i druge studije pokazale da DJ-1 igra relevantnu ulogu u DNK deglikazi [85-87].šta je cistancheSposobnost detoksikacije DJ-1 u odsustvu glutationa (GSH) čini ovo alternativnim putem za sistem glioksalaze, koji zahtijeva prisustvo GSH. Međutim, Pfaff i saradnici, koristeći i DJ-1 knockdown u ćelijama Drosophila i DJ-1 nokaut u cijelom organizmu, nisu primijetili nikakve razlike u akumulaciji adukata MG proteina [88].

AKR su superfamilija proteina koji mogu reducirati aldehide i ketone u primarne i sekundarne alkohole. AKR metaboliziraju MG u hidroksi aceton ili laktaldehid. Neke studije su pokazale da transgena ekspresija aldo-keto reduktaze i kod ljudi i kod miša u ćelijama fibroblasta glodara štiti od oštećenja izazvanih MG, sugerirajući da AKR mogu učestvovati u detoksikaciji MG i smanjenju nivoa AGE [89-91]. Visoka aktivnost AKR1B3 otkrivena je u Glo1 nokautiranim mišjim Schwann ćelijama, kao i povećana ekspresija tokom izlaganja MG, što sugerira da bi to mogao biti kompenzacijski mehanizam izazvan nedostatkom sistema glioksalaze ili pretjeranim stresom glikacije [92]. Zanimljivo je da je nedostatak AKR1B3 rezultirao višim nivoima MG i AGE u srcima dijabetičkih miševa [91].

LED diode su još jedna grupa enzima koji metaboliziraju -dikarbonil koji oksidiraju MG u piruvat. Ekspresija ALDH je povećana u mišjim Schwann ćelijama divljeg tipa nakon tretmana MG [92]. U modelu zebrice, glo1 nokaut riba je pokazala da indukovana aktivnost ALDH nadoknađuje nedostatak GLO1 [93]. Međutim, barem kod miševa, kompenzacijski mehanizmi su zavisni od tkiva, jer je povećana ekspresija AKRs i ALDH uočena u tkivu jetre, ali su samo AKRs prijavljeni u bubrezima kod Glo1 nokaut miševa [94]. U studijama na ljudima, 3-DG metabolit proizveden aktivnošću aldehid dehidrogenaze 1A1(ALDH1A1) je povećan u plazmi i eritrocitima dijabetičara [92]. Nedavno je također pokazano da acetoacetat ketonskih tijela smanjuje koncentraciju MG neenzimskom reakcijom tokom dijabetičke i dijetetske ketoze [95,96]. Otkrili su da ovaj metabolički put uključuje neenzimsku aldolsku reakciju između MG i acetoacetata ketonskog tijela, što dovodi do 3-hidroksi heksana-2,5-diona, koji je prisutan u krvi pacijenata gladnih insulina. Alternativni putevi koji bi mogli nadoknaditi nedostatak sistema glioksalaze mogu potencijalno generirati toksične molekule kao što su y-diketoni, koji su povezani s perifernom degeneracijom aksona i ozljedom testisa [97,98].

Iako ne postoji sistematska analiza starenja proteina uključenih u GLO{0}}nezavisne alternativne puteve, zabilježene su promjene vezane za starenje kod tih molekularnih igrača. Na primjer, postoji korelacija između D]-1 nivoa ekspresije i oksidativnog stresa, a različiti izvještaji su pokazali povećanje DJ-1 s godinama. Nivoi DJ-1 mRNA i proteina porasli su od 8 do 20 sedmica starosti kod miševa [99], a nivoi DJ-1 značajno su porasli u zavisnosti od starosti u ljudskom cerebrospinalnoj tekućini [100]. U očnim tkivima je pokazano da je DJ-1 izražen u pigmentnom epitelu retine i fotoreceptorima, a ekspresija je povećana u starim očima [101]. To može odražavati kompenzacijski mehanizam zbog opadanja aktivnosti glioksalaznog sistema.

2.3. Aktivnost sistema glioksalaze zavisna od tkiva

Iako je GLO1 sveprisutan protein, nivoi ovog enzima su regulisani na način koji zavisi od tkiva. Kako bismo procijenili ulogu sistema glioksalaze u različitim tkivima, ispitali smo ekspresiju i aktivnost GLO1 u neočnim (jetra, mozak, srce i bubrezi) i očnim tkivima (retina, RPE/koroidea i sočivo) iz divlji tip C57BL/6] miševa. Koristeći antitijela koja specifično prepoznaju GLO1, Western blotting i imunohistohemija su izvedeni kako bi se kvantifikovali nivoi proteina. Aktivnost GLO1 u citosolnim ekstraktima određena je spektrofotometrijski kao početna stopa formiranja SD-laktoilglutationa, kao što je ranije objavljeno [30,102]. Ovi rezultati su sažeti na slici 3.

Slika 3. Komparativna analiza GLO1 proteina i aktivnosti u očnim i neočnim tkivima. (A) GLO1 aktivnost je analizirana u neočnim tkivima i tkivima retine kod WT miševa kao što je prethodno opisano [29] i aktivnost je izražena u postocima (procentima) u poređenju s jetrom. (B) Western blot analiza jetre i (C) retine reprezentativna za transgene miševe prekomerne ekspresije WT i Glow (Glo1 Tg plus / plus ) koristeći monoklonsko antitelo (nekomercijalno) i poliklonsko antitelo za Glol (komercijalno, GeneTex)[36,103,104]. (D) Reprezentativna Western blot analiza ekstrakata neokularnog tkiva (50 ug) WT miševa koristeći monoklonsko antitijelo za Glo1 (nekomercijalno) i (E) proteinsku kvantifikaciju GLO1 normalizirano za kontrolno opterećenje (Ponceau bojenje). (F) GLO1 aktivnost je izvedena u očnim tkivima (Retina, RPE/Choroid i Lens) od WT miševa kao što je prethodno opisano [29], a aktivnost je izražena kao milijedinice po miligramu proteina. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SEM. Veličina uzorka je n=4iz GLO1 proteina i testova aktivnosti.

Ranije objavljeni podaci pokazuju da mrežnica i jetra pokazuju najveću aktivnost GLO1 ([30]; Slika 3A). Imajte na umu da je aktivnost mrežnjače bila najveća vrijednost, dok su jetra, bubrezi, mozak i srce predstavljali samo 46 posto, 27 posto, 22 posto, odnosno 11 posto kapaciteta detoksikacije retine. Procijenili smo da li je aktivnost GLO1 u korelaciji sa nivoom enzima procjenom nivoa GLO1 proteina Western blottingom. Antitijelo protiv GLO1 je prethodno potvrđeno u prethodnim izvještajima i korišteno za analizu GLO1 u uzorcima retine [36,103,104]. Kao pozitivna kontrola, takođe je urađena komparativna analiza tkiva retine i jetre transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju GLO1 na pozadini C57BL/6J (B6) [105]. Da bismo ispitali nivoe GLO1, koristili smo dva različita antitela: poliklonsko zečje antitelo (komercijalno antitelo iz GeneTex-a) i monoklonsko mišje antitelo (nekomercijalno antitelo) prijavljeno na različitim životinjskim modelima za proučavanje biologije GLO1 [103,106]. Uspjeli smo otkriti GLO1 protein u tkivima divljeg tipa jetre i mrežnice pomoću Western blotinga, i pronašli smo najveću ekspresiju kod transgenih miševa u oba tkiva (slika 3B, C i dodatna slika S1). Za oba antitijela su prepoznate dvije trake. Diferencijalni elektroforetski profili ovih GLO1-pozitivnih sugerišu da bi posttranskripcione promjene mogle biti vitalne u ulozi proteina. Shodno tome, nedavna studija je pokazala da je fosforilisani GLO1 efikasniji i stabilniji, podržavajući ove post-transkripcione promene kao precizan mehanizam koji reguliše aktivnost GLO1 [79]. Međutim, postoje oskudne informacije o tome kako post-transkripcione modifikacije moduliraju aktivnost glioksalaze 1.

As expected, we found GLO1 protein in all non-ocular tissues analyzed, with the liver showing the highest expression. The relative order of GLO1 expression was liver>kidney>brain>srce (Slika 3D, E). Ovo potvrđuje rezultate prethodne studije[30]. Postoje ograničene informacije o ulozi GLO1 u očnim tkivima. Kao što smo ranije objavili, enzimski test je otkrio da je aktivnost GLO1 ~10 puta veća u retini u poređenju sa sočivom ili RPE/koroidom (Slika 3F, [30]). Prekomjerna ekspresija glioksalaze I poboljšava preživljavanje humanih retinalnih pericita u hiperglikemijskim uvjetima [107], a pokazalo se da blokator receptora angiotenzina koji obnavlja GLO1 kod dijabetičkih pacova smanjuje acelularne kapilare retine [18]. Dodatno, nedostatak GLO1 u Zebrafish utječe na strukturu krvnih žila mrežnjače odraslih, iako je povećano formiranje angiogenih klica uočeno samo kod glo1-/-prehranjenih zebrica, ali ne i kod normalnog hranjenja [93].

Retina je vrlo složeno, vrlo dinamično tkivo s različitim tipovima ćelija (slika 4A). Protok krvi i posljedična izloženost ksenobioticima i drugim stresorima su među najvećima u tijelu. Svakog jutra, 10 posto vanjskih vrhova fotoreceptora retine otpada i moraju biti uklonjene susjednim pigmentiranim epitelnim stanicama mrežnice. Izvršili smo imunohistohemijsku analizu kako bismo po prvi put karakterizirali prostorne razlike GLO1 u retini. GLO1 protein je bio prisutan u svim tipovima ćelija unutar retine, sa visokim nivoima u ćelijskim tijelima unutrašnjeg nuklearnog sloja i lavera ganglijskih stanica. Tijela fotoreceptorskih stanica u vanjskom nuklearnom sloju imala su niže razine. U fotoreceptorima, većina GLO1 proteina pronađena je u unutrašnjim i vanjskim segmentima. RPE je takođe imao visoke nivoe GLO1 proteina, dok su horoid i sklera imali nižu količinu GLO1 proteina (Slika 4B, C).

Slika 4. Imunohistohemija GLO1 u tkivima retine miša. (A) Poprečni presek stanične sheme mrežnice koja ilustruje njena tri primarna sloja koji se sastoje od sloja ganglijskih ćelija (GCL), koji sadrži ganglijske ćelije retine (RGC), unutrašnjeg nuklearnog sloja (INL), u kojem se nalaze interneuroni amakrine, bipolarne i horizontalne ćelije, kao i Müllerove glijalne ćelije, i vanjski nuklearni sloj (ONL), u kojem se nalaze štapčasti i konusni fotoreceptori. Senzorno tkivo, ili neuroretina, povezano je sa pigmentiranim epitelom retine (RPE). Crvene strelice su označavale sloj RPE. (B) Reprezentativna slika GLO1 imunobojenja u uzorcima retine WT miševa. (C) Srednji intenzitet fluorescencije GLO1 normaliziran na vrijednost u RPE. Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardne greške srednje vrijednosti (SEM). Naši rezultati na retini su relevantni jer je retina visoko diferencirano postmitotsko tkivo, gdje se oštećenje uzrokovano glikacijom ne može smanjiti ćelijskom diobom [5,9]. Nadalje, promjene u GLO1 su povezane s oštećenjem retine [108]. Sličan scenario bi se mogao desiti i u drugim tkivima sastavljenim od ćelija sa niskim kapacitetom regeneracije, kao što je centralni nervni sistem, gde je velika većina neurona postmitotična. Procjena nivoa GLO1 zajedno sa ćelijskim specifičnim markerima može nam omogućiti da procijenimo varijacije od ćelije do ćelije unutar datog tkiva. Naši rezultati sugeriraju da visok nivo retinalnog GLO1 proteina i aktivnosti mogu igrati važnu zaštitnu ulogu protiv oštećenja uzrokovanih AGE-om s godinama.

Ovaj članak je preuzet iz Cells 2021, 10, 1852. https://doi.org/10.3390/cells10081852 https://www.mdpi.com/journal/cells