Kako proteini za popravak ćelijske membrane regulišu transdukciju signala faktora transkripcije za kontrolu bubrežne fibroze

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Bubregfibroza je povezana s progresijom akutnogbubregpovreda hronične bolesti bubrega. Pokazalo se da MG53, protein za popravku ćelijske membrane, štiti od ozljeda epitelnih stanica bubrega i akutne ozljede bubrega. Ovdje smo procijenili ulogu MG53 u modulacijibubregfibroza kod ostarjelih miševa i kod miševa s jednostranom opstrukcijom uretera (UUO) poznati model progresivne fibroze bubrega. Miševi s ablacijom MG53 razvili su više intersticijske fibroze s godinama nego MG53-intaktni miševi iste dobi. Slično, u odsustvu MG53,bubregfibroza je bila preuveličana u poređenju sa miševima sa intaktnim MG53 u opstruiranom bubregu u poređenju sa kontralateralnim neometanim bubregom ili bubrezima lažno operisanih miševa. Opstrukcija ureterabubrezikod miševa s nedostatkom MG53 također su pokazali značajno više upale nego bubrezi s opstrukcijom uretera kod MG53 intaktnih miševa. In vitro eksperimenti su pokazali da MG53 može ući u jezgra proksimalnih tubularnih epitelnih ćelija i direktno stupiti u interakciju sa p65 komponentom transkripcionog faktora NF-kB, pružajući moguće objašnjenje pojačane upale u odsustvu MG53. Da bi se ovo testiralo, povećana ekspresija MG53 kroz konstruisane ćelije ili direktna isporuka rekombinantnog proteina data je miševima koji su podvrgnuti UUO. Ovo je smanjilo aktivaciju NF-kB i upalu i oslabila fibrozu bubrega. Stoga, MG53 može imati terapeutsku ulogu u liječenju kronične upale bubrega i na taj način osigurati zaštitu odfibrozašto dovodi do fenotipa hronične bubrežne bolesti.

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Translacijska izjava Kronična upala dovodi do fibroznog remodeliranja koje također može biti u osnovi prijelaza iz akutne ozljede bubrega u kroničnu bolest bubrega. Aktivacija proteina-inflamatornog transkripcionog faktora nuklearnog faktora-kB (NF-kB) uključena je u patogenezu upale bubrega. Ovdje pružamo dokaz da MG53, prethodno identificirani protein za popravku ćelijske membrane, direktno stupa u interakciju sa NF-kB i smanjuje njegovu transkripcionu aktivnost. Istovremeno, egzogeno primijenjen MG53 može smanjiti fibrozno remodeliranje upaljenog bubrega. Ovi nalazi ukazuju na zaštitnu interakciju između MG53 i NF-kB kako bi se ublažio razvoj bubrežne fibroze posredovane upalom. Farmakološka primjena MG53 mogla bi biti obećavajući pristup u liječenju progresivne fibroze bubrega.

Disfunkcija bubrega, koja se može klasificirati kao akutna ozljeda bubrega (AKI) ili kronična bolest bubrega (CKD), prerasla je u epidemiju u starijoj populaciji. U 2017. godini, prevalencija CKD-a dosegla je 14,5 posto ljudi od 65 i više godina, što je rezultiralo izdacima Medicare-a od preko 84 milijarde dolara za liječenje.^1,2AKI i CKD su češći kod starijih osoba, uglavnom zbog povećane podložnosti ozljedama plus smanjene sposobnosti za popravku bubrega koji stari. Kliničke studije su pokazale da je CKD glavni faktor rizika za AKI, i obrnuto, epizode AKI mogu ubrzati napredovanje CKD prema završnoj fazi bolesti bubrega. Trenutno je liječenje AKI uglavnom potporno, a liječenje utvrđene CKD je fokusirano na usporavanje progresije kroz inhibiciju renin-angiotenzin-aldosteronskog sistema i sada moguće kroz inhibiciju kotransportera natrijum-glukoze{4}}.^3,4

Ovisno o težini ozljede, proksimalne tubularne stanice, glavna meta akutne ozljede, mogu biti podvrgnute promjenama u progresiji staničnog ciklusa,5,6 metabolizmu,7 lučenju proteinsko-upalnih i profibrotskih citokina ili djelomičnoj epitelno-mezenhimskoj tranziciji,8 koji će odrediti da li će remodeliranje/popravak biti uspješan ili neprilagođen i rezultirati fibrozom bubrega, što je znak CKD.9,10 Ovo preoblikovanje se općenito događa na pozadini upale bubrega,

smanjena vaskularna opskrba i proizvodnja proteina ekstracelularnog matriksa (ECM) i uključuje gubitak epitelnih stanica i nakupljanje kolagena, a-aktina glatkih mišića i fibronektina; takođe ima visoku korelaciju sa pogoršanjem funkcije bubrega.

Kronična upala dovodi do fibroznog remodeliranja koje također može biti u osnovi prijelaza s AKI na CKD.11–13 Kumulativna istraživanja sugeriraju uključenost transkripcionog faktora nuklearnog faktora-kB (NF-kB) u patogenezu upale bubrega uzrokovane infekcijom, ozljedom, ili transplantaciju.11,12,14 Aktivacija kanonskog NF-kB puta počinje aktivacijom inhibitora NF-kB (IkB) kinaze, što dovodi do fosforilacije i degradacije IkBa i nuklearne translokacije heterodimera NF-kB.15 Aktivacija NF-kB signalizacije u epitelnim ćelijama bubrega i infiltrirajućim imunim ćelijama može biti izazvana patofiziološkim okidačima kao što je izloženost lipopolisaharidima (LPS) ili ishemijsko-reperfuziona povreda.16 Studije molekularnog profilisanja otkrivaju nfkb1 kao glavni pokretač fibroze.¹⁷Osim bubrežnih tubularnih stanica, urođene imunološke stanice kao što su makrofagi i dendritske ćelije također doprinose ozljedi bubrega, upali i fibroznom remodeliranju.^13,18–20

cistanche je efikasan u liječenju bubrežne disfunkcije

Sve veći dokazi sugeriraju da sekretorni faktori izvedeni iz mišića (tj. miokini) moduliraju sistemsku fiziologiju putem unakrsnih preslušavanja tkiva kako bi utjecali na napredovanje bolesti bubrega.²¹MG53 (također nazvan TRIM72) je protein obogaćen tripartitnim motivom (TRIM) sa kritičnom funkcijom u obnavljanju ćelijske membrane.22,23 Proteini iz porodice TRIM imaju različite funkcije u rasponu od regulacije imunološke signalizacije do popravke tkiva.²⁴MG53-popravka membrane posredovana je u ublažavanju akutne ozljede skeletnih mišića,²⁵bubrezi,²⁶srce,²⁷ pluća,28 mozgova,^29,30i kožu.³¹Naše prethodne studije su identifikovale nizak nivo ekspresije MG53 u bubrezima, što je ključna komponenta u zaštiti od AKI, a miševi sa nedostatkom MG53 (mg53 / ) bili su podložniji AKI izazvanom stresom.²⁶Također smo nedavno pokazali da kontinuirano povećanje MG53 u cirkulaciji pospješuje popravku i regeneraciju ozljeda tkiva.32 Relativna uloga specifičnog za bubrege i ekstrinzičnog cirkulirajućeg MG53 u modulaciji fibroze bubrega tokom progresivne CKD još uvijek nije poznata.

Nedavno je evoluirala nova uloga MG53 u moduliranju zaštite tkiva kroz inhibiciju upale, posebno putem modulacije NF-kB signalizacije. Na primjer, MG53 ublažava neurotoksičnost i neuro-inflamaciju izazvanu LPS-om inhibirajući TLR4/NF-kB put,33 a srčani MG53 reguliše ekspresiju KChIP2 kako bi kontrolirao elektrofiziološko remodeliranje tokom kardio hipertrofije.34 Osim toga, pokazali smo dvostruku funkciju MG-a. sprečavanje neprilagođenog hiperinflamatornog odgovora tokom subletalne infekcije virusom gripe A, koju karakteriše prekomerna proizvodnja interferona-b, putem supresije aktivacije IRF3/NF-kB i inhibicije aberantne intracelularne Ca2þ signalizacije u makrofagima.35 Nadalje, nakon smrtonosne doze gripa A infekcija virusom, pokazalo se da MG53 sprječava smrtnost i oštećenje pluća, ne direktnim djelovanjem na virusne titre per se, već ublažavanjem citokinske oluje (interferon-b, interleukin-6 i interleukin-1b) kroz negativnu regulaciju inflamasoma NLRP3 i prevencija piroptoze pluća.36 Štaviše, hronični tretman visokim dozama egzogenog MG53 bio je povezan sa supresijom NF-kB – posredovana upala u starom srcu.37 Ove studije sugeriraju da MG53 može modulirati aberantnu NF-kB signalizaciju tokom upale, ali nije proučavano da li se to dešava u kontekstu upale bubrega.

Pretpostavili smo da MG53 regulira upalu bubrega modulirajući transkripcijsku aktivnost NF-kB i na taj način može ublažiti fibrozu bubrega koja nastaje kao posljedica kronične upale. Ova studija je poduzeta kako bi odgovorila na ovu hipotezu.

cistanche je efikasan u liječenju bolesti bubrega

METODE

Studije na životinjama

Svi eksperimenti sa životinjama pridržavali su se Vodiča Nacionalnog instituta za zdravlje za njegu i korištenje laboratorijskih životinja i slijedili su protokole koje je odobrio Institucionalni komitet za njegu i korištenje životinja Univerziteta Ohajo. Divlji tip koji odgovara starosti (WT) ili mg53^-/-korišćeni su nelitermati soja 129S1/SvImJ22 da bi se utvrdila uloga MG53 u modulaciji fibroze bubrega izazvane unilateralnom opstrukcijom uretera (UUO) koja zavisi od starosti. C57B6/J miševi (9-10 sedmica) kupljeni su od Jackson Labs.

Za studije oštećenja bubrega, miševi (9-12 sedmica) su bili podvrgnuti UUO kako bi se izazvala fibroza bubrega. Miševi su anestezirani izofluranom (1,5 posto –2.0 posto) kako bi se osigurala duboka razina anestezije. UUO procedura je izvedena podvezivanjem lijevog uretera sa 5-0 hirurškom svilom dva puta prema objavljenim protokolima.38 Lažni miševi imali su samo rez na abdominalnoj koži. Da bi se procijenio učinak rhMG53 na opstruktivnu ozljedu bubrega, 1 grupa UUO miševa je primila rhMG53 (2 mg/kg) injekcijom u repnu venu počevši odmah nakon operacije UUO (dan 0), a zatim svakodnevno tokom 7 dana, sa 2 dodatne doze 9. i 11. dana. Kontrolna grupa UUO miševa primala je injekcije slane otopine prema istom rasporedu. Miševi su ubijeni 12. dana nakon operacije UUO, bubrezi su perfuzirani in situ fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom, a uzorci tkiva iz UUO bubrega i kontralateralnog bubrega sakupljeni su za histologiju i Western blot analizu.

U odvojenim studijama, WT i mg53^-/-miševi su podvrgnuti UUO ili lažnoj operaciji i ubijeni su 7. dana nakon operacije. MG53 je davan miševima koristeći pristup ćelijskoj terapiji.39 RAW 264.7 makrofagi su inficirani doksiciklin (DOX) zavisnim Ad tPA-MG53- virusnim česticama trešnje tokom 24 sata. Inficirane ćelije (u koncentraciji od {{10}} /100 ml fiziološke otopine po mišu) su ubrizgane u repnu venu mišu odmah nakon operacije (injekcija 0. dana). Miševi su primili 4 injekcije Ad-tPA-MG53 transduciranih RAW ćelija 0, 1, 3 i 6. Neposredno nakon injekcije ćelija 0, miševi su randomizirani u grupu koja je primala i grupu koja nije primila DOX (2 mg/ml u 5-postotnom rastvoru saharoze) u vodi za piće tokom 7 dana, a zatim ubijeni. Uzorci tkiva iz UUO bubrega i kontralateralnog bubrega prikupljeni su za histologiju, RNA i analizu proteina.

Statističke analize Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti -SD. Poređenje unutar grupa izvršeno je korištenjem Studentovog t-testa prilikom poređenja 2 eksperimentalna osnovna istraživanja H Li i saradnici: MG53 modulira NF-kB u fibrozi bubrega 2 Kidney International (2021) -, ---grupe i 1-analiza varijanse za više od 2 grupe (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) nakon čega slijedi ili Bonferroni ili Holm-Sidak test višestrukog poređenja ad hoc. Vrijednost P < 0,05="" smatrana="" je="" statistički="">

Dopunske metode Kompletne metode uključujući histološku procjenu, mjerenja kreatinina u serumu, plazmidne konstrukte, staničnu kulturu i izolaciju primarnih tubularnih epitelnih stanica, pripremu adenovirusa i ćelijsku infekciju, test nuklearne translokacije NF kB p65, imunohistokemiju i konfokalne slike, NF-kB reporter kao luciferazu enzimski imunosorbentni test, frakcioniranje tkiva, imunoblotiranje, koimunoprecipitacija, kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (dodatna tabela S1) i proizvodnja rhMG53 nalaze se u dopunskim metodama.

ekstrakt cistanche tubulosa: liječenje bolesti bubrega

REZULTATI

Miševi s ablacijom MG53 razvijaju fibrozu bubrega ovisno o dobi

Uporedili smo učinak starenja na funkciju bubrega i fibrozu u mg53^-/-i WT miševa. Potvrdili smo naše prethodno zapažanje da iako se nivoi kreatinina u serumu mladih miševa (2 mjeseca) sa i bez MG53 nisu značajno razlikovali, stariji (16-20 mjeseci) mg53-/-miševi su pokazali značajno veći serumski kreatinin nego kontrolne grupe WT iste dobi (Slika 1a). Na osnovu trihromskog bojenja, otkrili smo da je mg53-/-miševi su imali više fibroze bubrega u poređenju sa WT miševima, počevši od starosti od 5 mjeseci i nastavljajući do starosti od 20 mjeseci (Slike 1b i c). Imunohistohemijsko bojenje je korišteno za procjenu uticaja ablacije MG53 na infiltraciju leukocita, monocita i makrofaga u bubrezima miševa 2-mjesečnih i 5-mjesečnih (Slika 1d i e). Bubrezi mladih WT i mg53-/- miševa imali su slične nivoe intrarenalnih leukocita, ali je značajno više inflamatornih ćelija pronađeno u mg53/bubrezi nego WT bubrezi kod 5-mjesečnih miševa.

Štaviše, imunohistohemija za aktin glatkih mišića i fibronektin, 2 proteina ekstracelularnog matriksa koji se obično nalaze u područjima fibroze bubrega, pokazala je pojačano (3- do 8- puta) bojenje u glomerulima i tubulointersticijumu bubrega od { {4}}mjesečni mg53-/- miševi u poređenju sa 10-mjesečnim WT miševima (dodatna slika S1).

UUO izaziva pogoršanu upalu bubrega i fibrozu kod mg53-/- miševa Nivoi MG53 u bubrezima otkriveni imunoblotingom značajno su se povećali 7 dana nakon UUO (Slika 2a). Bubrezi mg53- /- UUO pokazali su pretjeranu fibrozu, sa 30 posto dodatnom površinom obojenom trihromom, nego bubrezi WT UUO (Slika 2b).

MG53 modulira NF-kB aktivaciju i p65 nuklearnu lokalizaciju

Aktivnost NF-kB (p65) procijenjena je u UUO modelu. Broj ukupnog p65 (t-p65) je značajno povećan u UUO bubrezima od WT i mg53 / miševa, ali je aktivacija NF-kB, procijenjena kao fosforilacija p65, bila veća (16- puta) u mg53 / UUO bubrega nego WT UUO bubrega (2- puta) u poređenju sa lažno operisanim životinjama (Slika 3a). Analizirali smo relativne nivoe RNK transformirajućeg faktora rasta b1 (TGF-b1), inhibitora aktivatora plazminogena-1 (PAI-1) i kolagena tipa I alfa 1 (Col1a1) u opstruiranom bubregu.40 Mi otkrivene niske razine ekspresije gena kod lažnih životinja i slična indukcija (TGF-b1, w10 puta; PAI-1, w40 puta; Col1a1, w40 puta) u UUO bubregu iz WT i mg53 / (Slika 3b). Da bi se ispitala prostorna distribucija MG53 u korteksu bubrega u normalnim uslovima, analizirane su frakcije bubrežnog tkiva. Redovno smo dobijali 10- puta više ukupnog proteina citosola od ukupnog ekstrahovanog nuklearnog proteina. Nivoi t-p65 bili su uporedivi u citosolnoj frakciji između WT i mg53-/- miševa, ali su bili veći u nuklearnoj frakciji od mg53-/- miševa (Slika 3c). MG53 je detektovan u frakciji citosola (sa tubulinom kao citosolnim markerom). Neočekivano, značajna količina MG53 je otkrivena u nuklearnoj frakciji (sa histonom H3 kao markerom nuklearne frakcije).

Da bismo potvrdili ovaj nalaz, također smo ispitali lokalizaciju MG53 u frakcijama skeletnih mišića (dodatna slika S2). Reproducirali smo naše prethodne studije u kojima se MG53 lokalizirao u citosolu i sarkolemskoj membrani (natrijum-kalijum adenozin trifosfataza kao marker membranske frakcije)22,23,25, ali smo također otkrili obogaćeni nuklearni MG53 iz skeletnih mišića.

MG53 stupa u interakciju sa p65 da kontroliše transkripcionu aktivnost izazvanu faktorom nekroze tumora-a. Da bismo potvrdili naše rezultate frakcionisanja tkiva, sproveli smo sledeće imunohistohemijske studije. U kultivisanim WT proksimalnim tubularnim epitelnim ćelijama, p65 je pronađen uglavnom u citosolu, ali lokalizovan na jezgrima u odsustvu MG53 (Slika 4a). Kada su ove ćelije tretirane LPS (5 mg) tokom 8 sati, lučenje proinflamatornih citokina bilo je značajno veće u mg53 / ćelijama nego u WT ćelijama (Slika 4b).

Budući da ovi podaci sugeriraju da MG53 može stupiti u interakciju sa p65 da reguliše ekspresiju inflamatornih citokina, direktna interakcija između p65 i MG53 procijenjena je koimunoprecipitacijskim testovima korištenjem HEK293 ćelija kotransficiranih sa Flag-p65 i HA-MG53. Pokazali smo slabu interakciju (slika 4c). Kotransfekcija plazmida GFP-p65 i RFP-MG53 i konfokalna analiza potvrdila je kolokalizaciju p65 i MG53 (slika 4d). Zatim smo kvantificirali da li MG53 utječe na aktivnost transkripcije NF-kB (p65) nakon TNF-stimulacije mjerenjem aktivnosti luciferaze iz stabilne NF-kB/293-GFP-Luc transkripcione reporterske ćelijske linije koja je bila prolazno transficirana bilo kojim pHM6 vektorom ili HA-MG53. Reporterske ćelije sadrže transduciranu ekspresiju lentivirusa, reporter luciferaze krijesnice, pokretan minimalnim promotorom citomegalovirusa u kombinaciji sa 4 kopije konsenzusnih NF-kB elemenata transkripcionog odgovora (kB mjesto) uzvodno. U nedostatku TNF-a, otkrivena je vrlo niska intrinzična aktivnost luciferaze u reporterskim stanicama koje eksprimiraju MG53 proteine. MG53 je potisnuo transkripcionu aktivnost NF-kB (p65) izazvanu TNF-a za oko 40 procenata (Slika 4e).

Prekomjerna ekspresija MG53 spriječila je nuklearnu translokaciju NF-kB p65 nakon tretmana TNF-a. NF-kB p65 translociran u jezgro nakon tretmana TNF-a u epitelu proksimalnog tubula bubrega.41 Istražiti može li tretman s MG53 umanjiti translokaciju NF-kB p65 jezgre nakon stimulacije TNF-a, prekomjerno smo eksprimirali MG53 u HKC-8 ćelijama ili putem DOX-zavisne Ad-tPA-MG53 virusne transdukcije ili kroz tretman sa rekombinantnim humanim MG53 (rhMG53). Koristeći MG{20}}specifično monoklonsko antitijelo, nakon indukcije zavisne od DOX-a, imunoblotiranjem je otkriven MG53. MG53 je bio prisutan na vrlo visokom nivou u Ad-tPA-MG53 transduciranim HKC-8 ćelijama,

ekvivalentno 1 ng rhMG53/mg ćelijskog lizata. Nasuprot tome, HKC-8 je preuzeo i eksprimirao mnogo manju količinu rhMG53 (Slika 5a). Unošenje FL fluorescentno označenog rhMG53 od strane HKC-8 potvrđeno je konfokalnom mikroskopijom (dodatna slika S3). Nakon tretmana TNF-a, vrijeme do vršne aktivacije p65 bilo je 15 do 30 minuta (slika 5b). U bazalnim uslovima, NF-kB p65 se nalazio uglavnom u citosolu, a prekomerna ekspresija MG53 to nije promenila (Slike 5c i d). Međutim, nakon stimulacije TNF-a, p65 se translocira u jezgra u HKC-8 ćelijama bez pretjerane ekspresije MG53. Za usporedbu, nuklearna translokacija p65 pala je za 33 posto (ćelije koje su dobile rhMG53) na 50 posto (transducirane ćelije koje su dobile DOX) u stanicama koje prekomjerno eksprimiraju MG53 (Slike 5c i d).

Adoptivni prijenos konstruiranih RAW ćelija u model UUOmouse izveden je sa 1 - 106 ćelijama primijenjenim injekcijom u repnu venu neposredno nakon operacije UUO. Miševi su nasumično podijeljeni u grupu koja je primala normalnu vodu za piće (-DOX) i grupu koja je primala DOX (2 mg/ml) u vodi za piće. UUO miševi su primali RAW svaki drugi dan za ukupno 4 injekcije. Bubrezi su uzeti 7 dana nakon operacije.

Miševi kojima je infuziran konstruirani RAW praćen indukcijom DOX-a pokazali su značajno smanjenu (za 30 posto) fibrozu bubrega u usporedbi s onima koji nisu primili ćelije ili onima kojima je infundirana konstruirana RAW stanica, ali bez indukcije Dox (66 posto fibroznog područja; slika 6a i b).

Samo je mala RAW/Ad-tPA-MG53 populacija preživjela nadzor retikuloendotelnog sistema do kraja eksperimenata. Imunohistohemijsko bojenje potvrdilo je da je ekspresija MG53 posredovana sa RAW-om izazvana DOX tretmanom u bubrezima (slika 6c). Zanimljivo je da su UUO bubrezi miševa sa infuzijom RAW-a i MG53 izazvanog DOX-om pokazali niži omjer p-65/t-p65 (za oko 40 posto) od onih koji ili nisu primali RAW ili onih koji su dobili RAW bez DOX-a (Slika 6d i e). Smanjeni nivo p-p65 potvrđen je imunohistohemijskim bojenjem bubrega p-p65 (S536) UUO bubrega (Slika 6f). Mislimo da bi cirkulirajući MG53 koji isporučuje Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX i unos od strane stanica proksimalnih tubula bubrega mogao sudjelovati u smanjenju p-p65 (S536) i smanjenju UUO upale bubrega. U poređenju sa bubrezima koji sadrže samo UUO, ekspresija TGF-b1, PAI- 1 i Col1a1 je značajno povećana u UUO bubrezima kod miševa kojima je davan RAW bez DOX-a (bez indukcije MG53). Povišenje ovih profibrotičkih gena može se pripisati indukciji snažne reakcije alografta iz infuziranih ćelija u imunokompetentne miševe. Međutim, UUO bubrezi miševa koji su dobili RAW i dobili DOX (indukcija MG53) pokazali su značajno niže (60 posto –72 posto smanjenje) PAI-1 i relativno niže nivoe TGF-b1 i Col1a1 od miševa bez tretmana DOX (Slika 6g).

Sistemska primjena rhMG53 ublažava aktivaciju NF-kB i razvoj fibroze kod miševa podvrgnutih UUO

Testirali smo da li rhMG53 pokazuje sličan antifibrotski efekat kao i ranije opisana konstruisana terapija RAW ćelijama. Naši prethodni farmakokinetički podaci ukazuju na kratko, cirkulirajuće poluvrijeme (oko 90 minuta kod glodara) rhMG53.42 Miševi su tolerirali kroničnu primjenu od 2 do 6 mg/kg

rhMG5326,37 dobro, pa je korištena strategija administracije prikazana na slici 7a. UUO miševima je nasumično davan ili nosač (fiziološka otopina) ili rhMG53 (2 mg/kg) dnevno tokom prvih 7 dana nakon operacije, a zatim svaki drugi dan sve dok nisu ubijeni 12. dana. Lažni i kontralateralni bubrezi su pokazali otprilike ekvivalentan t-p65 i nivoi ekspresije fibronektina, pri čemu su nivoi p-p65 blago povećani u kontralateralnim bubrezima u poređenju sa lažnim bubrezima. Nakon UUO, povećan je t-p65 bubrega. U poređenju sa životinjama koje su tretirane slanom otopinom, p-65/t-p65 omjer u UUO bubrezima životinja tretiranih rhMG53-smanjen je za oko 37 posto, dok je IkBa povećan za oko 27 posto (slika 7b i c). Dodatno, fibronektin se smanjio za oko 33 posto (Slike 7b i c). Imunohistohemijski je potvrđeno da je rhMG53 prisutan u UUO bubrezima nakon tretmana (Slika 7d). Ukupna fibroza je smanjena u rhMG53-liječenim UUO bubrezima (Slika 7e). Međutim, RNA ekspresija TGF-b1, PAI-1 i Col1a1 bila je slična kod miševa tretiranih fiziološkim rastvorom ili rhMG53 (Slika 7f).

cistanche je efikasan u liječenju bubrežne disfunkcije

DISKUSIJA

MG53 je TRIM protein obogaćen mišićima koji je prvobitno identificiran kao istaknuta komponenta mašinerije za popravku plazma membrane.22,26,42,43 Međutim, djelovanje MG53 nije ograničeno na skeletne mišiće, a MG53 se može pustiti u cirkulaciju kao miokin.32 Ranije smo pokazali da MG53 može kontrolisati upalu tokom oštećenja tkiva u udaljenim organima.27,29,33,35–37 Ovo istraživanje proširuje opseg zaštite organa posredovane MG{15}na bubrege. Zaključujemo da MG53 može ublažiti intrarenalnu upalu i fibrozu bubrega blokiranjem citokin-indukovane aktivacije proinflamatornog i profibrotičkog transkripcionog faktora NF-kB. Ovaj zaključak je zasnovan na sljedećim zapažanjima: (i) genetska delecija MG53 kod normalnih miševa.

rezultiralo je padom funkcije bubrega kako su miševi starili što je bilo praćeno povećanjem bubrežne fibroze i infiltracijom bubrega leukocitima i makrofagima; (ii) u modelu povrede bubrega UUO kod miševa, opstruirani bubrezi miševa s nedostatkom MG53- pokazali su više fibroze i upale nego MG53-punih miševa; (iii) Proizvodnja TNF-a i interleukina-6proksimalnih tubularnih epitelnih ćelija tretiranih LPS-om je oslabljena u prisustvu MG53; (iv) tretman ili prekomjerna ekspresija MG53 u proksimalnoj tubularnoj epitelnoj ćelijskoj liniji smanjila je aktivaciju NF-kB izazvanu TNFa blokiranjem nuklearne translokacije p65 komponente od-kB (nađeno je da se MG53 direktno vezuje za p65, iako slabo); i (v) fosforilacija p65, neophodan korak u aktivaciji NF-kB, smanjena je u opstruiranim bubrezima UUO miševa tretiranih rekombinantnim MG53 induciranim da prekomjerno ekspresira MG53 u makrofagima. Nadalje, inhibitor aktivacije NF-kB, IkBa, povećan je u opstruiranim bubrezima UUO miševa kojima je ubrizgan rekombinantni MG53.

Genetska delecija MG53 kod normalnih miševa je dozvolila štetne efekte starenja na bubrege. Ovo sugeriše da prisustvo endogenog MG53 pruža osnovni nivo zaštite tokom starenja. Slično, gubitak endogenog MG53 pogoršao je AKI zbog opstrukcije. UUO bubreg je akumulirao MG53, što vjerovatno odražava udaljenu aktivnost miokina iz skeletnih mišića. Ostaje nejasno kako se mišić MG53 može angažovati u bubregu tokom povrede; međutim, oštećeni bubreg često razvija hipoksiju i prolazi kroz oksidativni stres,^44,45signale koji bi mogli poslužiti za regrutovanje MG53. Ako je tako, ova osovina "mišić-bubrezi-imune ćelije" bi se mogla iskoristiti za ublažavanje oštećenja bubrega.46 Alternativno, ćelije bubrega zaista eksprimiraju niske nivoe MG53 na početku,²⁶i, tokom akutne ili hronične povrede, proizvodnja MG53 bi se mogla povećati.

NF-kB je istaknuti transkripcijski pokretač upale i fifibroze kod ozljede bubrega i starenja.^14,17,47,48Bili smo podstaknuti da istražimo da li se efekti MG53 mogu posredovati putem NF-kB jer je prisustvo MG53 u nuklearnom odjeljku bubrežnih homogenata sugeriralo potencijal za transkripcijske smetnje. Nuklearna lokalizacija MG53 nije bez presedana. U transgenskom modelu prekomjerne ekspresije MG53 miokarda, nuklearni MG53 je regulisao ekspresiju receptora alfa aktiviranog proliferatorom peroksizoma na nivou transkripcije i utjecao na metabolizam srčanih lipida.49 Štaviše, nedavno smo pokazali da rhMG53 potiskuje aktivaciju NF-kB kako bi ublažio srčanu insuficijenciju. kroz smanjenje proinflamatornih citokina, apoptoze i oksidativnog stresa u ostarjelim kardiomiocitima.³⁷

Molekularni mehanizam kako MG53 modulira nuklearnu/citoplazmatsku mobilizaciju p65 ostaje nejasan. MG53 ne sadrži signal nuklearne lokalizacije, ali sadrži 3 navodna N-terminalna nuklearna izvozna signala bogata leucinom, motiv koji prepoznaje nuklearni izvozni protein exportin.⁵⁰Direktna interakcija između MG53 i p65 bila je prilično slaba kao jedini ili glavni remetilački efekat MG53 na aktivaciju NF-kB. Iako se čini da MG53 utiče na dinamičko nukleocitoplazmatsko prebacivanje kritičnih komponenti NF-kB, tačni mehanizmi tek treba da se utvrde.

Čini se da je kritični ishod renoprotekcije posredovane MG{0} smanjenjem fibroznog remodeliranja kroz slabljenje upale posredovane NF-kB. Fifibroza bubrega je složen proces koji uključuje patološko taloženje različitih ECM proteina.51 Činilo se da MG53 ima jasne efekte na ECM protein fibronektin. Fibronektin se povećao u UUO bubrezima s nedostatkom MG53 i smanjen kod UUO miševa tretiranih MG53. Ekspresiju drugih ECM proteina u prisustvu i odsustvu MG53 je teže razumjeti. Prethodno smo pokazali da rhMG53 negativno reguliše TGF-b1/Smad signalizaciju i potiskuje sintezu ECM proteina u in vitro studiji.31 In vivo, transkripti TGF b1, PAI-1 i Col1a1 se nisu povećali u UUO bubrezima iz mg53 / životinje sa nedostatkom. Ovi transkripti su se smanjili kod UUO životinja izazvanih prekomjernom ekspresijom MG53 primjenom virusno induciranog miša

makrofaga, ali kada je dat rekombinantni MG53, nije uočen efekat. Ovo može jednostavno biti slučaj dovoljnog doziranja jer su postignuti intrarenalni nivoi MG53 bili daleko veći kod životinja s obzirom na vektor makrofaga za razliku od rekombinantnog MG53. Osim toga, nivoi proteina nisu mjereni, a post-transkripcijski događaji mogli bi modificirati ECM u UUO. Dalja istraživanja su potrebna da bi se razjasnila nova uloga MG53 u modulaciji specifičnih ECM proteina. Zaključno, ova studija je pokazala da miokin može pomoći u regulaciji početne upale u udaljenom organu kao što je bubreg i, u kontekstu ozljede bubrega, može pomoći u ublažavanju i kontroli upale. Slika 8 predstavlja radni model uloge MG53 u ponovnoj zaštiti. Tokom stimulacije molekularnih obrazaca povezanih s oštećenjem (DAMP, kao što je TNF-a) i molekularnih obrazaca povezanih s patogenom (PAMP, kao što je LPS) i ishemijskog stresa, NF-kB signalosom se aktivira u bubrezima. MG53 štiti bubreg tako što inhibira fosforilaciju i aktivaciju NF-kB signalizacije, stabilizira IkBa i smanjuje nuklearnu mobilizaciju p65, blokirajući aktivaciju proinflamatornih programa. Iako endogeni MG53 može posredovati u ovim efektima, predlažemo da se terapijski MG53 može pružiti robusnija zaštita, što je izvodljivo na osnovu sposobnosti egzogenog MG53 da smanji ozljede u UUO. Dalje istraživanje je opravdano kako bi se razumjelo kako se ovaj miokin može klinički iskoristiti.

Prednost cistanchea: štiti jetru i antifibrozu

OTKRIVANJE

JM ima udio u TRIM-edicine, Inc., koja razvija rhMG53 za liječenje ljudskih bolesti. Patenti o upotrebi MG53 poseduju Univerzitet Rutgers i Državni univerzitet Ohajo. Svi ostali autori su se izjasnili da nema suprotstavljenih interesa.

ZAHVALNICA

Ovaj rad su podržali Nacionalni instituti za zdravlje (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR i P-HL) i NIH R01-AG062896 (P-HL i BHR). Ovaj projekat je također djelimično podržan od strane intramuralLockwood fonda sa Državnog univerziteta Ohajo (P-HL) i nagrade Nacionalnog centra za unapređenje translacionih nauka (NCATS; P-HL, broj nagrade UL1TR002733). Sadržaj je isključivo odgovornost autora i ne predstavlja nužno zvanične stavove NCATS-a ili NIH-a.

DOPRINOSI AUTORA,

PD, P-HL, JM i BHR su osmislili i/ili dizajnirali studije; HL, PD, P-HL, ZL i XZ su sproveli eksperimente, prikupili podatke i izvršili analizu podataka; PD, P-HL i BHR su interpretirali rezultate; a P-HL i BHR su izradili, revidirali i odobrili rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačnu verziju.

DODATNI MATERIJAL

Dodatni fajl (PDF) Dopunske metode.

Tabela S1.Prajmer sekvence. Slika S1. mg53-/- miševi pokazuju poboljšano taloženje ECM proteina. Tkivo bubrega koje odgovara starosti (10 mjeseci) divljeg tipa (WT) i mg53- /- je obojeno 40 6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI; plava, lijevi paneli), a- aktin glatkih mišića (SMA; zeleni, drugi paneli), fibronektin (crveni, treći paneli) i spojeni (desni paneli). Šipka ¼ 25 mm. Kvantifikacija područja bubrežne fibroze (n ¼ 3 po grupi). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost -SD. Studentov t-test. ***P <>

Slika S2.Distribucija skeletnog mišića MG53 između jezgra i citoplazme. Skeletni mišići dobijeni od divljeg tipa (WT) ormg53-/- miševa su frakcionisani i imunoblotirani sa prilagođenim anti-MG53 antitijelom (3 mg lizata) i markerima ćelijskog odjeljka (20 mg lizata). Natrijum-kalijum adenozin trifosfataze se koriste kao marker ćelijske membrane, histon H3 kao nuklearni marker, a tubulin kao marker citosola.

Slika S3.HKC-8 ćelije proksimalnih tubula bubrega specifično preuzimaju AlexaFluor 647-obilježen rhMG53. rhMG53 (Trimedicine) i goveđi serumski albumin (BSA; ThermoFisher Scientific) označeni su Alexa Fluor(AF) kompletima za označavanje antitijela (Life Technologies) prema protokolu proizvođača. HKC-8 ćelije su uzgajane na Delta TPG posudi sa staklenim dnom (Bioptechs Inc.) u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) u prisustvu obilježenih proteina, BSA-AF647 (lijevo ) i rhMG53-AF647 (desno), 24 sata. Z-stack slike su snimljene sa LSM780 konfokalnog mikroskopa (Zeiss). Slike prikazuju ćelije na dnu posuđa. Šipka ¼ 25 mm.

Slika S4.Inženjering RAW ćelija za posredovanje inducibilne sekrecije MG53. (A) RAW ćelije su inficirane Ad-tPA-MG53 tokom 24 sata i tretirane bez (doksiciklin [Dox]) ili sa Doxom (þDox, 1 mg/ml) dodatnih 24 sata da bi se izazvala ekspresija tPA-MG53. Konfokalne slike su pokazale indukciju ekspresije MG53 (prilagođeno anti-MG53 antitijelo, crvene, donje ploče) iz RAW ćelija sličnih makrofagama (F4/80 bojenje, zeleno, gornji paneli). Šipke ¼ 25 mm. (B, C) Western blot analiza ćelijskih lizata (u količini od 0.6, 3 i 6 mg) za indukovanu ekspresiju tPA-MG53 i MG53 iz inficiranih RAW ćelija (B) i odgovarajuće kulture koncentrati medija (u zapreminama od 2, 5 i 10ml) (C). Različite količine rhMG53 (u količini od 0,2, 1, 0,05 i 0,025 ng) su ubačene kao standard. Mw, markeri molekularne težine.