Cirkadijalni sat reguliše ritmičku ekspresiju eritropoetina u mišjim bubrezima

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk i dr

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobiliproizvodi i Cistanches

Generisanje cirkadijalnih ritmova je autonomno za ćelije i oslanja se na transkripcionu/translacionu povratnu petlju koju kontroliše familija aktivatora faktora transkripcije cirkadijanskog sata uključujući CLOCK, BMAL1 i represore kao što su CRY1 i CRY2. Cilj ove studije bio je ispitati i molekularni mehanizam i hemopoetske implikacije cirkadijalne ekspresije eritropoetina. Mutantni miševi sa homozigotnom delecijom kriptohroma 1 i 2 (Cry-null) jezgre gena cirkadijanog sata korišćeni su za razjašnjavanje cirkadijalne regulacije eritropoetina. Kontrolni miševi divljeg tipa pokazali su značajnu razliku ububregEkspresija mRNA eritropoetina između cirkadijanskih vremena 06 i 18. Paralelno, značajno veći broj ćelija koje proizvode eritropoetin ububreg(pomoću RNAskop ) i značajno viši nivoi cirkulirajućeg proteina eritropoetina (prema ELISA-i) otkriveni su cirkadijalno vrijeme 18. Takve promjene su ukinute kod Cry-null miševa i bile su neovisne o napetosti kisika, zasićenosti kisikom ili ekspresiji faktora 2alfa izazvanog hipoksijom, što ukazuje na da je cirkadijalna ekspresija eritropoetina transkripcijski regulirana CRY1 i CRY2. Testovi reporterskih gena su pokazali da heterodimer CLOCK/BMAL1 aktivira E-box element u 5' eritropoetinskom promotoru. RNAskop in situ hibridizacija potvrdio je prisustvo Bmal1 u ćelijama koje proizvode eritropoetin.bubreg. Kod Cry-null miševa nađen je značajno smanjen broj retikulocita dok su broj eritrocita i hematokrit ostali nepromijenjeni. Dakle, cirkadijalna regulacija eritropoetina kod normoksičnih odraslih miševabubregje transkripcijski kontroliran glavnim cirkadijanskim aktivatorima CLOCK/BMAL1 i represorima CRY1/CRY2. Ovaj nalaz može imati implikacije zafiziologija bubregai bolesti, laboratorijska dijagnostika i terapija anemije.

KLJUČNE RIJEČI:hronobiologija; cirkadijalni ritam; sat; kriptohrom; eritropoetin; hematopoeza; faktor izazvan hipoksijom

Translacijska izjava Molekularni satovi u skoro svim tipovima ćelija pokreću transkripciju gena u saradnji sa tkivno specifičnim faktorima. Do sada su cirkadijalni oscilatorni mehanizmi ububregnisu povezani sa biologijom eritropoetina (Epo). Ovdje je razjašnjeno da je cirkadijalna Epo ekspresija regulirana proteinima glavnog sata (kriptohromi 1 i 2, Clock i Bmal1). Kako EPO djeluje izrazito unutar složene regulatorne mreže eritropoeze, optimalna upotreba rekombinantnog humanog Epo kod pacijenata sabubreginsuficijencija može uključivati ​​njegovu primjenu neposredno prije njegovog fiziološkog cirkadijalnog maksimuma oko ponoći.

Cirkadijalni ritmovi u nefrologiji su uglavnom neistraženi, ali vrlo relevantni jer je njihovo narušavanje radom u smjenama, izborom načina života i starenjem povezano s povećanim rizikom od raznih bolesti, uključujući kardiovaskularne poremećaje.^1–4Životinjski modeli poremećenog cirkadijalnog sata daju prvi dokaz negativnog uticaja cirkadijalne disregulacije na hematopoetski sistem (npr. povećanjem broja ostarjelih eritrocita).^5,6

Što se tiče eritropoeze, ne samo ćelijski efekti već i ritmičnost njegovog primarnog regulatora, eritropoetina (Epo), je od posebnog interesa jer su sportisti više puta optuživani za doping krvi rekombinantnim ljudskim Epo (koji) zbog razlika u vremenu u danu. cirkulirajuće koncentracije Epo i hematološki parametri.7,8 Dnevne varijacije nivoa Epo (S-Epo) u ljudskom serumu prvi put su opisane 1981. godine kod pacijenata s kroničnom respiratornom bolešću radnika na ugljama i pluća,⁹a potom i kod zdravih osoba.^10,11Do danas, nekoliko izvještaja ukazuje na visoke nivoe S-Epo u noći (8 popodne do 4 ujutro) i niske nivoe S-Epo u ranim jutarnjim satima (od 4 ujutro do 8 ujutro). Faza i amplituda S-Epo oscilacija, ako su uopće prisutne, variraju među ljudskim individuama.^9,10,12,13U prosjeku, nivoi S-Epo su se promijenili otprilike 1.5-put u odnosu na njihov minimum.^14–22Pokazalo se da na ovaj dnevni ritam ne utiče starenje,20 trening,16 ili izlaganje nadmorskoj visini.17 Nasuprot tome, dnevna oscilacija S-Epo je ukinuta kod pacijenata sa hroničnom opstruktivnom bolešću pluća komplikovanom dnevnom hipoksemijom, kod mijeloma sa zatajenjem bubrega. i kod mijelodisplazije.^15,21,23

2009. opisali smo cirkadijalnu ekspresiju Epo mRNA u mišjem bubrezima u velikoj analizi promotora gena kontroliranih satom, ali nismo bili u mogućnosti identificirati ni poseban genetski element u EPO genu niti transaktivirajući faktor odgovoran za cirkadijalne oscilacije. 24 Nedavno je pacovski model hemoragičnog šoka sugerirao, prema paralelnim obrascima ekspresije, da su geni sata (Bmal1 i Per2) uključeni u regulaciju lučenja EPO tokom hipoksije/ishemije.²⁵

Generisanje cirkadijalnih ritmova je autonomno od ćelije i oslanja se na povratnu petlju transkripcije-translacije koju kontroliše familija transkripcionih faktora cirkadijanskog sata, uključujući CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 i CRY2.26 CLOCK/BMAL1 aktivira heterodimerni transkript. gena cirkadijanskog sata PER1/2 i CRY1/2 vezivanjem za E box elemente u njihovim promotorima. PER i CRY proteini, međutim, daju negativnu povratnu informaciju tako što inhibiraju CLOCK/BMAL1 aktivnost, smanjujući time vlastitu ekspresiju. Neto rezultati dovode do oscilacijskih obrazaca cirkadijalne ekspresije gena i ritmičkih promjena u ćelijskoj i organskoj fiziologiji.²⁷

Da bismo razumjeli implikacije biološkog sata, do sada su proučavani različiti tipovi mutantnih miševa sa poremećenim ili abliranim transkripcijskim faktorima jednog jezgra sata.28,29 Ovdje smo iskoristili prednosti Cry1–/–/Cry2–/– dvostrukog mutanta. miševi (Cry-null), koji nemaju sposobnost da izraze endogene cirkadijalne ritmove.^26,30Kombinovani podaci in vivo i in vitro pokazuju da Cry1/2 reguliše cirkadijalnu ekspresiju Epo preko CLOCK/BMAL1-indukovane transkripcije u normoksičnom bubregu.

METODE

Eksperimenti na životinjama

Homozigotne Cry1–/– /Cry2–/– životinje (Cry-null; mužjak i ženka; na bazi C57BL/6J)31 i kontrole divljeg tipa (WT) su uzgajane (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) i uzgajane za 5 do 7 mjeseci. WT miševi potiču iz uzgoja Cry-null kolonije.

Cry-null genotip je potvrđen lančanom reakcijom polimeraze (dodatna tabela S1). Za povlačenje, miševi su bili smješteni u grupe i imali su hranu i vodu ad libitum u 12-sat:12-satnom ciklusu svjetlo/mrak tokom 14 dana. Drugog dana nakon puštanja u stalni mrak, životinje su žrtvovane u cirkadijanskom vremenu (CT) 06 ili 18 (n=13-15 za svaku grupu i vremensku tačku). Tkiva (jetra i bubrezi) su brzo dobijena i naglo zamrznuta u tečnom azotu. Podgrupa muških i ženskih WT i Cry-null životinja detaljno je analizirana na tjelesnu težinu i diferencijalni hemogram.

Za analizu gasova krvi životinje su anestezirane (fentanil, {{0}}.075 mg/kg, midazolam, 1,5 mg/kg i medetomidin 0,75 mg/kg), traheotomizirane, intubirane i ventilirane (plimne zapremina, 9 ml/kg; brzina disanja, 160 min- 1; pozitivan krajnji ekspiratorni pritisak, 2 cm H2O), kako je opisano.32 Polietilenski kateter je hirurški uveden u lijevu karotidnu arteriju. Nakon 5 minuta stabilizacije, eksperiment je prekinut brzim iskrvavljenjem preko karotidnog katetera, analizirani su plinovi krvi (ABL-800; radiometar; kontrolirana temperatura), a bubrezi su ekscidirani za post hoc analize.

Sve procedure su odobrene od strane Lokalnog komiteta za brigu o životinjama (T0307/08; G0100/17 sa dodatkom od januara 2021.) i sprovedene u skladu sa smernicama i propisima nemačkog zakona o zaštiti životinja.

Priprema RNK i kvantitativna analiza lančane reakcije polimeraze

Ukupna RNK je ekstrahovana kako je opisano.33 Ukupno 1000 ng ukupne RNK je reverzno transkribovano sa SuperScript III reverznom transkriptazom (Thermo Fisher; br. 18080085) i nasumičnim heksamerima (Thermo Fisher; br. SO142), prema uputstvima proizvođača. Kvantitativne lančane reakcije polimeraze izvedene su na StepOnePlus ciklusu (Life Technologies) sa prajmerima koji se protežu kroz intron ili TaqMan testovima (dodatna tabela S2). Apsolutna kvantifikacija mRNA postignuta je poređenjem sa standardnom krivom iz serijskih razblaženja šablona za lančanu reakciju polimeraze.

Detekcija ekspresije Epo mRNA u bubrežnoj tehnici RNAscope

RNAskopski test je izveden prema protokolima proizvođača (ACD; tehnička napomena 320536). Poprečni kriorezci 10-mm srednjeg bubrega obojeni su C1 sondom protiv DapB (negativna kontrola; ACD; br. 310043) ili Epo (ACD; br. 315501). Koraci hibridizacije koji koriste pojačalo 4-6 i detekcija crvenih signala su izostavljeni. Dva nezavisna, zaslijepljena istraživača izbrojali su Epo pozitivne ćelije pri originalnom uvećanju od 200, na 3 do 8 krioreza po životinji na Axioplan 2 sistemu za snimanje (Zeiss).

Reprezentativne Epo kvantifikacione slike i dvostruko fluorescentno bojenje izvedeni su pomoću RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 kompleta (ACD; br. 323110), prema protokolima proizvođača. 15-mm srednji transverzalni para sekcije bubrega su obojeni C1 sondom protiv Bmal1 (ACD; br. 438741) i C2 sondom protiv Epo (ACD; br. 315501-C2). Opaleye 520 (Akoya BioSciences; br. FP1487001KT) korištena je sa sondom C1, a opal boja 650 (Akoya BioSciences; br. FP1496001KT) korištena je sa sondom C2. Na - 400 originalnom uvećanju, Epo pozitivne ćelije su snimljene za Bmal1 kolokalizaciju na Eclipse Ti2 sistemu za snimanje (Nikon). 40,6-diamidino-2-fenilindol je korišten kao kontra-bojenje.

Koncentracije EPO u serumu

Uzorci krvi su ostavljeni da se zgrušaju 1 sat na sobnoj temperaturi prije centrifugiranja 20 minuta na 2000 - g. Serum je uklonjen i odmah zamrznut na –80 C do izvođenja enzimskog imunosorbentnog testa za Epo (Quantikine; R&D Systems; br. MEP006) sa nerazrijeđenim uzorcima. Apsorpcija je očitana pomoću iMARK Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad) na 450 nm, sa korekcijom talasne dužine na 570 nm i 4-parametar odgovara standardnoj krivu, kao što je prethodno opisano.³³

Broj krvnih zrnaca

Ukupni i diferencirani broj ćelija iz EDTA-antikoagulirane krvi mjeren je od strane Synlaba. veterinar Berlin sa ADVIA2120i(Siemens) automatizovanim brojačem ćelija za mišju krv.

Testovi reporterskih gena

Ljudski embrionalni bubreg 293 ćelije (DSMZ; br. ACC305; brojevi prolaza 3-10; mikoplazma negativan) uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle's mediju/Ham F12 (Biochrom; br. FG4815) sa dodatkom 10 posto (M fetalnog goveđeg seruma; br. F7524). Transfekcija ćelija je izvedena u 12-pločama sa jažicom koje su sadržavale 1.67 - 105 ćelija po jažici. Svaki bunar je transficiran sa 333 ng plazmidne DNK (od kojih je 1 od 10 konstrukt vanile) i 1 ml reagensa za transfekciju Fugene 6 (Promega; br. E2691) kako je opisano.34 Svi korišteni konstrukti navedeni su u Dodatnoj tabeli S3. Ćelije su lizirane 48 sati nakon transfekcije puferom za pasivnu lizu (Promega; br. E1941). Aktivnost luciferaze je određena sa kompletima Beetle-Juice i Renilla-Juice (oba pjk GmbH; br. 102511/102531), na Lumat LB9501 luminometru. Svaki eksperiment je izveden u tehničkim duplikatima, a srednje vrijednosti su korištene za proračune.

Statistička analiza

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-uvećati interkvartilni raspon) u 4 od 6 cirkadijalno eksprimiranih gena. Podaci su analizirani pomoću IBM SPSS Statistics 27 i predstavljeni su kao pojedinačne tačke sa medijanom ili kao trake sa srednjom sredinom i SD. Urađen je Mann-Whitney U test ili Kruskal-Wallis sa Bonferronijem kao post hoc testom.

REZULTATI

Ablacija cirkadijalne ekspresije Epo kod Cry-null miševa

Da bismo razjasnili molekularni mehanizam cirkadijalne Epo regulacije, analizirali smo Epo mRNA i ekspresiju proteina kod WT i Cry-null mutantnih miševa. U WT bubrezima, geni kanonskog sata pokazali su ekspresiju ovisno o vremenu u danu, dok je to ukinuto kod Cry-null miševa, kako se očekivalo (dodatna slika S1). Prethodno smo izvijestili o cirkadijalnoj oscilaciji ekspresije Epo mRNA tokom 24 sata za odrasle WT mišje bubrege.24 Fokusirajući se sada na minimalne i maksimalne vrijednosti, uočili smo značajnu, w9-struku razliku između CT06 (period spavanja miša; očekivani minimum ) i CT18 (faza aktivnosti; očekivani maksimum; slika 1a). U bubrezima Cry-null miševa, međutim, nije otkrivena značajna razlika u bubrežnoj ekspresiji Epo mRNA. Značajno, kod Cry-null miševa, apsolutne količine nivoa Epo transkripta u bubregu u oba vremena bile su između medijana nivoa WT Epo mRNA na CT06 i CT18 (Slika 1a). EPO mRNA u odgovarajućim jetrama bila je ispod granice detekcije (podaci nisu prikazani).

Dnevne promjene koncentracije Epo u serumu

Da bismo procijenili translaciju cirkadijalne ekspresije Epo mRNA u cirkulirajući Epo protein, analizirali smo uzorke seruma enzimskim imunosorbentnim testom. Prije uzimanja uzoraka organa uzeti su uzorci krvi. Serum Epo je povećao w2.3- puta između CT06 i CT18 kod WT miševa, ali je ova razlika ukinuta kod Cry-null miševa (Slika 1b). Značajno je da su srednje koncentracije S-Epo prosječne tokom vremena (CT06 i CT18) bile slične kod WT i Cry-null miševa (22 mU/ml [opseg, 3–59 mU/ml] naspram 21 mU/ml [opseg, 7 –50 mU/ml]).

Cirkadijalna Epo ekspresija u odnosu na gasne parametre arterijske krvi i pulsnu oksimetriju

Da bi se istražilo mogu li potencijalne dnevne promjene u krvi i razinama kisika u tkivu uzrokovati cirkadijalne oscilacije Epo ekspresije, uzeti su uzorci arterijske krvi i izvršene su analize plinova krvi u anesteziranih, traheotomiziranih i mehanički ventiliranih Cry-null i WT miševa na CT06 ili CT18, koji odgovaraju najnižem i najvišem cirkadijalnom nivou Epo mRNA, respektivno (slika 1a). Nismo otkrili značajne razlike u arterijskom pH, parcijalnom pritisku CO2 ili parcijalnom pritisku O2 niti u standardnom višku baze ili koncentracijama laktata (Slika 2a-e) između CT06 i CT18 ili WT i Cry-null miševa. Nivoi zasićenosti kiseonikom, mereni pulsnom oksimetrijom, takođe nisu pokazali nikakve razlike (Slika 2f). Ekspresija gena EPO glavnog regulatora faktora koji izaziva hipoksiju (HIF) 2a nije se razlikovala između CT06 i CT18, bilo kod WT ili Cry-null miševa (Slika 3). Dakle, u normoksičnim uslovima, cirkadijalna Epo regulacija nije uzrokovana promjenama napetosti kisika.

Cirkadijski prekidač za uključivanje i isključivanje Epo ekspresije u bubrežnim ćelijama koje proizvode Epo

Da bi se proučilo da li je cirkadijalna ekspresija Epo mRNA posredovana uključivanjem dodatnih bubrežnih ćelija koje proizvode Epo (REPCs) ili isključivo povećanjem ekspresije Epo po ćeliji, RNAscope in situ hibridizacija je korištena na srednjim poprečnim presjecima bubrega (primjer na dodatnoj slici S2). Kod WT miševa, broj REPC-a se značajno povećao između CT06 (medijana, 5; raspon, 0–25) i CT18 (medijana, 22; raspon, 5–82; 4.{{ 11}} puta; P=0,010). Nasuprot tome, Cry-null bubrezi su pokazali sličan broj REPC-a na CT06 (medijan, 18; raspon, 2-33) i CT18 (medijan, 15; raspon, 4-87; nije značajno; Slika 1c). Smatrali smo da Cry-null miševi pokazuju ograničenje rasta zbog poremećene signalizacije faktora rasta 1 sličnog insulinu (IGF1), što rezultira kontinuirano povećanjem razlike u tjelesnoj težini i veličini organa između Cry-null i WT miševa.30 Kao što smo koristili relativno mladih životinja, apsolutna težina bubrega Cry-null miševa bila je samo nešto niža nego kod WT miševa (-12 posto kod Cry-null miševa), ali se relativni omjer težine bubrega i tijela nije razlikovao (dodatna slika S3) . Stoga se čini da je cirkadijalno povećanje ekspresije Epo mRNA regulirano uključivanjem dodatnih REPC-ova.

Aktivacija minimalnog EPO promotora pomoću CLOCK/BMAL1

Da bi se identifikovale regulatorne sekvence odgovorne za cirkadijalnu ekspresiju Epo (slika 4a), izvedeni su testovi reporter gena luciferaze u ćelijama ljudskog embrionalnog bubrega 293. Ćelijska linija ljudskog embrionalnog bubrega 293 nije odabrana zbog njegovog porijekla iz bubrega, već zbog nedostatka endogenog cirkadijalnog sata. Stoga bi se stimulativni efekat CLOCK/BMAL1 mogao testirati u niskoj, neoscilirajućoj pozadini CLOCK/BMAL1. Prekomjerna ekspresija CLOCK/BMAL1 značajno je stimulirala aktivnost minimalnog humanog EPO promotora (Slika 4b, I vs. II). Ako je motiv E-kutije (–36 do –31 bp u odnosu na početno mjesto transkripcije) mutiran,35 ovaj efekat je prigušen (Slika 4b, III).

Da bismo proučili da li je uočena cirkadijalna regulacija bila ovisna o tipu ćelije, pregledali smo nekoliko ćelijskih linija koje eksprimiraju EPO na aktivnost endogenog sata praćenjem oscilacija luciferaze posredovanih promotorom Bmal1. One sa endogenim ritmom uključivale su HEP3B ćelije izvedene iz humanog hepatoma, ćelije KELLY izvedene iz humanog neuroblastoma i ćelije bubrega miša PDGFRbþ (ranije EPO ćelijska linija miša FAIK1-10).36,37 Među 3 ćelijske linije, samo KELLY ćelije su pokazale oscilacije luciferaze vođene EPO promotorom (dodatna slika S4A). Iako su PDGFRbþ ćelije pokazale snažan cirkadijalni ritam aktivnosti Bmal1 promotora, nismo otkrili oscilacije posredovane EPO promotorom, što ukazuje na nižu amplitudu reporterske konstrukcije vođene EPO promotorom (dodatna slika S4B).

Kolokalizacija Bmal1 i Epo u bubrezima Cry-null u odnosu na WT miševe

Da bismo dalje razjasnili (i) cirkadijalnu regulaciju bubrežne proizvodnje Epo regrutacijom bubrežnih ćelija koje proizvode Epo i (ii) kolokalizaciju ekspresije Bmal1 i Epo, izvršili smo RNAscope in situ hibridizaciju. Epo i Bmal1 kolokalizirani, a mikroskopija pri malom povećanju predstavlja razlike u regrutaciji REPC-a (Slika 5), ​​kao što je kvantificirano na Slici 1c.

Hematološki nalazi kod nedostatka Cry1/Cry2 Da bi se procijenili (i) hematopoetski efekti nedostatka cirkadijalne ekspresije Epo i (ii) mogućih drugih hematoloških abnormalnosti kod miševa bez funkcionalnog sata, analiziran je broj krvnih stanica. Razlike tokom dana u ekspresiji Epo mRNA i koncentraciji S-Epo nisu se ogledale u značajnim razlikama u broju perifernih retikulocita u CT06 u odnosu na CT18 kod WT miševa. Broj retikulocita je, međutim, bio značajno niži i kod CT06 i CT18 kod Cry-null životinja u poređenju sa WT miševima (Slika 6a). Nije bilo značajne razlike u broju eritrocita ili hematokritu kod WT u odnosu na Cry-null miševe. Oba parametra, međutim, nisu varirala između CT06 i CT18 u oba soja (Slika 6b i c) i nisu odgovarala nižem broju perifernih retikulocita kod Cry-null miševa (Slika 6a). Da bi se testiralo da li su nutritivni nedostaci (npr. željezo i folat) zbog poremećene signalizacije IGF1 uključeni u neslaganje smanjenog broja retikulocita i normalnog broja eritrocita kod Cry-null miševa, analizirani su veličina i oblik crvenih krvnih stanica, ali nisu pokazali nikakve značajne razlike. između Cry-null i WT miševa (dodatna slika S5).

Primjetno je da je srednji broj trombocita kod Cry-null miševa bio veći nego kod WT miševa, ali broj trombocita se nije značajno razlikovao između CT06 i CT18 u oba soja (Slika 6d). Nasuprot tome, broj bijelih krvnih zrnaca (WBC) značajno se razlikovao između CT06 i CT18 kod WT, ali ne i kod Cry-null miševa. Medijan WBC broja kod Cry-null miševa bio je slično visok, kao i kod WT miševa na CT06 (Slika 6e).

DISKUSIJA

Ovdje pokazujemo da je cirkadijalna Epo ekspresija regulirana na nivou transkripcije. Analiza koncentracije Epo mRNA i S-Epo kod aritmičkih miševa s nedostatkom Cry1 i Cry2 preusmjerila je našu potragu za "Epoovim satom" na njihove nizvodne ciljne transkripcione faktore CLOCK i BMAL1, koji su potisnuti CRY1 i CRY2.26 Ablacija Cry1/Cry2 odvoda do gubitka ritmičke represije CLOCK/BMAL1, što je rezultiralo konstantnim nivoima Epo transkripta koji su bili između srednjih nivoa na CT06 i CT18 kod WT miševa (Slika 1a). In situ hibridizacija pomoću RNAskopa ukazuje da se cirkadijalna oscilacija postiže uključivanjem ekspresije Epo mRNA u intersticijalnim ćelijama (slika 1c), a in situ hibridizacija pomoću RNAskopa je takođe otkrila ekspresiju Bmal1 u REPC (slika 5).

Još važnije, značajno viši nivoi S-Epo na CT18 potvrđuju da se cirkadijalna, transkripciona Epo regulacija prevodi u cirkadijalne oscilacije cirkulišućeg Epo proteina u normoksičnim uslovima (Slika 1b). Pravi maksimum nivoa S-Epo očekuje se nešto kasnije od CT18 jer de novo sinteza EPO proteina zahteva w80 do 120 minuta,38 a cirkadijalna vremena su izabrana na osnovu maksimalnih nivoa Epo mRNA. 24 Otkrili smo da je cirkadijalna Epo regulacija vjerovatno posredovana transkripcijskom aktivacijom motiva E-kutije u 5' EPO promotoru pomoću CLOCK/BMAL1 (Slika 4 i Dodatna slika S4), što je u skladu s opisanom pozitivnom korelacijom između BMAL1 proteina i Nivoi S-Epo u modelu akutnog krvarenja kod pacova.²⁵

Postoje dokazi za dvosmjernu regulaciju između CLOCK/BMAL1 i HIF puteva kroz direktnu interakciju protein-protein.^39,40Povećana regulacija HIF2a, glavnog aktivatora EPO promotora,41,42 rezultirala je izmijenjenim nivoima ekspresije gena sata u ljudskim ćelijama hepatoma.43 Nadalje, BMAL1 dimerizira s HIF1a i HIF2a proteinima,^44,45,i kontrola cirkadijalnog sata aktivnosti HIF-a regulirana je na tkivno-specifičan način.39 Kod miševa, izloženih akutnoj hipoksiji (4 sata na 6 posto naspram 21 posto O2), EPO mRNA je bila pretjerano povećana, ali više nije pokazivala cirkadijalne razlike .46 Dakle, normoksični uslovi su verovatno najprikladniji za seciranje molekularnog mehanizma cirkadijalne regulacije Epo. Kod glodara su, međutim, prijavljene dnevne promjene nivoa kiseonika u krvi i tkivu.39,47 Kod štakora postoji nizak raspon ritmičkih dnevnih promjena u oksigenaciji bubrega od zD3 posto, sa vrhuncem u mraku (¼ aktivnosti glodavaca) .47 Takve razlike nisu mogle biti otkrivene u našim eksperimentima, u kojima su samo anestezirani, traheotomizirani i mehanički ventilirani miševi mogli biti proučavani zbog regulatornih razloga na životinjama. Međutim, analiza arterijskog pH, parcijalnog pritiska CO2 i parcijalnog pritiska O2, viška standardne baze ili laktata, kao i zasićenja kiseonikom, nije ukazala na velike razlike između WT i Cry-null miševa na oba CT (slika 2). Štaviše, nivoi Hif2a transkripta u bubrezima su takođe bili slični u svim stanjima (Slika 3). Dakle, u normoksičnim uslovima, cirkadijalna Epo regulacija izgleda da je nezavisna od dnevnih promena u napetosti kiseonika. Međutim, pitanje u kojoj mjeri visoka nadmorska visina ili hipoksija (nizak pO2) utječu na cirkadijalne oscilacije proizvodnje Epo zaslužuje dalju pažnju. Nivoi S-Epo kod ljudi općenito su viši na velikoj nadmorskoj visini, dok su faza i amplituda nepromijenjene,17,22, a kod zdravih dobrovoljaca izloženih normobaričnoj hipoksiji, koncentracije S-Epo pokazuju izražene oscilacije.⁴⁸

Regulacija cirkadijalne Epo je vjerovatno najrelevantnija za kliničku nefrologiju i hematologiju, ali i za laboratorijsku dijagnostiku, kao što je ispitivanje krvi na doping agensima koji stimulišu eritropoezu. Za procjenu cirkulirajućih Epo koncentracija u doping analizama, potrebno je uzeti u obzir doba dana (eksterno vrijeme) prilikom uzimanja krvi i hronotip osobe (interno vrijeme).49,50

U eritropoezi, jedinice koje formiraju rasprskavanje – eritroid su prve ćelije specifične za lozu, a slijede jedinice koje formiraju kolonije – eritroid, koje pokazuju obilnu ekspresiju Epo receptora. Nakon 2 dana u kulturi s Epo, jedinice za formiranje kolonija miša-eritroid proizvode kolonije eritroblasta. Kada se stadijum ortohromatskih eritroblasta dostigne nakon 7 dana, ćelije ekstrudiraju svoja jezgra da postanu retikulociti kojima nedostaje ekspresija Epo receptora.51 Uzimajući u obzir vreme koje je potrebno jedinicama koje formiraju kolonije – eritroidi da sazriju do retikulocita ili čak do potpuno zrelih eritrocita, vjerovatno nije iznenađujuće da nisu uočene razlike između CT06 i CT18 kod WT miševa (Slika 6a-c). Značajno je da je ukupan broj retikulocita bio značajno veći u WT nego kod Cry-null miševa (Slika 6a), što sugerira da je diferencijacija u retikulocite poremećena kod Cry-null miševa. Prethodni podaci pokazuju da rane eritroidne progenitorne ćelije također pokazuju cirkadijalni obrazac sinteze DNK. In vivo primjena rhEpo pojačava cirkadijalne ritmove broja eritroidnih kolonija.52 Niži broj retikulocita, uprkos relativno visokim ukupnim koncentracijama S-Epo kod Cry-null miševa, mogao bi biti rezultat ukidanja cirkadijalne sinteze DNK na nivou eritroidnih progenitora. Takva konstelacija visokog S-Epo i smanjene eritropoeze uočena je kod miševa sa genetskom ablacijom proizvodnje melatonina u epifizi (C3H/HeN miševi kojima nedostaje N-acetil transferaza koja ograničava brzinu),53 tvrdeći za intrinzične cirkadijalne aktivnosti na eritroidnoj matičnoj stanici nivo.

Primjetno, Cry-null miševi pokazuju približno 80 posto smanjenja nivoa IGF1, što dovodi do smanjene signalizacije IGF1 i 30 posto smanjenja tjelesne težine i veličine organa u usporedbi s WT, što je efekat koji se pogoršava tijekom života.30 Iako životinje korištene u našoj eksperimenti su bili relativno mladi (srednja starost,^21–29 sedmicama), pokazali su umjereni učinak na ukupnu tjelesnu i apsolutnu težinu bubrega kod Cry-null miševa, ali je omjer težine bubrega i tijela bio normalan (dodatna slika S3). Posljednja činjenica može biti relevantna za kapacitet sinteze Epo proteina (Slika 1b).

Međutim, analiza veličine ili oblika crvenih krvnih zrnaca (MCV, MCH i MCHC; Dodatna slika S5) nije sugerirala nutritivne nedostatke (npr. željezo i folat) kao objašnjenje za neslaganje između smanjenog broja retikulocita i normalnog broja eritrocita u Cry- nulti miševi (slika 6a i b). Značajno je da signalizacija Epo i IGF1 sinhronizuje proliferaciju i diferencijaciju ćelija tokom eritropoeze putem interakcije sa GATA-1/prijateljem GATA-1 transkripcionog kompleksa.54 U ovom procesu, Epo aktivira ćelijski AKT put i na taj način povećava afinitet GATA-1, glavnog transkripcionog regulatora eritropoeze, prema njegovom kofaktorskom prijatelju GATA-1. Ovaj mehanizam je inhibiran, međutim, ako se IGF1 signalizacija ukine.54 Dakle, pozitivan efekat relativno većeg Epo kod Cry-null miševa na diferencijaciju crvenih krvnih zrnaca može nadmašiti smanjenu aktivnost IGF1 kod relativno mladih Cry-null miševa koji su ovdje proučavani.

Opšta implikacija potpune cirkadijalne aritmičnosti na hematopoezu dalje je razjašnjena našom analizom broja trombocita i WBC-a. Prethodni rezultati kod miševa koji su eksprimirali dominantno negativan oblik sata (ClockD19/D19) su pokazali da poremećaj ekspresije trombopoetina (primarnog regulatora megakariopoeze) i njegovog receptora Mpl dovodi do povećanog broja zrelih megakariocita srži i broja trombocita u cirkulaciji. 55 Opisana značajna cirkadijalna oscilacija broja trombocita na vrhuncu u zeitgeber vrijeme (ZT) 20 kod WT miševa, kao i veći broj trombocita na ZT08 kod ClockD19/D19 miševa,55 što je rezultiralo nedostatkom cirkadijalne oscilacije broja trombocita, nije moglo biti potvrđen u našem modelu miša (slika 6d). Još jedan važan nalaz je gubitak razlika u vremenu u danu cirkulirajućih WBCs kod Cry-null miševa za razliku od WT miševa (Slika 6e), što je u skladu s prijavljenom aktivnošću CLOCK/BMAL1 na proizvodnju zrelih WBC.^56,57

Za interpretaciju naših podataka, potrebno je uzeti u obzir razlike u dnevno-noćnim aktivnostima kod miševa i ljudi: vrijeme CT06 kod ljudi otprilike odgovara ponoći (faza spavanja), dok CT18 otprilike odgovara podnevu (faza aktivnosti). Suprotno je istinito za noćne miševe, ali oba organizma pokazuju isti cirkadijalni obrazac Epo ekspresije (nizak na CT/ZT06, visok na CT/ZT18). Ovo ukazuje da bi dodatni mehanizmi (npr. metabolički faktori) mogli modifikovati ritmove ekspresije Epo u oba organizma. Sinhronizacija između Epo vršnih nivoa i ekspresije Epo receptora u ranim eritroidnim progenitorima (jedinice koje formiraju pucanje – eritroidne, pa čak i jedinice koje formiraju kolonije – eritroidne ćelije)⁵² sugerira da bi pacijenti koji primaju rhEpo tretman (npr. u završnoj fazi anemije bubrega ili hematoloških poremećaja) imali koristi od oponašanja normalne cirkadijalne fiziologije primjenom hipoglikemije tokom noći. Poremećaji hematopoeze još nisu prijavljeni kod ljudi sa mutacijama gubitka funkcija CRY1 (Online Mendelijsko nasljeđivanje kod čovjeka *601933) ili CRY2 (Online Mendelijsko nasljeđivanje kod čovjeka *603732). Klinički izvještaji povezuju varijante CRY1 prvenstveno sa poremećajima pažnje/hiperaktivnosti, često praćenim nesanicom, anksioznošću, depresijom ili poremećajem odgođene faze spavanja.^58,59Ovo zaslužuje dalje istraživanje jer se takve bolesti mogu pogoršati anemijom ili hematopoetskim poremećajima.

U zaključku, ova studija pruža prvi dokaz da je cirkadijalna Epo ekspresija u normoksičnom odraslom mišjem bubregu regulirana na nivou transkripcije aktivacijom E-box elementa u 5'EPO promotoru posredovanom CLOCK/BMAL1-. Kako EPO djeluje izrazito unutar složene regulatorne mreže eritropoeze, optimalna upotreba repo kod pacijenata s bubrežnom insuficijencijom može uključivati ​​njegovu primjenu neposredno prije njegovog fiziološkog cirkadijalnog maksimuma noću.